生物制药工艺学 13章

生物制药工艺学王晓杰

博士温州医科大学第十三章双水相萃取技术

基本要求：掌握双水相分离理论重点：双水相的形成；相图；物质在两相中的分配；双水相提取胞内酶的具体操作。难点：相图第一节双水相萃取概述过滤和离心技术:固液分离微生物细胞器、除去细胞碎片、提取和浓缩胞内物质等操作。有机溶剂萃取:蛋白质：（1）许多蛋白质都有极强的亲水性，不溶于有机溶剂；（2）蛋白质在有机溶剂相中易变性失活。在一定条件下，水相也可以形成两相（即双水相系统）或多相。双水相系统:将水溶性的酶、蛋白质等活性物质从一个双水相系统水相转移到另一个水相中。聚合物的不相溶性，是一种普遍现象。其溶剂可以是水，也可以是有机溶剂。双水相是由于聚合物分子的空间阻碍作用，相互间无法渗透，当聚合物的浓度达到一定值时，就不能形成单一的水相，当两种聚合物在排斥力作用下达到平衡时，就形成了稳定的两相，两种聚合物分别位于两个互不相溶的两相中。聚合物可以是天然或合成的，但必须具有亲水性。某些聚合物的溶液与某些无机盐的溶液可以形成双相，即聚合物-盐双水相体系。一些有机溶剂和无机盐也可以形成双水相。双水相萃取的优点：（1）萃取操作条件比较温和；（2）产品活性损失少，无有机溶剂残留、污染；（3）萃取体系具有较好的可调性；（4）设备投资小，操作简单；（5）含水量高（70％～90％），适宜提取水溶性的蛋白质、酶等生物活性物质且不易引起蛋白质的变性失活；（6）易于放大，各种参数可按比例放大而产物收率并不降低，这是其他分离技术无法比拟的。β―半乳糖苷酶不同纯化方法的比较不同方法除去细胞碎片的比较注：(a)酶滞留比R=0；(b)酶滞留比0.7双水相萃取的技术特征：（1）体系具有生物亲和性双水相体系水分含量高，操作条件温和，分相时间短，对蛋白质等生物活性物质无毒害，并有保护作用。（2）体系能进行萃取性的生物转化生物反应通常在一相中进行，同时生成的产物被连续萃取到另一相中，既解决了产物反馈抑制的问题，而且，酶在高聚合物溶液中更稳定。（3）体系能和细胞相结合：如和细胞破碎结合，即将细胞悬浮液中加入PEG和无机盐，再进入珠磨机进行破碎，然后用离心机分相，既节约了萃取设备和时间，又可避免酶损失。（4）将亲和萃取中的配体和聚合物结合，可以大大提高双水相萃取的专一性。（5）将双水相萃取和亲和沉淀两个单元操作合为一个过程，显示高效和节能的优势。体系熵的增加熵的增加与分子数量有关，与分子大小无关。当分子的物质的量相同时，大分子与小分子间的混合，熵的增加是相同的。

分子间作用力。分子间的作用力看做分子中各基团间相互作用力之和。分子量越大，分子间的作用力也越大，故大分子间的混合，分子间的作用力与熵相比，其决定混合效果。两种被混合分子间，如存在空间排斥力，它们的线团结构无法相互渗透，则在达到平衡后就可能分成两相，形成双水相。双水相的形成：几种典型的双水相系统备注选择依据A聚丙二醇聚乙二醇聚乙烯醇葡聚糖（Dex）羟丙基葡聚糖两种非离子型聚合物双水相系统的选择原则：必须有利于目的物的萃取和分离，同时又要兼顾到聚合物的物理性质。聚乙二醇（PEG）聚乙烯醇葡聚糖（Dex）甲基纤维素B硫酸葡聚糖钠盐羧基甲基葡聚糖钠盐聚丙烯乙二醇甲基纤维素其中一种为带电荷的聚电解质C羧甲基葡聚糖钠盐羧甲基纤维素钠盐两种都为聚点解质D聚乙二醇磷酸钾硫酸铵硫酸钠硫酸镁酒石酸钠一种为聚合物，一种为盐类PEG/Dex体系的相图是一条双节线。双节线下方为一相区，双节线上方即为两相区，两相分别有不同的组成和密度。上相组成用T表示，下相组成用B表示；上相主要含PEG，下相主要含Dex。两相平衡时，VT、VB表示上相、下相体积C点为系统临界点。

