T-SPPHN 005-2024 2.0 亿CFUmL沼泽红假单胞菌PSB-S悬浮剂

ICS01.040.65CCSB15/19RhodopseudomonaspalustrisPSB-S2.0×108CFU/mLSC湖南省植物保护学会发布I本文件是根据GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件由湖南省植物保护学会提出。本文件由湖南省植物保护学会归口。本文件起草单位为：长沙艾格里生物科技有限公司、湖南省植物保护研究所、湖南新长山农业发展股份有限公司。本文件主要起草人：刘勇、张德咏、周波、戴建平、史晓斌、张松柏、苏品、张建华。12.0亿CFU/mL沼泽红假单胞菌PSB-S本标准规定了2.0亿CFU/mL沼泽红假单胞菌PSB-S悬浮剂的要求、试验方法、检验规则、标志、包装、贮运、安全和保证期。本标准适用于以沼泽红假单胞菌活菌体加工而成的悬浮剂。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T1601农药pH值的测定方法GB/T1604商品农药验收规则GB/T1605-2001商品农药采样方法GB/T3796农药包装通则GB/T4789.28食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法GB/T8170数值修约规则与极限数值的表示和判定GB/T28136-2011农药水不溶物测定方法GB/T14825-2006农药悬浮率测定方法GB/T31737-2015农药倾倒性测定方法GB/T28137-2011农药持久起泡性测定方法GB/T16150-1995农药粉剂、可湿性粉剂细度测定方法3要求3.1组成与外观本品为红色液体，有轻微臭味，存放过程中可能出现轻微沉淀，但经摇匀后应恢复原状。3.2产品技术指标应符合表1的要求2表12.0亿CFU/mL沼泽红假单胞菌PSB-S悬浮剂控制项目指标有效活菌数∕CFU/mL≥水不溶物质量分数∕(%)≤6.5～8.5悬浮率（有效成分）/（%）≥持久起泡性（1min后泡沫量）/mL≤低温稳定性注：低温稳定性、热贮稳定性实验，在正常生产时每3个月至少进行一次。4试验方法防控措施4.1一般规定本标准所有试剂和水在没有注明其他要求时，均指分析纯试剂和GB/T6682-2008中规定的三级水。检验结果的判定按GB/T8170中的4.3.3修约比较法进行。4.2抽样按照GB/T1605-2001中“液体制剂采样”方法进行，用随机数表法确定抽样的包装件数，最终抽样量不少于200mL。4.3有效活菌数与杂菌率的测定有效活菌数采用最大可能数计数法（MPN）测定；杂菌数采用平板菌落计数法测定，测出杂菌数（包括细菌和霉菌）后，再按照杂菌率的计算方式进行计算。4.3.1试剂和溶液无菌水；光合细菌的双层培养基：遵照附录D的规定；有效活菌数测定用培养基：遵照附录D的规定；杂菌数测定用培养基：细菌培养基按GB/T4789.28-2003中4.8规定，霉菌培养基遵照附录D的规4.3.2试验仪器手持扩大镜（10倍）；3V8漩涡混合器（转速范围：200～3000rpm/min，无级调速）；ECC-150A恒温培养箱[控温范围：RT+5～80℃,温度显示精度：0.1℃,控温精度：±0.1℃,控温均匀度：±0.5℃(37℃时)]；EOF-150A恒温烘箱[控温范围：RT+10～220℃,温度显示精度：0.1℃,控温精度：±1℃,控温均匀度：±1.5℃(150℃时)]；高压蒸汽消毒器；灭菌的培养皿：直径9cm；灭菌的螺口试管；灭菌的锥形瓶；灭菌的玻璃刮刀；灭菌的0.5mL、l.0mL、15mL吸管。4.3.3菌株鉴别根据代表菌株的形态学和生理生化特征进行菌种鉴别，并可辅助结合16SrDNA基因序列分析等手段。