基因工程制药(部编)课件

基因工程制药2013-5-87基础知识

目录简介

地位，意义，优势发展简史

发展阶段，国内外研究进展步骤

流程，工具

实例

阿尔兹海默症2013-5-8前沿8

基因工程制药的地位-1生物技术

以生命科学为基础，利用生物体（或生物组织、细胞及其 组分）的特性和功能，设计构建具有预期性状的新物种或 新品系，并与工程相结合，利用这样的新物种（或品系） 进行加工生产，为社会提供商品和服务的一个综合性的技 术体系。

（食品，添加剂，化妆品，制药。。。。）生物技术制药

采用现代生物技术，按照人的设想，借助动植物微生物来 生产所需的医药品。

发酵，抗体制药，酶工程，动物/植物细胞工程，基因工程基因工程制药（geneticengineering

pharmaceutics）

利用基因重组技术将外源基因导入宿主菌或细胞，进行大 规模培养，以获得蛋白质药物的过程。2013-5-89

基因工程制药的地位-2生物技术

以生命科学为基础，利用生物体（或生物组织、细胞及其 组分）的特性和功能，设计构建具有预期性状的新物种或 新品系，并与工程相结合，利用这样的新物种（或品系） 进行加工生产，为社会提供商品和服务的一个综合性的技 术体系。基因工程、细胞工程、发酵工程、酶工程、生化工程

有意识地把一个生物体中有用的目的基因转入另一个生物 体中，使后者获得新的遗传性状或表达所需要的产物。基因工程制药（geneticengineering

pharmaceutics）

利用基因重组技术将外源基因导入宿主菌或细胞，进行大 规模培养，以获得蛋白质药物的过程。

（最上游的技术，占主导地位。）2013-5-810

基因工程制药的意义DNA重组技术出现以前，大多数人用蛋白质药物从血液、尿液和动物的组织和器官中提取

成本高，产率、产量低，供应有限，易被某些病原

体污染，存在不安全因素。

伦理道德（活熊取胆，蜈蚣）应用基因工程技术可十分方便且有效地解决上述提到的问题

从极端复杂的机体细胞内获取所需的基因，将其在

体外进行剪切、拼接，使其重新组合，然后转入适 当的细胞进行表达，从而生产出比原来多数百、数 千倍的相应的蛋白质

从量、质上都可以得到改进，且可以创造全新物质2013-5-811基因技术与传统技术比较5mg生长激素释放抑制因子传统技术：需要50万头的绵羊脑基因工程技术：9L细菌发酵液1ug白细胞干扰素传统技术：需要2L人血基因工程技术：1L基因工程菌发酵液可生产600ug10g胰岛素传统技术：需要450kg猪胰脏基因工程技术：200L细菌培养液

基因工程制药的优势最大的成就：

用于生物治疗的新型生物药物的研制。优点：

可大量生产过去难以获得的生理活性物质 可发现、改造内源性生理活性物质 可获得新型化合物，扩大药物筛选来源2013-5-813基因工程制药发展简史基因工程药物发展分为3个阶段:（一）细菌基因工程即把目的基因通过适当重组后导入如大 肠杆菌等微生物内构建工程菌，再通过 它们来表达目的基因。缺点：1、细菌为低等生物，构建好的哺乳动物乃至人类的基因导入细菌，往往不能表达、不能修饰（糖基化）2、即使表达了人类基因，往往没有生物活性或活性不高基因工程制药发展简史（二）细胞基因工程

把人或哺乳动物的基因直接导入哺乳动 物的细胞中，生产有生物活性的产品。优点：表达哺乳动物乃至人类的基因缺点：培养要求的条件苛刻，成本太高基因工程制药发展简史（三）转基因动物及转基因植物

将所需要的目的基因直接导入哺乳动物体内（鼠、兔、羊、牛、猪）或导入可食用植物体内（番茄，黄瓜，马铃薯），使目的基因在哺乳动物及可食性植物内表达，从而获得目的基因产品。具有柠檬味的西红柿曾培育出世界上第一只克隆羊“多利”的英国罗斯林研究所，

