备考2025届高考生物一轮复习强化训练第十一章生物技术与工程课时6基因工程的基本工具与操作程序

课时6基因工程的基本工具与操作程序1.[2024辽宁]CD163蛋白是PRRSV病毒感染家畜的受体。为实时监控CD163蛋白的表达和转运过程，将红色荧光蛋白RFP基因与CD163基因拼接在一起（如下图），使其表达成一条多肽。该拼接过程的关键步骤是除去（B）A.CD163基因中编码起始密码子的序列B.CD163基因中编码终止密码子的序列C.RFP基因中编码起始密码子的序列D.RFP基因中编码终止密码子的序列解析由题意可知，若想使红色荧光蛋白RFP基因与CD163基因拼接在一起，使其表达成一条多肽，则CD163基因和红色荧光蛋白RFP基因都需进行转录和翻译，再结合图示可知，CD163基因转录形成的mRNA中不能出现终止密码子，否则在翻译时会提前终止，无法表达出既含CD163蛋白又含红色荧光蛋白RFP的一整条多肽，因此该拼接过程的关键步骤是除去CD163基因中编码终止密码子的序列，B符合题意，A、C、D不符合题意。2.[2024湖北]用氨苄青霉素抗性基因（AmpR）、四环素抗性基因（TetR）作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体（重组质粒），并转化到受体菌中。下列叙述错误的是（D）A.若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同B.若用PνuⅠ酶切，在含Tet（四环素）培育基中的菌落，不愿定含有目的基因C.若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建胜利与否D.若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）和Tet的培育基中能形成菌落解析若用HindⅢ酶切质粒和含有目的基因的DNA片段，用DNA连接酶将两者连接成重组质粒，目的基因和质粒有正向连接和反向连接两种连接形式，因此，目的基因转录的产物可能不同，A正确；若用PvuⅠ酶切，会破坏氨苄青霉素抗性基因，在含Tet（四环素）培育基中的菌落可能是由含有目的基因的重组质粒形成的，也可能是由质粒自身连接的产物形成的，因此，在含Tet（四环素）培育基中的菌落，不愿定含有目的基因，B正确；若用SphⅠ酶切，由于重组质粒和一般质粒的碱基对数不同，因此可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建胜利与否，C正确；若用SphⅠ酶切，会破坏四环素抗性基因，氨苄青霉素抗性基因不受影响，因此携带目的基因的受体菌能在含Amp（氨苄青霉素）的培育基中形成菌落，不能在含Tet（四环素）的培育基中形成菌落，D错误。3.[2024山东]粗提取DNA时，向鸡血细胞液中加入确定量的蒸馏水并搅拌，过滤后所得滤液进行下列处理后再进行过滤，在得到的滤液中加入特定试剂后简洁提取出DNA相对含量较高的白色丝状物的处理方式是（A）A.加入适量的木瓜蛋白酶B.37～40℃的水浴箱中保温10～15分钟C.加入与滤液体积相等的、体积分数为95％的冷却的酒精D.加入NaCl调整浓度至2mol/L→过滤→调整滤液中NaCl浓度至0.14mol/L解析木瓜蛋白酶能够分解蛋白质，故在得到的滤液中加入适量的木瓜蛋白酶后简洁提取出DNA相对含量较高的白色丝状物，A符合题意。将制备的含有DNA的滤液放入60～75℃的水浴箱中保温10～15分钟，利用DNA和蛋白质对高温的耐受性不同，使蛋白质变性，从而更好地与DNA分别，B不符合题意。DNA不溶于体积分数为95％的冷却的酒精，因此向含有DNA的滤液中加入与滤液体积相等的、体积分数为95％的冷却的酒精后DNA会析出，C不符合题意。DNA在0.14mol/L的NaCl溶液中的溶解度最低，因此将含DNA的NaCl溶液调至0.14mol/L，滤液中几乎不含DNA，D不符合题意。4.[2024山东，10分]科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示。其中V5编码序列表达标签短肽V5。（1）与图甲中启动子结合的酶是RNA聚合酶。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有标记基因、复制原点（答出2个结构即可）。（2）构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物F2和R1（或F1和R2）。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的a链（填“a链”或“b链”）相应部分的序列相同。（3）重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了J-V5融合蛋白，条带2所检出的蛋白不是（填“是”或“不是”）由重组质粒上的J基因表达的。解析（1）启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，能够驱动基因转录。基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子、标记基因和复制原点等。（2）假如引物的结合位点全部位于目的基因上，则无论目的基因插入的方向如何，均可通过PCR进行扩增，因此若通过PCR检测目的基因是否正确插入，所选的一对引物中的一个必需与目的基因结合，另一个必需在目的基因外侧，这2个引物方向相反并且均指向目的基因。由以上分析可知，若要确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，则可利用图甲中引物F2和R1进行PCR扩增。