当对鉴别结果有争议或者需要进行法律仲裁检验时，应到具有菌株鉴定资质的单位，将待检菌株与模式菌株进行比对，出具菌种鉴定报告，作为仲裁依据。有效成分的特征参见附录A。菌种鉴别方法参见附录B。16SrDNA基因序列分析进行菌种鉴别参见附录C。4.3.4有效活菌数的测定采用平板菌落计数法（A）或最大可能数法（MPN法）（B）测定有效活菌数量。A.平板菌落计数法（1）仪器设备：9cm灭菌培养皿30个、移液枪1mL、10mL、灭菌枪头、涂布棒、超净工作台、2mL灭菌离心管10个、封口膜或保鲜膜。（2）光合细菌双层平板培养基参见附录D。（3）操作步骤:1）菌液稀释将菌液用无菌水于2mL离心管中逐级稀释为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、1等十个浓度，分别做好标记。2）培养基的配置按要求分别配置上层和下层培养基，灭菌备用。3）倒下层培养基融化下层培养基，倒平板（约33mL/板）超净工作台中冷却待用。4）涂菌按无菌操作要求，用移液枪吸取100μL菌液到冷却凝固的下层培养基上，用涂布棒涂抹均匀。5）倒上层培养基融化上层培养基，待融化的上层培养基冷却至50℃左右时，将其倒入已涂菌的下层培养基上,超净工作台中冷却至室温。46）用封口膜或保鲜膜将培养皿密封7）放置于30±1℃的恒温培养室，在2500lx～3000lx的白炽灯下光照培养7d～10d，倒置培养。注：每个浓度重复三次。（4）活菌数的计算方法可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（colony－formingunits，CFU）表示。选取菌落数在30CFU～300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。若三个稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落乘以稀释倍数。若三个稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落乘以稀释倍数。若三个稀释度的平均菌落数均不在30～300之间，则以最接近300或30的平均菌落乘以稀释倍数。B.最大可能数（MPN）法（1）试验仪器：10mL螺口试管20个、灭菌、试管架、移液枪10mL或5mL、1mL、灭菌枪头、超净工作台、封口膜或保鲜膜。（2）光合细菌培养基配方：有效活菌数测定用培养基，配方参见附录D。（3）操作步骤:选取10-8、10-9、10-10三个浓度梯度的稀释液做测定用。取20支装有9mL培养基的灭菌螺口试管，分别按3管一组标记为10-8、10-9、10-10、CK。用1mL灭菌枪头按无菌操作要求吸取每个浓度梯度的稀释液各1mL放入对应编号的试管中，拧好试管盖。标记为CK的3支试管加入灭菌水1mL做对照。放置于30±1℃的恒温培养室，在2500lx～3000lx的白炽灯下光照培养7d～10d，统计每个浓度下三支试管整支变红的管数，将变红管数在三个浓度下的分布形式对应到MPN表（见附录E获得相应的MPN数值，MPN值×107即为样品中有效活菌数浓度。4.3.5杂菌率的测定4.3.5.1细菌数的测定与计算方法(1)细菌数的测定选取10-5、10-6、10-7三个浓度梯度的稀释液，用0.5mL无菌吸管吸取0.1mL，分别加至含有15mL营养肉汤培养基的培养皿(直径为9cm)表面，用无菌玻璃刮刀将稀释液均匀涂布，待菌液全部渗入培养基后，放置于36±1℃的恒温培养箱内倒置培养48±2h。每一浓度重复三次，同时设置加无菌水的空白对照。用肉眼计数菌落，必要时可借助手持放大倍数为10倍的扩大镜。(2)细菌数的计算方法以平板上出现30～300个菌落数的稀释度平板为计数标准。