T-ZJSC 0003-2023 岱衢族大黄鱼实时荧光PCR 鉴定方法

CCSB50T/ZJSCDaiqu-populationLarimichthyscrocea2023-12-26发布浙江省水产学会发布IT/ZJSC0003-2023本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容有可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本文件由浙江省水产学会提出并归口。本文件起草单位：浙江海洋大学、浙江省海洋水产研究所、浙江省舟山市水产研究所、象山港湾水产苗种有限公司、宁波市海洋与渔业研究院、浙江中惟科创海洋科技有限公司、舟山市绿色渔业发展有限公司。本文件主要起草人：严小军、江丽华、陶震、宋伟华、周永东、徐志进、吴雄飞、徐万土、乐利平、徐方成、张晓林、许永久、马家志、祝捍皓。T/ZJSC0003-2023岱衢族大黄鱼实时荧光PCR鉴定方法本文件描述了岱衢族大黄鱼的实时荧光聚合酶链式反应（以下简称实时荧光PCR）鉴定方法。本文件适用于养殖及自然海域捕获岱衢族大黄鱼的鉴定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T32755-2016大黄鱼3术语和定义GB/T32755-2016界定的术语和定义适用于本文件。3.1岱衢族大黄鱼Daiqu-populationLarimichthyscrocea指分布于黄海南部至东海中部的野生原种活体大黄鱼及其繁育的后代。3.2单核苷酸多态性（SNP）singlenucleotidepolymorphism单个核苷酸的变异引起的基因组水平上DNA序列的多态性，其形式包括单碱基的插入、缺失、转换和颠换。3.3Ct值cyclethreshold每个管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。4总则所有待检测样品均应符合GB/T32755-2016关于大黄鱼的种质标准要求。5原理通过10个SNP标记组合的检测结果，鉴定样品是否属于岱衢族大黄鱼。2T/ZJSC0003-20236试剂与材料6.1除另有规定外，所有生化试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682中一级水的规定。6.2苯酚（C6H6O）。6.3三氯甲烷（CHCl3）。6.4异戊醇[(CH)CHCHCHOH]。养殖池塘与培育水槽面积比例大于10:1。6.5无水乙醇（C2H6O）。6.6苯酚-三氯甲烷-异戊醇（按25:24:1比例混合）。6.7蛋白酶K裂解液（10mg/mL）：将100mg蛋白酶K溶解于10mL灭菌蒸馏水中，保存在-20℃待用。6.8Tris-HCl（1mol/L,pH=8.0）：称取12.1gTris碱至容器中，加入90mL一级水溶解，加入适量浓HCl调节pH至8.0，定容至100mL，高压灭菌室温保存。6.9EDTA溶液（0.5mol/L,pH=8.0用90mL一级水溶解18.61gEDTA，加NaOH调节pH至8.0，加水定容到100mL，高温灭菌室温保存。6.10NaCl溶液（1mol/L）：用100mL一级水溶解5.85gNaCl，高压灭菌室温保存。6.11NaAc溶液（3mol/L，pH=5.4）：用80mL一级水溶解24.60gNaAc，用冰醋酸调节pH值至5.2，加水定容至100mL，高压灭菌室温保存。6.12SDS溶液（20%）：用90mL一级水溶解20g电泳级SDS，水浴加热助溶，加浓盐酸调节pH至7.2，加水定容到100mL，室温保存。6.13组织裂解液：分别量取Tris-HCl溶液（6.8）1mL、EDTA溶液（6.9）20mL、NaCl溶液（6.10）1mL、SDS溶液（6.12）5mL，混合均匀，加一级水定容至100mL，室温保存。含10mmol/LTris-HCl,pH8.0,0.1mol/LEDTA,10mmol/LNaCl,1%SDS的混合溶液。6.14DNA提取纯化试剂盒。6.15荧光定量PCR反应试剂盒。6.16引物（浓度均为10μmol/L），具体信息参见附录A。7主要仪器设备7.1荧光定量PCR仪。7.2手持电动组织研磨器。7.3紫外分光光度计。7.4台式高速冷冻离心机（额定最高转速大于12000r/min）。T/ZJSC0003-20237.6水浴锅。7.7-20℃冰箱和-80℃超低温冰箱。