《脓毒症标准化动物模型》征求意见稿

本文件规定了脓毒症（sepsis）动物模型制备原则、麻醉操作要求、制备方法、模型评价等技术要求。本文件适用于脓毒症啮齿类动物模型的制备和评价。2规范性引用文件下列文件中的内容通过本文件的规范性引用而成为本文件必不可少的条款。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求T/CALAS3实验动物健康监测总则3术语和定义下列术语及定义适用于本文件。脓毒症动物模型sepsisanimalmodel通过对动物进行内源性或外源性感染，使其能够模拟脓毒症的临床表现、发病过程、病理生理学变化、免疫学反应等特征的疾病动物。4制备原则4.1疾病再现最大化制备脓毒症动物模型时，最大程度的模拟人类脓毒症疾病临床表现、疾病过程、病理生理学变化、免疫学反应等疾病特征。4.2模型制备规范化脓毒症动物模型制备涉及动物品系、实验条件、操作程序、标本处理、数据采集、检测指标和结果分析等，模型重复性好，检测指标稳定，利于客观、真实的应用。4.3生物安全防护脓毒症动物模型制备在动物三级生物安全实验室按照GB19489-2008的要求进行。5麻醉操作要求5.1操作程序5.1.1实验动物麻醉前宜禁食8h-12h。5.1.2实验动物麻醉按表1所示方法进行。2表1实验动物麻醉方法动物种类麻醉剂选择麻醉剂量/（mg/kg）麻醉方式啮齿类动物小鼠三溴乙醇125-250腹腔注射戊巴比妥钠30-90腹腔注射大鼠戊巴比妥钠腹腔注射5.1.3麻醉后护理a）麻醉中可使用加热灯或加热毯等维持动物体温；b）麻醉中持续观察动物呼吸、体温等指标监测动物身体状态。5.2其他要求5.2.1麻醉不足时，需补充麻醉剂量，以动物没有肌张反射为准。5.2.2麻醉过度时，应立即对动物采取急救措施，如心脏按压等。6制备方法根据感染来源不同，可分为内源性及外源性感染模型。6.1内源性感染模型——盲肠结扎穿刺（CLP）6.1.1在腹部中线位置用手术刀切开皮肤，长约1-2cm，避免损伤下面的肌肉层和内脏。6.1.2用生理盐水湿润的纱布轻轻擦拭暴露的腹腔，以保持湿润并避免组织干燥。6.1.3仔细找到盲肠，通常位于右下腹。轻轻拉出盲肠，放置于无菌垫上以便操作。6.1.4选择适当的位置在盲肠上进行结扎，结扎位置通常在盲肠与回肠连接的三分之一或二分之一处。结扎的紧密度和位置会影响模型的严重程度和复制性。6.1.5使用无菌手术针在结扎下方的盲肠上进行穿刺，穿刺次数和针的大小会影响病理结果。（小鼠推荐使用21号针头；大鼠推荐使用18号针头）。6.1.6将盲肠放回腹腔内，在确保没有过多的盲肠内容物外溢的情况下闭合腹壁。6.1.7用吸收性或非吸收性缝合线闭合肌肉层和皮肤。6.1.8术后立即给予动物适当的镇痛药物，以及适量的温生理盐水（37°C；每100克体重5毫升）补液支持。6.2外源性感染模型6.2.1外源性毒血症模型通过静脉、腹腔等不同途径向动物体内输注脂多糖（LPS），根据剂量和方法不同，分为小剂量一次性输注（单次腹腔注射LPS1-10mg/kg）、小剂量持续输注（静脉缓慢输注LPS0.1-4ug/(kg·min)）和大剂量一次性输注（单次腹腔注射LPS50mg/kg）。6.2.2外源性菌血症模型不同细菌诱导脓毒症模型所用浓度不同，推荐浓度：铜绿假单胞菌为4×108CFU/ml，金黄色葡萄球菌悬液为3×108CFU/ml。大肠杆菌经为1.0×109CFU/kg，推荐注射量为300μL。7模型评价37.1一般症状观察脓毒症术后从动物外观、自主意识、自主活动、对刺激的反应、眼睛、呼吸频率和呼吸质量这七个方面（表1）观察并记录动物出现的症状，根据动物出现症状的情况，判断疾病发生的严重程度。即每项指标评分≥1分可认为造模成功。指标分数-描述外观0—光泽1—部分毛发竖毛2—背部全部毛发竖毛3—蓬松，凌乱4—憔悴0—活跃1—活跃，不直立2—活动减少迟缓，仍然行走3—挑衅后才活动，行动震颤4—挑衅后仍静止不动0—活动正常（摄食、饮水、攀爬、行走、打斗等）1—活动减少，只在笼底活动2—活动显著减少，静止，偶尔探索活动3—静止不动4—静止不动，颤抖对刺激的反应0—迅速反应1—对声音无反应或反应慢，对触碰反应强烈（马上逃离）2—对声音无反应，对触碰反应一般（走几步）3—对声音无反应，对触碰反应弱（不移动）4—对声音无反应，对触碰反应几乎无反应，推倒后不能翻身0—全开1—没有全开，可能有分泌2—半闭，可能有分泌3—没有全闭，可能有分泌4—闭合或者显著分泌物（浑浊）呼吸频率0—正常1—轻微减少（肉眼无法计数）2—中度减少（肉眼勉强能计数）3—显著减少（肉眼轻松计数，呼吸间隔0.5s）4—极度减少（呼吸间隔＞1s）呼吸质量0—正常1—间断性呼吸困难2—呼吸困难，不喘气3—呼吸困难，间断性喘气4—喘气7.2血生化检测4测定炎症指标、肝功能、肾功能、心肌酶等指标：白细胞计数、中性粒细胞百分比、淋巴细胞计数、血小板计数、C-反应蛋白、降钙素原、白介素1β、肿瘤坏死因子、白介素6、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、碱性磷酸酶、γ-谷氨酰转移酶、总胆红素、直接胆红素、总蛋白、白蛋白、总胆汁酸、胆碱酯酶、肌酐、尿酸、尿素、β2-微球蛋白、乳酸脱氢酶、肌酸激酶、肌酸激酶MB型同工酶等。7.3组织病理学检测7.3.1心脏：心肌肌纤维结构排列疏松，带状空泡化，细胞核肿胀，间质水肿、充血。7.3.2肝脏：肝有大量空泡脂肪样变性，肝细胞肿胀并有炎性细胞浸润。7.3.3肺：模型组肺间隔增厚，部分肺泡组织结构被破坏，炎症细