当只有一个稀释度，其平均菌落数在30～300之间时，则以该平均菌落数乘以其稀释度倍数。若有两个稀释度，其平均菌落数均在30～300之间时，应按两者菌落总数之比值来决定。若其比例小于2应计数两者的平均数。若大于2则计数其中稀释较小的菌落总数。若三个稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落乘以稀释倍数。若三个稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落乘以稀释倍数。若三个稀稀度的平均菌落数均不在30～300之间，则以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数。54.3.5.2霉菌数的测定与计算方法(1)霉菌数的测定选取10-5、10-6、10-7三个浓度梯度的稀释液，用0.5mL无菌吸管吸取0.1mL，分别加至含有15mL马丁培养基的培养皿表面，用无菌玻璃刮刀将稀释液均匀涂布，待菌液全部渗入培养基后，放置于25℃~28℃的恒温培养箱内，3d后开始观察，共培养观察5d。每一浓度重复三次，同时设置加无菌水的空白对照。用肉眼计数菌落，必要时可借助手持放大倍数为10倍的扩大镜。(2)霉菌的计算方法通常选择菌落数在10～150之间的平皿进行计数，同稀释度的2个平皿的菌落平均数乘以稀释倍数，即为每毫升检样中所含的霉菌数。4.3.5.3杂菌率的计算方法菌剂含杂菌率(X)按下式计算：式中：X——杂菌率，%；Z1——杂菌数(包括细菌和霉菌)，CFU/mL；Z2——有效菌数，CFU/mL。4.4水不溶物质量分数的测定按GB/T28136-2011农药水不溶物测定方法测定。4.5pH值测定按GB/T1601的规定进行测定。4.6悬浮率测定4.6.1实验仪器量筒:250mL具塞量筒、100mL普通量筒；真空吸液器；秒表；三角瓶:250mL；恒温水浴锅。4.6.2标准硬水配制方法按GB/T14825-2006中标准硬水配制方法进行。4.6.3操作步骤将样品摇匀取5.00mL(精确到0.01mL)于250mL三角瓶中,加入标准硬水100mL,用手旋转振荡50次后转移到250mL具塞带刻度量筒中,三角瓶用标准硬水清洗两次，清洗液一并收集到250mL具塞带刻度量筒中，用标准硬水定容到250mL。将量筒放入30℃±2℃恒温水浴锅中放置5min,将量筒盖好,左手托住量筒底部，右手握住量筒顶部并用食指按住塞子，颠倒量筒30次充分混匀，打开量筒塞子后重新将其放入恒温水浴锅中,竖直静置30min。用真空吸液器自上而下将上层液体抽走225mL，抽液过6程中调整适当的真空度，吸液管嘴紧贴量筒管壁并保持在液面下3～5mm处跟随液面下降，勿搅动下部沉淀。量筒内余留的25mL悬浮液,按4.3.4进行有效活菌数的测定，此活菌数浓度记为C1。4.6.4计算样品中的悬浮率(Y)按下列公式进行计算Y=(1-C1/C0)×1.1111×100式中:C0—步骤4.6.3中所取样品中的有效活菌数；C1—量筒底部余留的25mL悬浮液的有效活菌数；1.1111—换算系数4.6.5允许差两次重复测定结果之差应不超过10%。4.7倾倒性的测定按GB/T31737-2015进行。4.8持久起泡性的测定按GB/T28137-2011进行。4.9细度的测定按GB/T16150-1995中2.2进行测定，使用200目、孔径75μm的标准筛。4.10稀释稳定性实验按HG/T2467.6-2003中4.9进行。静置1h后，如稀释液均一，无析出物为合格。4.11低温稳定性实验4.11.1实验仪器低温恒温培养箱：1～20±1℃;烧杯：100mL。4.11.2实验方法取80mL试样置于100mL烧杯中，在低温恒温箱中6±2℃保持1h，期间每隔15min搅拌1次，每次15s，观察外观有无变化。