基因工程实验课

基因工程实验课（2）基因工程流程第一次课程：质粒的转化重组菌的筛选挑取单克隆培养第二次课程：质粒的提取质粒的浓度测定质粒的电泳质粒的酶切基因工程实验报告重要数据挑单克隆后进行液体培养的培养物；RFP重组菌液在IPTG/AmpLB平板上画图案；质粒转实验化中涂平板后的培养结果；琼糖脂凝胶电泳图谱；DNA浓度测定表。第二次课程：1.质粒的酶切2.质粒的提取3.质粒的电泳4.质粒的浓度测定第二次课程：1.质粒的酶切2.质粒的提取3.质粒的电泳4.质粒的浓度测定DNA的限制性内切酶鉴定EcoRIBamHIEcoRI质粒的限制性内切酶鉴定质粒BamHIMarkerEcoRI+BamHI质粒可能有3种构型及迁移率：1.共价闭合环状质粒，最快；2.线状质粒DNA，次之；3.开环质粒DNA，最慢。酶贮存液特别注意:[1]吸取准确体积的酶；[2]甘油粘稠！3-9是影响限制酶活性的重要因素。缓冲液(Buffer)缓冲液的化学组成MgCl2、NaCl/KCl：提供Mg2+和离子强度；Tris-HCl：维持pH；二硫苏糖醇（DTT）：保持酶稳定性；牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的稳定；商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。组分

体积

RFP质粒

(~500ng)5

l10xbufferK2

lEcoRI1.5

lBamHI1.5

lH2O10

l表1：酶切反应体系酶切反应体系充分混匀，37℃1~2小时，加入2.5

l10xLoadingbuffer终止酶切，进行1%Agarose电泳检测。特别注意:[1]吸取准确体积的酶；[2]甘油粘稠！第二次课程：1.质粒的酶切2.质粒的提取3.质粒的电泳4.质粒的浓度测定质粒的提取——碱裂解法SolutionI:250

l，重悬菌体SolutionII:250

l，裂解(NaOH/SDS)SolutionIII：350

l，中和（醋酸钾）ElutionBuffe：

50

l，洗脱质粒观看视频…第二次课程：1.质粒的酶切2.质粒的提取3.质粒的电泳4.质粒的浓度测定3-153-16琼脂糖凝胶电泳1.琼脂糖(Agarose)2.琼脂糖凝胶琼脂糖在水里（或电泳液）中加热到沸点后溶解，冷却后又凝固成均匀的的胶体“胨”。是一种线性多糖聚合物，从海藻产物琼脂中提取而来。琼脂糖的浓度决定凝胶的空隙（密度）。浓度高空隙小琼脂粉(Agar)3-173-18琼脂糖的浓度（%）分离DNA的片断大小（bp）0.30.71.450000—100020000—10006000—300空隙小，分辨率高：小分子较易通过，而大分子难通过；空隙大，分辨率低：大小分子几乎以同等速率通过。3.琼脂糖凝胶的分辨力空隙大小决定其分辨分子大小的能力。3-19优点是比琼脂糖凝胶的分辨率高的多。聚丙烯酰胺凝胶浓度（%）分离DNA片断大小（bp）4.010.020.01000—100500—2550—1聚丙烯酰胺凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳：1000—50000bp聚丙烯酰胺凝胶电泳：1—1000bp3-20凝胶染色1.染料溴化乙锭。Ethidiumbromide（EB）强致癌剂！！！佩戴手套，特别小心！3-21EB是扁平分子，能插入DNA碱基之间，但不与琼脂糖结合。EB在300nm紫外光照射下能发红色荧光，即可显示DNA泳带在凝胶中所处的位置。荧光强度与DNA含量及大小成正比。2.原理3-22UVP全自动凝胶成像分析系统3-23标准分子量DNAmarker3-24

DNA琼脂糖凝胶电泳图谱（举例）观看视频…3-26配置1%的agrose（1）称取0.3g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入30mLTAE，置微波炉或水浴加热至完全溶化，取出摇匀；（2）有机玻璃内槽放置于一水平位置，并放好样品梳子；（3）向冷到60℃左右的琼脂糖凝胶液中加入1.5μl溴化乙锭(EB)试剂，(注意不要形成气泡)；待胶凝固后，取出梳子，并放在电泳槽内，加人电泳缓冲液至电泳槽中；准备上样电泳。质粒的电泳上样顺序质粒MarkerEcoRI+BamHIMarker:5μl质粒：400ng酶切产物：20μl注意：质粒要加入2-3

l10xLoadingbuffer，混匀后再上样第二次课程：1.质粒的酶切2.质粒的提取3.质粒的电泳4.质粒的浓度测定核酸在波长260nm

处有强烈的吸收，是由碱基的共轭双键所决定的。这一特性常用作核酸的定性和定量分析。核酸分子具有强烈的紫外吸收DNA或RNA的定量A260=1.0相当于50μg/ml双链DNA(dsDNA)40μg