若J基因没有连接到质粒中，则引物R1没有结合部位，扩增不出J基因；若J基因连接到质粒中但反向插入，则利用图甲中引物F2和R1扩增不出J基因。同理可知，还可选择图甲中引物F1和R2进行PCR扩增，以确定J基因连接到质粒中且插入方向正确。转录时mRNA的合成方向为5'→3'，又知J基因转录的模板链位于b链，所以b链左侧是3'端，右侧是5'端。PCR扩增时引物F1与模板链3'端的碱基进行互补配对，所以引物F1与图甲中J基因的b链左侧相应部分的序列互补，与a链相应部分的序列相同。（3）重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平。分析题图乙可知，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体检测后，均有条带1，说明细胞内表达了J-V5融合蛋白。用抗J蛋白抗体检测后，出现条带2，而用抗V5抗体检测后，没有出现条带2，说明条带2所检出的蛋白不是由重组质粒上的J基因表达的。5.[2024江苏，12分]为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1所示。请回答下列问题：（1）分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有模板、引物，扩增程序中最主要的不同是延长时间。（2）有关基因序列如图2。引物F2-F、F1-R应在下列选项中选用CD。A.ATGGTG……CAACCAB.TGGTTG……CACCATC.GACGAG……CTGCAGD.CTGCAG……CTCGTC（3）将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，干脆用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需运用的酶主要有限制酶、DNA连接酶。（4）转化后的大肠杆菌需接受含有抗生素的培育基筛选，下列叙述错误的有ABC。A.稀释涂布平板需限制每个平板30～300个菌落B.抗性平板上未长出菌落的缘由一般是培育基温度太高C.抗性平板上经常会出现大量杂菌形成的菌落D.抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化（5）为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板，用引物F1-F和F2-R进行了PCR扩增，质粒P1～P4的扩增产物电泳结果如图3。依据图中结果推断，可以舍弃的质粒有P3、P4。（6）对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，缘由是电泳仅能检测DNA分子的大小，无法确定DNA分子的碱基序列是否正确。解析（1）进行PCR反应所需的条件：引物、酶、dNTP、模板和缓冲液（一般要添加Mg2＋）。分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有模板、引物。扩增程序中最主要的不同是延长的时间。（2）由图1可知，引物F2-F用于扩增F2片段（AnB1），引物F1-R用于扩增F1片段（EGFP）。C选项中5'－CTGCAG－3'能与AnB1中左侧部分序列进行碱基互补配对，因此引物F2-F选用C。D选项中5'－CTCGTC－3'能与EGFP中右侧部分序列进行碱基互补配对，因此引物F1-R选用D。（3）传统重组质粒构建时，会用确定的限制酶切割载体，使它出现一个切口，然后用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段，再利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处。将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，该过程不须要运用限制酶、DNA连接酶。（4）用稀释涂布平板法计数时，为了使结果更精确，一般选择菌落数为30～300的平板进行计数，稀释涂布平板不须要限制每个平板的菌落数，A错误；抗性平板上未长出菌落的缘由可能是转化失败或涂布器温度过高，一般不是培育基温度太高，B错误；转化后的大肠杆菌需接受含有抗生素的培育基筛选，一般含有重组质粒的大肠杆菌才能生长，故抗性平板上不会出现大量杂菌形成的菌落，C错误；稀释涂布平板法和平板划线法均为分别纯化微生物的方法，用稀释涂布平板法在抗性平板上接种后，长出的单菌落无需进一步划线纯化，D正确。（5）EGFP的长度为720bp，AnB1的长度为390bp，二者的总长为720＋390＝1100（bp），用不同菌落的质粒为模板，用引物F1-F和F2-R进行PCR扩增，若质粒符合设计，则用引物F1-F和F2-R应扩增出长度为1100bp的片段，依据图中结果推断，可以舍弃的质粒有P3、P4。（6）电泳仅能检测DNA分子的大小，无法确定DNA分子的碱基序列是否正确，因此对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认。6.[2024辽宁节选，4分]某抗膜蛋白治疗性抗体药物研发过程中，须要表达N蛋白胞外段，制备相应的单克隆抗体，增加其对N蛋白胞外段特异性结合的实力。Ⅰ.N蛋白胞外段抗原制备，流程如图。（1）构建重组慢病毒质粒时，选用氨苄青霉素抗性基因作为标记基因，目的是筛选出含目的基因（N蛋白胞外段基因）的病毒包装细胞。用脂质体将重组慢病毒质粒与帮助质粒导入病毒包装细胞，质粒被包在脂质体双分子层中（填“双分子层中”或“两层磷脂分子之间”）。（2）质粒在包装细胞内组装出由N蛋白胞外段基因重组慢病毒质粒、帮助质粒和蛋白质外壳组成的慢病毒，用慢病毒感染