将烧杯放回低温恒温箱中，6±2℃继续放置7d,将烧杯取出恢复至室温，测试有效活菌数应大于等于2.0×108亿CFU/mL，则符合标准要求判定为合格。4.12热贮稳定性实验4.12.1方法提要试样在45±2℃恒温环境下，密封保存14d，取出测试其有效活菌数。4.12.2实验仪器7恒温箱（或恒温水浴锅10～99±2℃;45℃仍能密封的具塞玻璃瓶：50mL；医用注射器：50mL。4.12.3实验步骤用注射器将约30mL试样，注入洁净的玻璃瓶中，置此玻璃瓶于冰盐浴中致冷，用塞子迅速封口。至少封3瓶，分别称量。将封好的玻璃瓶置于金属容器内，再将金属容器放入45±2℃恒温箱（或恒温水浴锅）中，放置14d，取出冷至室温，将玻璃瓶拭净，于24h内，按本标准4.3规定的方法进行检测，测试有效活菌数应大于等于2.0×108亿CFU/mL，则符合标准要求判定为合格。5检验规则符合GB/T1604有关规定。数值修约规则和极限值按GB/T8170处理。6标志、标签、包装、贮运、安全和保证期6.1标志、标签、包装、贮运产品的标志、标签和包装应符合GB3796的规定。采用聚乙烯塑料瓶包装或铝箔袋包装。外包装采用塑料桶或纸箱。也可根据用户要求或订货协议，采用其他形式的包装，但需符合GB3796中的有关规本产品应贮存于6～40℃、干燥、阴凉的库房内，不得露天堆放，以防雨淋和日晒，避免阳光直射，防止长时间40℃以上高温。运输过程中应有遮盖物，防日晒、雨淋及40℃以上高温。气温低于6℃时需用保温车运输。轻装轻卸，避免破损。6.2安全嗜硫小红卵菌悬浮剂属于微毒杀菌剂，操作时应穿戴好防护用品，如不慎溅到眼睛或皮肤，用大量清水冲洗干净，如误服请携标签立即送医院对症治疗。6.3保证期在规定的贮运条件下，从生产日期算起，保证期为1年。在保证期内，各项指标仍应符合表1的要求。8附录A（规范性附录）沼泽红假单胞菌PSB-S沼泽红假单胞菌PSB-S来源：从湖南省蔬菜研究所田间采集的土样中分离、纯化获得。图A-1沼泽红假单胞菌扫描电镜沼泽红假单胞菌属于光合细菌中的一种。光合细菌是地球上出现最早、自然界中普遍存在、具有原始光能合成体系的原核生物，是在厌氧条件下进行不放氧光合作用的细菌的总称，是一类没有形成芽孢能力的革兰氏阴性菌，因具有细菌叶绿素和类胡萝卜素等光合色素，而呈现一定颜色。红假单胞菌主要生物学特性：为杆状，大小为0.8～1.0µm×2.4～3.1µm，端生鞭毛，以二分裂方式繁殖。生理生化结果：G－，V-P反应阴性，甲基红反应阴性，不能利用淀粉，H2S反应阴性；可以利用多种小分子的有机酸（甲酸钠、乙酸钠、乳酸钠、丙酮酸）生长，也能利用部分糖类和醇类化合物（丙三醇、葡萄糖醇、肌醇、葡萄糖、木糖、蔗糖、甘露糖）进行生长，在蛋白胨和酵母膏中生长最好，不能利用NaHCO3，在883nm、808nm、593nm、382nm有特征吸收峰；最适生长温度和PH分别为30~35℃、7～7.5，具有红色培养物、黑暗好氧生长慢以及耐盐低于3%的特征。沼泽红假单胞菌生物活性研究及应用评述：从湖南省农科院周边一个池塘分离到一株光合细菌cs-1,选取稻曲病菌0901作为供试病原菌。通过试验研究发现cs-1发酵上清液对稻曲病菌0901有显著的拮抗作用，发酵上清原液对孢子萌发抑制率达100%，对稻曲病菌平板生长最高抑制率可达57.53%；与对照相比，稻曲病菌菌丝分支间距明显缩短，断裂严重，菌丝体变细，原生质凝结且有溢出现象。该菌株培养液对秀丽小杆线虫、根结线虫具有较强的作用活性，96h对秀丽小杆线虫和根结线虫的LC50分别为5.13mL/L和4.81mL/L。在温室盆栽条件下研究了该菌株培养液对番茄根结线虫病的防治效果。结果表明该菌株培养液能有效抑制南方根结线虫对番茄的侵染、显著降低番茄根种根结数量，而且能显著促进番茄生长。