成功培育出世界上第一批能下“神奇鸡蛋”的小鸡。这种经过基因改造的小鸡所下的蛋能用来制造治疗癌症和其他疾病的药物。

这种法国品种鸡每年可下约300颗鸡蛋，经过基因改造后的鸡，其DNA中含有人为加入的人类基因，当母鸡生下蛋后，科学家就能从鸡蛋的蛋白中提取用来制造药物的蛋白质。

牛津生物医药公司的研究人员安德鲁-伍德表示：“从理论上来说，这种技术适用于不同种类的基因，因此这些母鸡也可以被用于制造许多不同的蛋白质。未来，这种技术有望用于治疗包括帕金森症、糖尿病和多种癌症在内的各种疾病。”

动物疫苗、生长激素等

例：从转基因羊的羊奶中提取出治疗心脏病的药物tPA2013-5-823基因工程药物的种类一、细胞因子类1、干扰素类：具有抗病毒活性的蛋白2、白细胞介素：IL-2，IL-3,IL-43、集落刺激因子类：促进造血细胞增殖和分化，GM-GCSF,G-CSF,M-CSF4、生长因子类：对不同细胞生长有促进作用的蛋白质5、趋化因子类：对噬中性粒细胞或特定的淋巴细胞等炎性细胞有趋化作用的一类小分子6、肿瘤坏死因子类：抑制肿瘤细胞生长、促进细胞凋亡的蛋白质二、激素类如胰岛素、生长激素、心素纳、人促肾上腺皮质 激素三、治疗心血管及血液疾病的活性蛋白类1、溶解血栓类尿激酶、链激酶、葡激酶、组织 型纤维蛋白溶酶原激活剂。2、凝血因子类3、生长因子类促红细胞生成素EPO，血小板生 成素TPO，血管内皮生长因子4、血液制品血红蛋白，白蛋白四、治疗和营养神经的活性蛋白类

神经生长因子，脑源性神经生长因子，睫状神经生长因子，神经营养素3，神经营养素4五、可溶性细胞因子受体类白细胞介素1受体、白细胞介素2受体、TNF受体、补体受体等六、导向毒素类1、细胞因子导向毒素2、单克隆抗体导向毒素●目前已研制成功约200多种基因工程药物和疫苗，其中销售较大的是红细胞生成素（EPO)、人胰岛素（insulin)等。●2009年，全球生物药物的销售额为1240亿USD,而小分子药物的市值为4110亿USD。●到2014年，全球小分子药物的市值仅为170亿USD,全球制药行业战略转移，越来越集中于生物药物的开发和研制。●到2014年，全球50强制药企业将会有36家出现在单抗、治疗性蛋白和疫苗市场中。我国生物技术制药现状和发展前景开始于20世纪70年代初，先是进行固定化酶的研究，以后固定化酶和固定化细胞的研究与应用得到发展70年代后期，开始跟踪国外基因工程技术的某些基础性工作80年代初期，开始乙型肝炎基因工程疫苗、基因工程干扰素的研究，生物技术方面的项目得到了国家的支持，其中-1b型干扰素为我国首创目前我国已批准12种基因工程药物和疫苗上市，在研究开发中的也有10余种。起步较晚，基础较差•目前我国生物制药技术申报貌似“活跃”，实际上都是在围绕仅有的几个老品种进行改进或改制，完全创新技术很少。•与发达国家相比，我国生物技术实验室技术差距不大，但在产业化方面与世界的差距正在逐渐加大：当今世界有20多种畅销生物药时，我国能生产10种；而现在世界上有140多种时，我国却只能生产20多种•由于我国医药生物技术成果缺乏自主知识产权，而目前我国生物制药公司中技术和产业发展比较成熟的也仅有北京天坛生物、深圳康泰生物、深圳科兴、长春金赛等少数几家企业，产业规模较小；而一些传统型的制药企业由于受技术条件等影响而难以迅速进入生物制药领域。

基因工程制药基本知识工具酶

限制性内切酶

DNA聚合酶

DNA连接酶载体

质粒

λ-噬菌体、黏粒、M13噬菌体、噬菌粒和病毒受体细胞2013-5-832限制酶的发现1978年诺贝尔生理医学奖

Werner

Arber

瑞士Biozentru m大學

1929年--

Daniel Nathans

美國霍普金斯大學醫學 院

1928年--

1999年

Hamilton

O.Smith

美國霍普金斯大學醫學 院

1931年--基因的剪刀——限制性内切酶

能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上，并切割双链DNA分布：主要在微生物中。特点：特异性，即识别特定核苷酸序列并切割特定切点。一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切割点上将DNA分子切断。目前已发现的限制酶有200多种。粘性末端：限制酶错位切断DNA双链而形成的具有彼此互补碱基的单链延伸末端。