8样品检测8.1DNA模板提取8.1.1酚-三氯甲烷-异戊醇提取法取待测大黄鱼肌肉/皮肤组织15mg，加入400μL组织裂解液（6.13），用手持研磨器研磨，加入5μL蛋白酶K（10mg/mL）（6.7），55℃水浴3h，用苯酚-三氯甲烷-异戊醇(6.6)、三氯甲烷各抽提一次，吸取上层水相，加入1/10体积3mol/LNaAc溶液和2.5倍体积无水乙醇，混匀后置-20℃沉淀1h，4℃12000r/min条件下离心5min，弃上清，沉淀晾干后溶解于灭菌一级水中，-20℃保存备用。8.1.2DNA提取试剂盒法按照试剂盒（6.14）规定的方法提取样品DNA。8.1.3DNA模板质量检测用紫外分光光度计测定DNA的纯度与浓度，分别读取260nm和280nm处的吸收值（记为OD260和OD280）。当OD260/OD280比值应为1.71.9时，DNA的质量符合实时荧光PCR检测的要求。DNA的浓度为50倍的OD260(ng/μL)。调整DNA浓度至100ng/μL，并置于-20℃冰箱保存备用。8.2实时荧光PCR检测8.2.1对照设置阳性对照：含有岱衢族大黄鱼基因组靶DNA片段的质粒为阳性对照，阳性质粒模板的构建按照附录A.2的要求执行。空白对照：包含除了测试样品DNA模板以外所有的反应试剂，在PCR反应体系用相同体积的灭菌一级水代替模板DNA。8.2.2荧光定量PCR反应体系配置荧光定量PCR反应体系（20μL）见表1，每个样品设置2个平行。表1实时荧光PCR反应体系试剂体积2×实时荧光PCR扩增预混液正向引物（10μmol/L）0.4反向引物（10μmol/L）0.4DNA模板一级水补至204T/ZJSC0003-2023总体积注：DNA模板若为阳性质粒模板与空白对照，单个反应的体积均为1μL。8.2.3荧光定量PCR反应条件第一阶段，预变性95℃30s；第二阶段，扩增95℃10s，60℃30s，40个循环。8.2.4PCR反应质量控制每个待检样品共包含10对引物的荧光定量PCR扩增反应。扩增反应结束后，所有空白对照应无Ct值；所有阳性对照Ct值<35，且出现典型扩增曲线，表明反应体系工作正常。9结果判定在荧光定量PCR反应体系正常工作的前提下，只有10对引物的PCR扩增结果均为阳性时，待测样品可判定为岱衢族大黄鱼。PCR扩增结果依据荧光曲线和Ct值判定，判定规则如下：a)PCR扩增曲线Ct值≤30，并出现扩增曲线，PCR扩增结果判定为阳性。b)PCR扩增曲线无Ct值，PCR扩增结果判定为阴性。c)PCR扩增曲线Ct值介于30和35之间时，应重新进行PCR检测；若重测结果Ct值≥35或无Ct值，判断为阴性；若重测的Ct值仍介于30和35之间，则判为阳性。10样品保存与复核10.1样品保存与结果记录送检样品应置于-80℃冰箱保存。对送检的样品至少保存1个月，以备复检。记录包括样品的来源、采样时间、检测时间、地点、方法、结果等，并有实验人员签字。保存实时荧光PCR检测阳性结果照片。10.2复核复核只是针对有异议的情况才进行。由指定的单位或人员负责，校核与评价实验原始数据记录及实时荧光PCR检测结果等资料的完整性和真实性。T/ZJSC0003-2023附录A（规范性）岱衢族大黄鱼荧光定量PCR检测引物序列及阳性模板构建A.1岱衢族大黄鱼SNP检测的特异性引物序列正向引物SNP1-F:5’-CCTCACTGCCTCTTTGAGA-3’反向引物SNP1-R:5’-ATGGGCTTTTGTTTTATTAGGAG-3’2)引物对2正向引物SNP2-F:5’-GCCATCCCTCCATCTCC-3’反向引物SNP2-R:TGCCAGAATCCGACTTGT-3’3)引物对3正向引物SNP3-F:5’-CACATGGACTCAGTGTTAAGAA-3’反向引物SNP3-R:5’-TCACCTCACATAAGTGTTAATCT-3’4)引物对4正向引物SNP4-F:5’-CGTGAATAAAACGAGATCAGT-3’反向引物SNP4-R:5’-TCCGATCCTCTTCTCTGAT-3’5)引物对5正向引物SNP5-F:5’-CCCTTCCATCAGCGACTC-3’反向引物SNP5-R:5’-TTATTTCGAGATGAGCAATACTGA-3’6)引物对6正向引物SNP6-F:5’-CACGGCCTTAGACACTTC-3’反向引物SNP6-R:5’-CACCATTCATCTGATAACAAGTC-3’7)引物对7正向引物SNP7-F:5’-GGCTGACAAGTTTATATAGTGC-3’反向引物SNP7-R:5’-TAGGCTCCGTACATTACA-3’8)引物对8正向引物SNP8-F:5’-CATAACGATCCCTGGACC-3’反向引物SNP8-R:5’-AGTCCTGACAGCTAAAGAAG-3’9)引物对9正向引物SNP9-F:5’--ATTATTTCCTGTCATCCATCTC-3’反向引物SNP9-R:5’-CATCTCTGCGTCTTCTCT-3’正向引物SNP10-F:5’-GCTTTTCTCTACTACTCCGTG-3’反向引物SNP10-R:5’-GTTGTCTGTTCATCTGTCTT-3’注：为了增加分辨率，以上各正向引物中3’端附近，人工引入新的错配，以加粗斜体标记；下划线标记的核苷酸位点为SNP位点。A.2阳性模板序列及其质粒构建采用DNA全人工合成的方法，分别获取以下10个DNA片段，用酶切连接等方法分别将其插入至pM18T载体（或其它同类型克隆载体）上，转化至Escherichiacoli工程菌株DH5α中进行质粒扩增。用质粒提取试剂盒获取含有目的片段的质粒，作为实时荧光PCR阳性模板。6T/ZJSC0003-20231)引物对1的阳性模板片段序列：>Seq1TATCAGAAAAGTGCTGCAGCACAGAACAAGAGGAAACACATCAGCTCCAGCAGAGGAAAAGGGAAAGCTTGTGGCGGATATCCTCACTGCCTCTTTGTAGAGGTGTCTCATCCTGTGGCCTGGATAAAAAACAAGTCAACTTTTTAGGAATAAAAAGGAAGCAGCATAAATTTATGAGCGATTAACATGGATTAGTCAGCAGCTCCAAAGTCAAAGTACCTCCTAATAAAACAAAAGCCCATGTATATTGTATAATATTGTATAATGTCTTTTTTTTGTTGTTGCTTCAGCTTGTAGTGTCTCTGTTGTTGTGCTGACTCAGCATCTTACAGGACAGGATACAGAAGATGCTGGAAATAGACTGAAGCCTGAGTCTGGGAATCTCTCTGACATAAAGTCAA2)引物对2的阳性模板片段序列：>Seq2AGACAATGTGATGTCGCAGTGAAATTTCCCACCGTCGCCCAACGATAATACAAAAGCAATCAGCTGCAGCAGAGGCAGAAACAGCCATCCCTCCATCATCCGTAGCCTCAGGAGACGAGAATATAACACAGCCACATGACAGGTTATCTCCTAACCACATGTCAGTGTGGGATGTGGTTTCAGTCGTAATGCAGAAAGCCATTTTTGGGTGTTGTCGAAAGACTGTTTTTTAAGGAAAAGTTAAATTAAAGTAGACAAGTCGGATTCTGGCACAACAAAAACATGGAATTACATCACTTAAGTACTAAAAAGCTCCTAGAATGACGTGAACATCCCAAAATAATGTTTTCTTCTTCTTTGGGTTAAGTTTTTACCAACTTTAACACATCCAGGGTGTTTTA3)引物对3的阳性模板片段序列：>Seq3GCACAATGTGATCACAATAACAAAAAAGTCGATTTATACTTTTATACTGTTATCATGCTCACTCTATCAAGACCATACCCACATGGACTCAGTGTTATGAAAGCATGTAAACGGCGGCATGATGTGAACGGTCAAAACAGGCCATTTACATAAACTTAGTTTGAGACTAGTCTTGGCCTTAGACTGCTCTTAAATTACCAGGTTTCACTGTGTGTTGCTTCAAGATTAACACTTATGTGAGGTGAGAACATTTGCGAGCTCTCCCTTTAGCTAAGCCTGAGGTGAGAACTTTGTTGAAATGCAACAATCTGTAAGAACATCAGGTAGAACACAAAGGTATACACAGGTACACTAAAAAAAGAAACAGAGGAGCAAATTCTATATTAATGAGAGTGCAACTT4)引物对4的阳性模板片段序列：>Seq4CTCATACAGATTTTTCCTAGTTTCTTATCTGTAGACGCATCCTGAAATTTAACATGAATGGAAATAAATTGTAAATAATACGTGAATAAAACGAGATGAGTGTTTTAACCTTTTTATCCTGTGACATATTCAGTCATTTATGTTGTCCCTGTCATATCTGCACCCAGGAGGATAAGAACCTCATTCATGGAAACGTTTGTGCCAAGAATGTTCTTCTGATCAGAGAAGAGGATCGGACCACAGGCAGCCTGCCCTTCATTAAACTCAGTGATCCAGGCATCAGCATCACCGTGCTGCCCAAAGAAGGTGAGACACGCGTCTGCATGTTGTGTGAAGACTTGTGCATCACGCCATCACTTCCATTTATGTATCTCTTTCTTTCTGTCCATCAGTTCTGGTGG5)引物对5的阳性模板片段序列：>Seq5TTGCCAAATACTTTTTTTTTTTTTCAAGCATCAGAACAATTTCATCCAGTCAGAAGAGGACTTGTCCACACTGAATACTAATTCCCTTCCATCAGCGTCTCTTATTTGGTCTGGATGACAAAAGTTTGCCACAAAACTGCATATAGTCACGTGTGTCAGTGCTCCATGCCACATTGCTGTGAGTCACACAGAGCAGTTGCCGTTGCATAAACATGATCTTGATGAATCCATCAGTATTGCTCATCTCGAAATAAAAGCAGGGCAGCGACCTGCACGCAGCCGGAGATCTGACACTCACAGGTGCTTGGCCACTGCTGAGGCAGGCAGACTGAAGGCAGAGACTGTTTGCTCTAAAGTTAATCAGTAACTGCACATGTTCAGGTCACCTCTTCTGTGTTACC6)引物对6的阳性模板片段序列：>Seq6TCCAACCGAGGAGCTGCATGCTGCCTGAATGACAATCATGCTCCTCTCCCAAAGCAGGCAGGGTCAGAGTGAAAGTGCACATCCACGGCCTTAGACAGTTCGACAGAAACACATGAAACCAATGACTGAGGCCTCTGTTGTACTGCCAACGCAAAGATAAGATCATTTTCTTGACCTTGAAATGAGCACTGCCTCTACATTTTGTGCTTTAAAGTCACATTTTATAACTTAGCTAACAAAAACGATGCTACTCTGACTTGTTATCAGATGAATGGTGTCTCATCTCTTCTTTTACTATGTGACATTGTGCTCTGGGTATGCATTTACTACACAAAACCAAAAAGCAGTCTGTGTTAAGTGCAAGATTAACAAATCTTACCAGTATCTGTTGTGCTCATCTA7)引物对7的阳性模板片段序列：T/ZJSC0003-2023>Seq7AAGGAGCAGAGTCTGGTCAAGCACAGTTTGGGAAAATGTGTGGAAGGCGTTAACGAGCAGGTTTCAGTGGCGGAGTGAAGGCTGACAAGTTTATATACTGCGAAAGATTGAGCACGCGGACGCGCGCACGAGTGCGGCGGGAAGAAACGCGCGCGTGCGCATTAAGCAATGACCGTACATTAGCTTAATGAGACGTAGCATCATCTACTATGCTGTAATGTACGGAGCCTACTGTGTACTCGAGGCTGTGAGGAGGAGCTTTAAAACACTCCAAACCTGTTTTACCTGAAGAGTTTTGCTTTGTTTGGTTTGCATTAAAAATCTCAACTATCTGGCTAACACCATATTCTATATCTGGCAGCGCCATGACTAGCTCAGATGTCACACTTCCTACTATTCGC8)引物对8的阳性模板片段序列：>Seq8TAATTCTTCTGTGCTTAGTGCAGCTTCTCTTTTTTTCCAATAGTCTCTCAAGAGCTGTCTGTCAGCATCGTGAAACAAGACCACATAACGATCCCTGCACCAGTATCAAGAGAGCATATGATCCCAGACTTTTTCAGTCACACTGCTGTCTAATATATGCGCACACACCATGCCTACCAAGCAAAGACAAACACACACGTGCACATCTTGTTTCCAGGGCTTTGCTTCTTTAGCTGTCAGGACTGCAGGTGCTCCTTACCCTCAGTCACTTTCTTGTTTTGTCATGTGCGAGGACATTGTATTGACTCGTTCCCAAGAGGCTTCATGTCTCCTTCAAATTAATATAGCTGTATGGCATGTCGTGCAGCAACAGCTACAGGCAGAAGCCTTCAT