同时，防治黄瓜根结线虫的田间小区试验结果也表明，该菌株培养液不仅能显著减少黄瓜根围土样中线虫数量，50倍稀释液处理药效可达71.5%，使黄瓜早期产量增加57.7%。各种试验均表明该菌株在植物线虫病害防治上有巨大应用潜力。9附录B（规范性附录）菌种鉴别—生理生化特征法B.1主要仪器设备和材料除常规微生物试验操作所需要的设备和培养条件，其他还包括：天平（感量0.0001生物显微镜（10×100倍）；高压灭菌锅；恒温培养箱；移液器；移液管；试管（15mL）及试管架；菌落计数器；匀质器；L形玻璃棒；培养皿（9cm）；载玻片；盖玻片；紫外分光光度计等。B.2主要培养基和试剂试剂：结晶紫、乙醇、草酸氨、碘、碘化钾、丙酮、番红、过氧化氢、性氧化钠、肌酸、溴甲酚紫、可溶性淀粉、对二甲基氨基苯甲醛、浓硫酸、浓盐酸、L-酪氨酸、氯化钠、硝酸钾、α-萘酸、二苯胺、乙醚、马尿酸钠、柠檬酸钠、苯甲酸、硫代硫酸钠、生物素、尼克酰胺、硫胺素；、对氨基苯甲酸等。培养基：光合细菌的双层培养基（附录D）B.3形态学特征鉴别染色：在光合细菌双层培养基上生长72~96h的目标菌株涂片，空气干燥（非热固定）后，进行革兰氏染色，蓝紫色为阳性，红色为阴性。菌体观察：用生物显微镜观察菌体形态，细胞直径、出芽分裂类型、玫瑰结形成等。菌落形态观察：在光合细菌双层培养基上生长72~96h，观察菌落的形态和产色素等。培养条件：本方法内，除暗室培养特殊要求，所有光合细菌培养均在光照1500lux，30℃条件下进行；固体培养采用双层平板法，液体培养采用250mL血清瓶加满培养基至瓶口厌氧培养。B.4生理生化特征鉴别沼泽红假单胞菌（Rhodopseudomonaspalustris）及其近似种的生理生化特征检表沼泽红假单胞菌（Rhodopseudomonaspalustris）隐球红假单胞菌（Rhodopseudomo朱丽亚红假单胞菌（Rhodopseudomonasjulia）Rhodopseudomona菌细胞直径(μm)0.6-0.91.0-1.50.4-0.61.0-1.3出芽分裂类型分裂管无柄无柄无柄无柄玫瑰结形成++++-运动能力+++++菌落颜色棕红-红色红色粉红红色红色-橙色-红色最佳pH6.96.8-7.26.0-6.55.55.5-6.0最佳温度30-3738-4025-352825-30硫酸盐同化+nd-++好氧黑暗生长能力+++++果糖发酵-ndndnd-光照培养利用H2硫代硫酸盐硫化物-硫化物硫ndH2生长因子p-ABA(b)B12np-ABA无p-ABA无化合物利用苯酸盐+----柠檬酸盐+------++-葡萄糖--+--酒石酸盐---+-Mol%G+C64.8-66.368.863.565.462.2-66.8主要醌类Q-10ndndQ-10Q-10,MK-10,RQ-10主要脂肪酸C14:0微量ndndnd0.8C16:05.2ndndC16:1ndnd9.537.2C18:07.3ndnd7.80.8C18:179.7ndnd66.146.0符号及缩写：+，阳性；-，阴性；b，生物素；n，尼克酰胺；t，硫胺素；p-ABA，对氨基苯甲酸；nd，未确定。B.4.1最适pH范围用盐酸分别调节光合细菌培养基的pH值5.0~8.0，按每梯度为0.2配置梯度pH值培养液。采用250mL血清瓶液体光照培养将目标菌株培养72~96h后目测生长情况。B.4.2最适温度采用恒温光照培养箱，按每梯度为1℃,从25~40℃分批次采用250mL血清瓶液体光照培养将目标菌株培养72~96h后目测生长情况。B.4.3硫酸盐同化在光合细菌培养基配方中去除出含硫元素成分NH4）2SO4、FeSO4。将目标菌株利用该培养基，采用250mL血清瓶液体光照培养72小时，然后将目标菌株接入添加了0.5mM/L的（NH4）2SO4相同培养基中，采用250mL血清瓶液体光照培养72~96h后目测生长情况。