平整末端：限制酶在同一位点平齐切断DNA两 条链而形成的双链末端。

同尾酶：来源各异的限制酶识别的靶子序列 各不相同，但都产生相同的粘性末端。2013-5-835•基因的针线——DNA连接酶DNA连接酶能够催化在两条DNA链之间形成磷酸二酯键，从而将两条DNA分子拼接起来3种情况：1.缺口DNA2.平末端DNA3.粘性末端DNA……GG……

生物A基因片段……GAATTC…………CTTAAG……

生物B基因片段……GAATTC…………GAATTC…………CTTAAG…………CTTAAG……

同一种EcoRⅠ酶切……GAATTC…………G

AATTC……AATTC…………CTTAAG…………CTTAA

……CTTAAG……

不同来源的DNA片段混合……GAATTC…………GAATTC…………CTTAAG…………CTTAAG……

将不同种来源的DNA片段连接起来DNA聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ1.5´3´的聚合酶活性2.5´3´的核酸外切酶活性3.3´5´的核酸外切酶活性间形成磷酸二酯键1)只能将单个核苷酸连

1)在两个DNA片段之接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯键

2)以一条DNA链为模板，2)将DNA双链上的两区别2将单个核苷酸通过磷酸

个缺口同时连接起来，

二酯键连接成一条互补不需要模板 的DNA链形成磷酸二酯键

把一个目的DNA片段通过重组DNA技术载送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具。载体的本质是DNA，能在宿主细胞中进行自我复制和表达。作用：将外源基因送入受体细胞。条件：（1）能在宿主细胞内复制并稳定地保存。（2）具有多个限制酶切点。（3）具有某些标记基因种类：质粒、噬菌体和动植物病毒。质粒载体质粒：是一些存在于微生物细胞内染色体外的小型闭合环状双链DNA分子，是能够进行独立复制并保持恒定遗传的复制子。质粒是基因工程中一类主要的克隆载体•

基因克隆常用的载体：质粒有标记基因的存在，可用含氨苄青霉素的有切割位点培养基鉴别 能复制并带着 插入的目的基 因一起复制质粒载体pUC质粒载体pBR322质粒载体pBR322的结构1.氨苄青霉素抗性基因（Ampr）2.四环素抗性基因（Tetr）3.DNA复制起点（ori）优越性具有更小的分子质量和更高的拷贝数适合于用组织化学方法检测重组体具有多克隆位点MCS区段噬菌体噬菌体：是“捕食”细菌的生物，是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的细菌病毒的总称。一旦离开了宿主细胞，噬菌体既不能生长，也不能复制。噬菌体侵染细胞三个阶段感染阶段增殖阶段成熟阶段T2噬菌体在37

℃下大约只需四十分就 可以产生100～300个子代噬菌体。噬菌体只含有蛋白质和DNA。常用的λ噬菌体载体1.λgt系列载体（1）λgt10载体（2）λgt11载体·基因的目的地——受体细胞大肠杆菌酵母棉花昆虫哺乳动物基因工程药物生产的技术定义：基因工程技术是指将重组对象的目的基因插入载体，拼接后转入新的宿主细胞，构建成工程菌（或细胞），实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达。

基因工程药物制造的一般流程：（1）获得目的基因；（2）组建重组质粒；（3）构建基因工程菌；（4）培养工程菌；（5）产物分离纯化；（6）除菌过滤；（7）半成品检定；（8）包装上游阶段

下游阶段上游：主要指的是目的基因分离、工程菌（或细胞）构建。上游阶段的工作主要在实验室内完成；下游：主要指的是从工程菌（或细胞）的大规模培养一直到产品的分离纯化、质量控制等，将实验室成果产业化、商品化.一、基因工程药物生产的上游技术上游技术：•获得目的基因•用限制性内切酶和连接酶将其插入适当的载体质粒或噬菌体中•转入大肠杆菌或其它宿主菌（细胞），以便大量复制目的基因。•选择基因表达系统主要考虑的是保证表达功能，其次要考虑的是表达量的多少和分离纯化的难易。(一)目的基因的获得