=VTVBBMMT二、相图：双节线的位置和形状与聚合物的分子量有关。聚合物Dex的分子量越高，相分离所需的浓度越低；两种聚合物分子量相差越大，双节线的形状越不对称,如图：三、物质在两相中的分配和溶剂萃取法一样，物质在两水相中的分配用分配系数K表示。

CT、CB分别代表上相、下相中溶质的浓度。K—与温度、压力以及溶质和溶剂的性质有关，与溶质的浓度无关。影响聚合物质在两相中分配系数的因素如下：

K=CTCB第三节影响双水相萃取的因素分子或粒子在溶液中的分配，总是选择两相中相互作用最充分或系统能量达到最低的那个相。

lnK=－△E/kTLnK=Mr

λ/kT因大分子的Mr值很大，λ的微小改变就会引起分配系数K很大变化，故利用不同的表面性质，可以达到分离大分子的目的。双水相系统适合生物大分子的分离。1、表面自由能的影响2、表面电荷的影响如粒子带有电荷，当在两相中分配不相等时，就会于相间产生电位，称为道南电位：当KAZ＋≠KBZ-时，U2-U1≠0如一种盐的正负离子对两相有不同亲和力，则在相间产生点位。正负离子价之和越大，电位差越小。两相系统中如有盐存在，会对大分子在两相中的分配产生较大的影响，这称为盐效应。

3、综合考虑综合以上两种影响分配系数的主要因素，可用Gerson提出的公式表示。-lgK=A△γ+δ△φ+β

大分子的表面积A都很大，△γ的微小变化都会引起蛋白质大分子的分配系数产生很大变化；加入系统的盐，以及体系的pH会影响相间电位差△φ和蛋白质所带的电荷数δ，因而也对分配系数产生大的影响。

成相聚合物的分子量和浓度；体系的pH；体系中盐的种类和浓度；体系中菌体或细胞的种类和浓度；体系温度等。4、影响分配平衡的参数

（1）聚合物的影响

聚合物的平均分子量对分配率的影响；聚合物的浓度对分配率的影响。典型的PEG/Dex双水相系统中，PEG分子量的减少，会使蛋白质在两相中的分配系数明显增大。成相聚合物的疏水性对酶等亲水性物质的分配产生较大的影响。同一聚合物的疏水性随分子量的增加而增加，当PEG的分子量增加时，在质量浓度不变的情况下，其两端羟基数目减少，疏水性增加，亲水性的蛋白质不再向富含PEG相中聚集，而转向另一相。

Dex水解程度不同，对蛋白质的分配系数也有一定的影响(2)体系中无机盐离子的影响在PEG/Dex体系中，无机盐离子在两相中也有不同的分配（表），因此在两相间形成电位差。由于各相要保持电中性，使得带电生物大分子，如蛋白质和核酸等分别向两相移动分配。(3)体系pH的影响

pH影响蛋白质中可离解基团的离解度，因而改变蛋白质所带电荷和分配系数；pH还影响系统缓冲物质磷酸盐的离解程度，影响H2PO4-和HPO42-之间的比例，影响相间电位差U2-U1，从而影响分配系数。pH微小变化有时会使蛋白质的分配系数改变2~3个数量级。对一特定的蛋白质，在不同的盐系统中，在等电点时，得到的均为不带电时分子的分配系数。对不同的盐系统，其等电点时的分配系数应相等，两条pH和分配系数关系的曲线必交于一点，该点所对应的pH为等电点。根据该原则测定蛋白质等电点的方法，称为交错分配法。（4）体系温度的影响温度影响相图，同时影响分配率和蛋白质的生物活性。一般地，临界点附近，温度对分配率的影响较大，远离临界点时，影响较小。分离后，上、下相的温度上升不多。