B.4.4好氧黑暗生长能力在锥形瓶中加入入瓶体积25%的用光合细菌培养基，接入培养基5%体积的目标菌株菌液，封口膜（可通气）封口后，在180rmp条件下暗室震荡培养，72~96h后目测生长情况。B.4.5果糖发酵配制基础培养基：1000mL蒸馏水中加入2.0g(NH4)2SO4、0.2gMgSO4·7H2O、0.5gNaH2PO4·H2O、0.1gCaCl2·2H2O、0.5gK2HPO4、2.0g琼脂。将1.0g果糖加入到基础培养基中配置成待测培养基。将目标菌株接种到待测培养基中，采用250mL血清瓶液体光照培养72~96h后目测生长情况。B.4.6光照培养条件下对H2、硫代硫酸盐、硫化物、硫的利用对H2利用方法测定：配制基础培养基，1000mL蒸馏水中加入2.0g(NH4)2SO4、0.2gMgSO4·7H2O、0.5gNaH2PO4·H2O、0.1gCaCl2·2H2O、0.5gK2HPO4。培养基中不含碳源。将目标菌株接入到含有250mL基础培养基的500mL锥形瓶中，封口后，往瓶中不断通入二氧化碳与氢气，二氧化碳流速为5mL/min，氢气流速为20mL/min。光照培养72~96h后，观察菌株生长情况。对硫代硫酸盐、硫化物、硫利用方法测定：光合细菌培养基中分别加入不同浓度的硫化物、硫代硫酸盐、硫，起始浓度为0mM，按0.25mM为梯度，依次配置各个梯度浓度至最高浓度：硫化钠（3mM）、硫代硫酸钠(5mM)、硫（0.5mM）。采用250mL血清瓶液体光照培养将目标菌株培养72~96h后目测生长情况。B.4.7生长因子目标菌对生长因子需求测定方法，在光合细菌培养基中分别加入：b，生物素；n，尼克酰胺；t，硫胺素；p-ABA，对氨基苯甲酸，浓度为0.1%的五种培养基。接种目标菌株，厌氧光照培养72~96h后，观察菌株生长情况。B.4.8有机碳源利用配制基础培养基：1000mL蒸馏水中加入2.0g(NH4)2SO4、0.2gMgSO4·7H2O、0.5gNaH2PO4·H2O、0.1gCaCl2·2H2O、0.5gK2HPO4、2.0g琼脂。将1.0g被测底物：苯酸钠、甲酸钠、酒石酸钠、葡萄糖、柠檬酸钠分别加入到基础培养基中配置成待测培养基。将目标菌株接种到待测培养基中，采用250mL血清瓶液体光照培养72~96h后目测生长情况。B.4.9醌类测定方法：取目标菌株培养液，4℃8500rmp离心取菌体50mg；冻干细胞并加入加20~40mL氯仿:甲醇（2:1,v/v）有机溶剂；在磁力搅拌器搅拌1~2h；低速离心或过滤，收集滤液；减压蒸发干燥（40℃);再溶至1mL氯仿:甲醇（2:1,v/v）中；点样在60F254硅胶板上（10×10cmMerckArt,5735用乙烷:乙醚（85:15，v/v）展层；在波长254nm紫外灯下观察醌显示黑褐色带；刮下黑褐色带的硅胶，用1mL氯仿通过玻璃滤器洗脱，洗脱液在N2气中（或减压）蒸干；纯化的醌后，进行紫外分光测定、TLC测定与质谱分析（测定异戊烯单位数目及氢饱和度）等手段确定醌类化合物的类型。B.4.10G+Cmol%先液体培养目标菌株，将采用细菌DNA提取试剂盒，参照试剂盒使用说明书提取目标菌株菌DNA。取少量样品DNA使用1%琼脂糖凝胶电泳检测其条带和浓度，并采用NanoDrop2000测定浓度，-20℃冰箱保存备用。Tm测定：利用带加温装置的紫外分光光度计，波长固定于260nm；将待提取DNA测样品用0.1SSC稀释至OD260值于0.3~0.6间；在波长260nm首先记录25℃的吸光度（A25）然后温度迅速上升至50℃;每隔3~5℃记录一次；OD值开始上升表示变性开始，每隔1℃稳定5min，记录杯内温度和OD值，直至OD值不变表示变性完毕。