建立一个特定的基因无性繁殖体系—基因工程株，首先要获得该基因，并通过克隆扩增，这种基因即目的基因，对宿主细胞DNA而言，又称为外源基因或外源DNA。目的基因来源原核细胞：原核生物基因组较简单，较易获得目的基因真核细胞；对于真核细胞来源的目的基因，是不能直接进行分离的。真核细胞中单拷贝基因仅是染色体DNA中的很小一部分，即使多拷贝基因也是极少的，因此从染色体中分离纯化目的基因是很困难的。从真核细胞获得目的基因，方法较多，需根据目的基因的来源采取适当的方法。1、基因组文库将某种生物细胞的基因组DNA切割成一定大 小的片段，然后分割与合适的载体重组后 导入宿主细胞形成的2、cDNA文库

在真核细胞中，每个目的基因有对应的mRNA，从真核细胞中分离纯化出所有的mRNA，经反转录酶催化合成互补DNA，获得cDNA片段与适当载体重组，导入宿主细胞，构建出cDNA文库，从中筛选目的基因。3、PCR法如果已经知道目的基因的序列，就能用PCR

从基因组DNA或cDNA中获得目的基因，不 必经过复杂的DNA文库构建过程。4、化学合成法

随化学合成技术的发展，计算机控制的全自动核酸合成仪被广泛应用，按人们设计好的序列一次合成100-200bp长的DNA片段，用这些片段组合连接成完整的基因。

细胞内总DNA的提取分离与基因文库的构建细胞内总DNA的提取分离程序

基因文库的构建

将总DNA包含的基因组各片段分别克隆在质粒或噬菌体载体上，便构成了该生物的基因文库。

反转录人工合成互补DNA

构建基因文库获取目的基因存在的问题—费时费事内含子序列

反转录人工合成互补DNA方法的优势——

获取的DNA片段往往是具有特定功能的目的基因

聚合酶链式反应（PCR）

PCR技术就是在体外中通过酶促反应有选择地大量扩增（包括分离）一段目的基因的技术。

加入4种物质：（1）作为模板的DNA序列；（2）与被分离的目的基因两条链各自5’端序列相互补的DNA引物（20个左右碱基的短DNA单链）；（3）TaqDNA聚合酶；（4）dNTP（dATP,dTTP,dGTP和dCTP）。

聚合酶链式反应（PCR）变性、退火、延伸三步曲变性：双链DNA解链成为单链DNA退火：部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合延伸：以目的基因为模板，合成互补的新DNA链

聚合酶链式反应（PCR）每一轮聚合酶链式反应可使目的基因片段增加一倍

30轮循环可获得——230（1.07×109)个基因片段（二）重组DNA的构建1、目的基因进入宿主细胞必须有载体的运载才能实现。载体运载外源DNA至宿主细胞，是通过将外源DNA插入载体自身DNA的核酸序列中，再进入宿主细胞内DNA复制。在载体复制时，外源DNA分子也获得了复制和表达。目前DNA载体有质粒，噬菌体，柯斯质粒载体和病毒载体等。2、获得了目的基因，选择或构件适当的基因载体之

后，利用限制性内切酶和其他一些酶类，切割和 修饰载体DNA和目的基因，用T4DNA连接酶等将 他们连接起来，使目的基因插入可自我复制的载

体内，形成重组分子。

一般克隆基因的检查和鉴定方法酶切和电泳方法

琼脂糖凝胶电泳分离鉴定大小不等的酶解片段：磷酸基团带负电荷酶解片段向阳极移动电场驱动力和凝胶阻力——不同迁移率分子量标准参照物

DNA杂交直接鉴定

32P标记的DNA分子探针杂交放射自显影法（三）DNA重组体转入宿主菌DNA重组分子必须导入受体细胞中才能使外

源目的基因得以大量扩增或表达。受体细 胞有原核受体细胞、酵母菌、动物细胞和

昆虫细胞等。（四）、重组子的筛选与鉴定1、在重组DNA分子的转化、转导过程中，并

非所有的细胞都能被导入重组DNA分子， 一般只有少数重组DNA分子能进入受体细 胞，也只有极少数的受体细胞在吸纳重组

DNA分子后能良好增殖，所以必须将被转

化的细胞从大量受体细胞中筛选出来。2、粗筛出的阳性重组子只能说明载体中有外

源DNA插入，但插入的外源DNA是否就是目 的基因需要作进一步的鉴定。

遗传转化常用的方法

载体法转化——农杆菌介导法

基因的直接转移（1）高压电脉冲电激穿孔（2）基因枪法（3）微注射法转化子的分析——Southern杂交

纪念发明者EdwardSouthern（1）提取总DNA（2）酶解（3）电泳（4）转移到滤膜（5）变性解链（6）DNA探针及杂交（7）洗脱（8）放射自显影（9）比较分析

Southern杂交分析示例A.DNA体外重组实验B.