对于同一种双水相体系，微生物也会影响体系上下相的比例以及胞内蛋白质在体系中的分配系数。这种分配的差异主要是由细胞破碎程度引起的，细胞壁和细胞膜不同的化学结构也会导致体系上下比例的改变。（5）体系中微生物的影响K在细胞浓度>30%和S>20%时，其上下相的体积比例基本不变。随着细胞浓度的增加，细胞破碎后释放的内含物的分配系数迅速下降。两种酶随着细胞浓度的增加，而分配系数下降。PEG是一种常见的絮凝剂和沉淀剂，在该体系中，细胞物质的絮凝和在不同相中的分配同时发生。PEG的存在改变了物质的溶解曲线。第四节双水相萃取技术的应用双水相萃取主要应用于胞内酶的提取和精制。传统胞内酶的提取：细胞破碎，离心除去细胞碎片。能耗大，细胞碎片难以去除干净。一、双水相萃取的工艺流程双水相萃取的工艺流程一般包括三部分：（1）目的物的萃取（2）PEG的循环（3）无机盐的循环双水相萃取，应满足的条件：（1）欲提取的酶和细胞碎片应分配在不同的相中；（2）酶的分配系数应足够大，使在一定的相体积比时，经过一次萃取，就能得到较高的收率；（3）两相用离心机很容易分离。在双水相体系中，通常将目的蛋白质分配在上相（PEG），而细胞碎片分配在下相（盐）。因为如果上相固形物含量高，会使离心机的性能受到很大影响。PEG/盐系统广泛应用于蛋白质的提取，由于PEG价格低廉以及该系统的选择性高于PEG/粗Dex系统。萃取操作时，单位重量相系统中匀浆液的加入量是一个重要的参数。一般每1kg萃取相系统以处理200~400g湿菌体为宜。使用PEG/盐系统提取胞内酶的步骤：（1）用PEG/盐系统处理细胞匀浆液，细胞碎片能全部转入下相（盐相）；（2）在上相中加入适量盐，进行第二次双水相萃取，除去核酸和多糖（下相），蛋白质在上相PEG中；（3）第三次萃取，调节pH，使蛋白质分配在盐相（下相）中，与主体PEG分离；（4）盐相中的蛋白质用超滤法除去残余的PEG，主体PEG可循环使用。二、双水相提取胞内酶的具体操作在7g/100mlPEG4000、1.25g/100ml粗Dex的体系中分离C.boidinii细胞培养液，提取甲酸脱氢酶（FDH）。由实验室10毫升试管规模放大到工业上50Kg菌体处理量的规模，其中分配系数是从实验室放大到工业规模的主要数据。放大过程中遇到的主要问题是含细胞碎片相的粘度问题和达到萃取平衡所需的时间以及相与相的分离问题。说明双水相萃取法的分配系数K值重演性好。1、萃取和平衡虽然在高粘度的体系中，分子扩散的速度降低，但是由于体系的表面张力很低，所以分配能在几分钟内达到平衡。而且由于界面张力很小，则界面能低，搅拌时，只需较小的剪切力就能得到分散度很高的悬浮液，能耗小。2、上下相的分离分离基本上依靠两种力：重力和离心力。前者为重力沉降，后者为离心分离。

由于PEG/盐系统相对于PEG/Dex系统，其液滴直径大，两相之间密度差小、粘度低，而更适用重力沉降。一般沉降30~90min后，可以得到分层明显的沉降物。重力沉降可用于任何规模的提取中，能耗低，易于自动控制。由于PEG/Dex系统沉降时间过长，难以用重力沉降法进行，需用离心机分离。双水相萃取中用于液液分离的离心机一般为碟片式离心机。澄清型离心机和分离型离心机。澄清型离心机用于悬浮液中的固、液相分离，适合双水相单级萃取流程中第一次萃取后的上下相分离（下相粘度大，含有细胞碎片等固形物）。分离型离心机多用于分离轻重不同、互不相溶的两种液体，适合于双水相单级萃取流程中第二、三、四次等的分离。3、多聚物的分离如目的蛋白质是分配在PEG富集的上相中时，当相与相分离后，在上相中加入盐，形成新的双水相体系，在适当的条件下，蛋白质重新被萃取进入盐相，而大量的PEG得到回收，盐相中少量残余的PEG可用超滤或透析除去。一般用的PEG的分子量小于60000，可用此法分离分子量大于60000的蛋白质。第五节双水相萃取技术的发展目的物含有少量的核酸和多糖，提高目的蛋白的纯度，可从双水相体系和萃取操作方式进行改进。1、PEG衍生物在PEG上引入亲和基团或离子基团，在同样的操作条件下，使用PEG衍生物，目的蛋白的得率和纯度都有很大的提高。2、操作方式当改变体系多聚物以提高体系选择性，仍不能满足目的产物纯度和得率要求时，通常采用多级萃取。

双水相萃取技术存在问题：（1）双水相萃取技术还不十分成熟，技术上还没有达到最佳操作。（2）常用的聚合物价格昂贵，开发新的聚合物是该技术急需解决的问题。思考题：1、交错分配法2、双水相是怎样形成的？简述双水相萃取的基本原理及影响因素。3、双水相中，上、下两相的组分是不同的，但上、下两相的密度是相同的，对吗？4、图7-2中，T、B各表示什么，BM、TM表示什么？5、交错分配法测