Tm值计算:（1）热变形温度测定完成后，将记录的温度和相应光密度整理成表;（2）各光密度乘相应温度的相对膨胀系数（Vt）与25℃时光密度相比Vt/V25，求得相对的光密度;（3）以温度为横坐标，以相对光密度为纵坐标，绘制热变性曲线。热变形曲线中点相对应的温度即为熔链温度（Tm值）。最后按照公式进行G+Cmol%含量计算：0.1SSC：G+Cmol%=2.44Tm-69.31SSC：G+Cmol%=2.08Tm-106.4注：必须以大肠埃希氏菌（E.coliK12）为参比操作对照，以核实实验误差。B.4.11主要脂肪酸的测定利用光合细菌培养基，将目标菌株在采用250mL血清瓶液体光照培养将目标菌株培养96h。将菌体采用8500rmp、4℃离心方法从培养液中分离。将获得的菌体超声破壁后，加入4mL的甲醇/CH2Cl2（1:3）混合溶液，摇匀；恒温在30℃以下超声抽提10min。取出离心管，放于离心机中离心（1800rpm，10min），收集上清液，重复3次；将萃取液在柔和氮气流下吹干。向挥发完萃取液的离心管中加入3mL6%KOH的甲醇溶液（配制：6gKOH/甲醇118mL左右），超声10min，放置30min，重复3次，室温放置过夜（瓶盖盖紧）进行碱水解；加入2mL正己烷，超声10min，摇匀，震荡离心，弃除上层正己烷萃取液，重复3次。在上述萃取完剩下的溶液中（水相），加入约1mL4N的盐酸使pH<2，再用2mL正己烷萃取3次。将上述萃取液，转移到带盖玻璃管中，用氮玻璃管上空间冲入氮气后盖盖密闭，于90℃下加热2h；待样品冷却后，加入5%NaCl溶液约1mL，用2mL正己烷萃取3次，并将萃取液转移到2mL进样瓶中，氮气吹干，待分析。脂肪酸的测定采用气相色谱质谱联用仪（GC-MS）分析。（规范性附录）菌种鉴别方法—16SrDNA基因序列分析法C.1样品DNA提取将目标菌株涂布法在双层培养基平板上培养7～10d，挑取红色单菌落，采用细菌DNA提取试剂盒，参照试剂盒使用说明书提取细菌DNA。样品DNA使用1%琼脂糖凝胶电泳检测其条带和浓度，并采用NanoDrop2000测定浓度，-20℃冰箱保存备用。C.2引物设计16SrDNA序列通用引物：27F：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3；1429R:5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3。C.316SrDNAPCR扩增将检测合格的样品DNA作为PCR扩增的模板，采用50μL反应体系进行PCR扩增。PCR扩增体系：5μL10×PCRbuffer(含20mmol/LMgCl2),4μLdNTP,1μLPrimerF(上游引物)，1μLPrimerR（下游引物），0.3μLTaqTMDNA聚合酶，2μL模板DNA,ddH2O补足50μL。PCR反应条件：95℃预变性10min,95℃变性45s，55℃退火1min，72℃延伸45s，循环35次;最后72℃延伸10min，4℃保持．PCR扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测。PCR反应设立3个重复反应管，并用双蒸水代替模板DNA设立阴性对照管。C.4PCR产物检测扩增结束后，PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。回收检测结果正确的条带，送至公司并进行测序。C.516SrDNA序列的测定将测序得到的16SrDNA序列提交到NCBI核酸数据库已有的核酸序列进行BLAST程序对比，通过对比找到NCBI核酸数据库中与沼泽红假单胞菌同源性大于99%相近序列进而确定菌种。附录D（规范性附录）光合细菌培养基醋酸钠0.5gYeastextract