抗生素筛选转化子细胞C.

培养突变株细胞

D.Southern杂交实验结果显示，外源目的基因已经转入突变株细胞中

1973年，由美国斯坦福大学教授Cohn和美国加州大学教授Boyer带领各自的研究组几乎同时分别完成了DNA体外重组，一举打开了基因工程学大门。（五）、重组体在宿主细胞中的表达、调控及检测1、基因表达是指基因携带的遗传信息，经过极其复杂的生物化学反应，最终产生具有生物功能的蛋白质的过程，即DNA-RNA-蛋白质。基因表达有两类宿主细胞：原核细胞：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌，链霉菌；真核细胞：酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞等。2、基因调控：基因的表达、合成功能蛋白都依赖于

基因的有效转录和mRNA的正确翻译和翻译后的 加工，这些过程任何一个环节不能正确进行，均

可导致表达失败，基因表达的调节包括：

1）转录水平的控制2）转录产物的加工调节3）mRNA从细胞核向细胞质运输过程中的调节4）mRNA降解的调节5）翻译水平的调节6）翻译后的加工、修饰3、调节与检测

携带外源目的基因的重组真核细胞表达载体在哺乳动物中的表达情况，需要用适当的检测方法才能做出正确判断：直接用抗体进行免疫组织化学的检测；用荧光标记的抗体进行免疫荧光检测；将放射性同位素标记的氨基酸掺入到蛋白质中，用免疫沉淀法检测。二、基因工程药物生产的下游技术下游技术：实验室成果产业化、商品化，

•

工程菌大规模发酵最佳参数的确立（正交，神经网络，响应面）•新型生物反应器的研制•高效分离介质及装置的开发•分离纯化的优化控制•高纯度纯品的制备技术•生物传感器等一系列仪器仪表的设计和制造•电子计算机的优化控制等二、基因工程药物生产的下游技术工程菌的发酵工艺不同于传统的抗生素和氨基酸发酵，需要对影响目的基因表达的因素进行分析，对各种影响因素进行优化，建立适于目的基因高效表达的发酵工艺，同时建立一系列相应的分离纯化、质量控制、产品保存等技术（一）、基因工程菌的种类和特性基因工程菌是以微生物为操作对象，通过基因工程技术获得表达外源基因以及过量表达或抑制自身基因的工程生物，主要包括1、原核细胞（1）大肠杆菌：目前采用最多的原核表达体系。（2）枯草芽孢杆菌（3）链霉菌2、真核细胞（1）酵母：酿酒酵母，毕赤酵母应用广泛。（2）丝状真菌1、大肠杆菌系统是最简单的原核细胞生物，是单细胞生物，分 裂方式是裂殖，37℃下，17min繁殖一代，是 目前基因工程研究中采用最多的原核表达体系。大肠杆菌表达基因工程产物的形式：细胞不溶 性表达（包含体？lysozyme）、细胞内可溶性 表达、细胞周质表达等，极少数情况下还可分 泌到细胞外表达。不同的表达形式具有不同的 表达水平，且杂质的含量和种类也会变化。2、枯草芽孢杆菌系统

属革兰氏阳性菌，能形成芽孢的单细胞生物，分裂方式是裂殖，分泌能力强，可以将蛋白质产物直接分泌到培养液中，不形成包含体。该菌也不能使蛋白质产物糖基化，另外由于它有很强的胞外蛋白酶，会对产物进行不同程度的降解，因此在外源基因克隆表达的应用中受到影响。与大肠杆菌相比，优点：1、不产生内毒素；2、大多种类对人畜无致病性；3、分泌功能强大；4、产物分泌到胞外进入营养液，简化了后续提取纯化工艺。缺点：1、蛋白酶分泌不稳定；2、质粒不稳定；3、蛋白酶分泌量大，种类多，易降解目标产物。3、链霉菌系统是放线菌中一类重要的丝状多核单细胞原核微生物， 是生产抗生素的重要的工业微生物，近年来作为 外源基因表达体系正日益受到人们的重视。其主要特点是：不致病、使用安全，分泌能力强， 可将表达产物直接分泌到培养液中，具有糖基化 能力，变铅青链霉菌限制修饰能力弱，可以作为 理想的受体菌。现已构建了一系列有效的载体， 下游培养工艺也已经成熟。4、酵母系统

是最简单的单核单细胞微生物，无性繁殖以芽殖和裂殖为主，有性繁殖方式产生子囊孢子，安全无毒，培养方式简单，大规模培养技术成熟，大多数情况下，可像大肠杆菌一样进行生物技术和遗传操作。酿酒酵母，毕赤酵母，lipase5、丝状真菌系统是有菌丝体的真核细胞微生物，以腐生和寄 生方式生存，丝状真菌表达系统已成功表 达了外源蛋白质，近年来，已在约30种以 上丝状真菌中建立了DNA转化系统，其特点是：有很强的蛋白分泌能力；能正确 进行翻译后加工，包括肽剪切和糖基化等， 而且其糖基化方式与高等真核生物相似； 丝状真菌（如曲霉等）等又确认是安全菌 株，有成熟的发酵和后处理工艺。（二）基因工程菌的发酵工艺控制应用基因工程技术生产药物，必须构建一个特定的目的基因无性繁殖体系，即构建基因工程菌株。与传统微生物培养不同，基因工程菌培养的难题是如何维持质粒的稳定性，发酵工艺的控制对表达至关重要。不同的发酵条件会影响基因工程菌的代谢途径，对分离纯化也有影响，所以必须充分考虑影响外源基因表达的各种因素。基因工程菌的发酵工艺流程基因工程菌→摇瓶培养→初步确定工程菌的

生长条件→发酵罐放大培养→确定最佳工艺

参数（遗传算法，神经网络，响应面法）基因工程菌的培养过程主要包括：（1）通过摇瓶操作了解工程菌生长的基础条件，如温度、pH、培养基各种组分以及碳氮比，分析表达产物的合成、积累对受体细胞的影响；（2）通过培养罐操作确定培养参数和控制的方案以及顺序。1、基因工程发酵菌的培养基组成1）碳源

是第一营养要素，为正常生理活动提供能量来源，也为细胞物质和代谢产物的合成提供碳骨架（糖，核酸，蛋白质，脂类）。

基因工程菌可利用的碳源有糖类、有机酸、脂类和蛋白质，常用碳源有葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等。2）氮源氨基酸，碱基常用的氮源有酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白水解 产物、玉米浆和氨水、硫酸铵、硝酸铵、氯化

铵等3）无机盐为基因工程菌提供必需的矿物质，对代谢具有 重要的调节作用，包括磷、硫、钾、钙、镁、 钠等大量元素和铁、铜、锌、锰等微量元素。4）生长因子指细胞代谢必需的微量有机物，不起碳源和氮 源作用，包括维生素、氨基酸、嘌呤或嘧啶及

其衍生物、脂肪酸等，起辅酶和辅基作用。5）选择剂、诱导物2、基因工程菌的发酵条件控制1）、接种量接种量是指移入的种子液体和培养液体积的比例。接种量小，不利于外源基因的表达，大接种量有利于对基质的利用，缩短生长延迟期，并使生产菌能迅速占领整个培养环境，减少污染机会，但接种量过高菌体会生长过快，代谢产物积累过多，又会抑制后期菌体的生长。2）温度温度的高低直接关系到细胞的酶活性和生化反应速率、培养 液中的氧溶解和传质速率、菌体的生长速率和产物的合成速

率，从而影响发酵动力学和产物的生物合成。

在复制水平上，可通过调控复制，改变基因拷贝数，影响基因表达；

在转录水平上，可通过影响RNA聚合酶的作用或修饰RNA聚合酶，来调控基因表达；

在mRNA讲降解和翻译水平上影响基因表达，

通过细胞内小分子调节分子的量而影响基因表达，

影响蛋白质的活性和包含体的形成。3）溶解氧溶解氧是工程菌发酵培养过程中影响菌体代谢的一个重要参数，对菌体的生长和产物的生成影响很大。外源基因的高效表达和翻译需要维持较高水平的DO2值。通常采用调节搅拌转速的方法，可以改善培养过程中的氧供给，提高活菌产量，也可增加通气量以提高氧的传递。4）pHpH直接影响细胞膜和营养物质的电荷状态，也

影响胞外酶的活性，从而改变细胞对营养物质 的吸收和转运，进而影响菌体生长和产物的稳 定性。所以应根据工程菌的生长和代谢情况，

对pH进行适当的调节。3、基因工程菌发酵培养的操作方式1、分批式操作又称间歇式操作，把菌体和培养液一次性装入 发酵罐，在最佳条件下进行发酵培养。发酵结 束时，将全部培养物取出，再进行下一次分批

操作。传统方法2、半连续式操作菌种和培养液一次加入发酵罐，在菌体生长过 程中，每隔一定时间，取出部分发酵液，同时 补充同等数量的培养基，然后继续培养，直至

发酵结束，取出全部发酵液。根据菌体生长曲线而来3、流加式操作又称补料-分批式操作，指在分批操方式的基础上，连续不断补充新培养基，但不取出培养基，整个发酵体积与分批操作相比是不断增加的。4、连续式操作指菌体和培养液一起装入发酵罐，在菌体培养过 程中，不断补充新培养基，同时取出培养液和 菌体在内的发酵液，发酵体积和菌体浓度维持

不变，使菌体处在稳定的生长条件下三、基因工程药物的分离纯化分离纯化是基因工程药物生产中极其重要的一环，费用占整个生产费用的80%以上，建立分离纯化的依据有以下几点：0、活性1、含目的产物的起始物料的特点2、物料中杂质的种类和性质药用，R&D纯度尽量高，但要保证无毒3、目的产物的特性荷电性质，疏水性，分子量，亲和性。。。4、产品质量的要求

活性，毒性，重复性分离纯化的基本过程细胞破碎、固液分离、浓缩与初步纯化、高度纯化直至得到纯品以及成品加工。分离纯化应遵循的基本原则

1、具有良好的稳定性与重复性

2、尽可能减少组成工艺的步骤（金属螯合）

3、各步骤和技术之间能相互适应和协调，

工

艺与设备能相互适应（疏水色谱，SEC）

4、尽可能少用试剂（试剂本身需要去除）

5、所用时间尽可能短

6、工艺和技术必须高效、收率高，易操作

7、具有较高的安全性各种不同表达形式的基因工程药物常采用的分离、纯化方法1、细胞内不溶性表达产物—包涵体的分离纯化包含体：目的蛋白以不溶性形式产生并聚集形成

蛋白质聚合物纯化步骤：•细菌收集与破碎（离心，沉淀）•→包含体分离、洗涤与溶解（8MUrea，6M

GuanidineHCl）•

→变性蛋白质的纯化（透析，电泳，超滤、色谱等）•→重组蛋白质的复性（稀释复性，分子伴侣）•→天然蛋白质的分离（IEC，SEC等）2、分泌型表达产物的分离纯化分泌型表达产物的发酵液体积大，浓度低，必 需在纯化前浓缩，可用沉淀和超滤方法浓缩。3、大肠杆菌细胞内可溶性表达产物的分离纯化首选亲和分离法，也可选用离子交换色谱4、大肠杆菌细胞周质表达蛋白的分离纯化选择分离纯化方法的依据1、根据产物表达形式来选择包涵体，蛋白，胞内，胞外2、根据分离单元之间的衔接选择IEC，SEC3、根据分离纯化工艺的要求来选择纯度、活性等4、目标产品的质量控制基因工程药物质量控制主要包括以下几项要求：产品的鉴别、纯度、活性、安全性、稳定性和一致性。（1）产品的鉴别（2）纯度分析纯度分析是基因工程药物质量控制的关键项目，它包括目的蛋白质含量测定和杂质限量分析两个方面的内容。（3）生物活性测定需要进行动物体内试验（老鼠，兔子，狗）

和通过细胞培养（PC12cell

line）进行体外效价测定。（4）稳定性考察确定药品贮藏条件和使用期限的主要依据（5）产品一致性的保证基因工程药物生产实例一、干扰素α2b的制备工艺

干扰素是人体细胞分泌的的一种活性蛋白质，具有广谱抗病毒、抗肿瘤和免疫调节活性，是人体防御系统的重要组成部分。

1989年第一个基因工程药物干扰素批准上市。α1b型基因工程干扰素是由我国自行研制开发的具有国际先进水平的生物高科技成果，于1997年通过Ⅲ期临床，并获得国家一类新药证书，成为“863”计划生物技术领域第一个实现产业化的基因工程药物。

干扰素根据分子结构和抗原性的差异分为α、β、