奈瑟菌的分离和鉴定

卫生部北京医院陈东科

脑膜炎奈瑟菌(Neisseria.meningitidis)简称脑膜炎球菌，是引起流行性脑脊髓炎（简称“流脑”）的病原菌。多发年龄在5~29岁。对本菌的鉴定是确定诊断的重要依据，同时给临床治疗提供参考价值。

人类是脑膜炎球菌的唯一宿主。流行性脑脊髓炎病人和带菌者是本病的传染源。本病经飞沫传染，潜伏期1~4d。细菌首先侵害鼻咽腔，引起上呼吸道感染或局部炎症。当少量细菌侵入血流时，可引起菌血症突发恶寒、发热、恶心、呕吐等，并有出血或红斑性皮疹及脾肿大。当大量细菌侵入血流时，由血液或淋巴到达脑脊髓膜则发生脑脊髓炎的症状和体症。在我国以A群流行为主。（1）形态与染色脑膜炎球菌为革兰阴性双球菌，菌体呈肾形或豆形，成双排列凹面（短轴）相对。由病人体内新分离的菌株有多糖荚膜。（2）培养特点本菌为专性需氧菌，营养要求高，5~8%CO2可促进生长，其最适生长温度为36~37℃，最适pH值为7.4~7.6。在巧克力平板上经18~24h培养，形成圆形、光滑、透明、湿润、边缘整齐菌落。直径2~3mm，在血平板上不溶血。培养时间延长，由于细菌自溶酶的作用，菌落可变成酪样或胶样。（3）生化反应特点脑膜炎球菌可分解葡萄糖、麦芽糖，产酸不产气。不分解蛋白质，不产生靛基质，不产生硫化氢，不分解尿素，硝酸盐还原试验阴性，氧化酶试验阳性。

根据病期不同，采集的标本也有所不同。菌血症期病人可采取血液；出现出血点或瘀斑者，可挑取瘀斑渗出液；如出现脑脊髓膜刺激症状者，必要时可抽取脑脊液；上呼吸道感染期的疑似病人和带菌者，可取鼻咽腔分泌物进行检查。因该菌易自溶，故应立即送检，最好在床边接种。（1）直接检查法：

1）脑脊液以无菌方法获得脑脊液标本后，经3000r/min离心30min，取沉淀物，首先接种培养，然后再涂片染色检查。通常制两张涂片，一张作革兰染色，一张作美蓝染色进行镜检。若脑脊液较清应先增菌，即在脑脊液中加入少量葡萄糖肉汤培养液，经37℃4~6h增菌培养后，再行涂片染色镜检，可提高阳性检出率。一般情况下，患病早期的脑脊液中脑膜炎球菌数量较少，且大多数在细胞外；在疾病后期菌量增大，大多数在细胞内。2）瘀斑（出血点）选择细小的色泽鲜红，境界明显的瘀点，或无瘀点时用充血皮肤，经消毒干燥后刺入0.5cm，用清洁玻片采血三滴，涂成血膜片，自然干燥。用美蓝或革兰染色镜检。第一滴血含菌量比第二、三滴血高数倍，故不能按常规采血弃去第一、二滴血。1）脑脊液取脑脊液离心沉淀物，立刻接种巧克力平板，37℃，5~8%CO2环境培养18~24h。如脑脊液混浊可直接种入培养基。2）瘀斑渗出物渗出物直接涂于巧克力平板上，37℃，5~8%CO2环境培养18~24h。3）鼻咽腔分泌物将绵拭标本立即涂于，P.V(PolymyxinB.Vancomycin)卵黄琼脂或P.V巧克力平板一端，再用接种环划线分离，进行培养观察。

4）血液抽取静脉血5~8ml，立刻接种注入血培养瓶，按血液细菌培养常规操作。

取纯培养物，如其形态、菌落特征典型，氧化酶阳性，可按表1进行鉴定。

包括血清凝集试验、SPA协同凝集试验、反向乳胶凝集试验等方法。

取一接种环菌掖或脑脊液，于玻片上，再加一环抗血清及二环吕氏美蓝液混合，加上盖玻片，20min，用油镜观察荚膜是否肿胀，同时用盐水作对照。此试验仅适用于A群和C群菌株。

淋病奈瑟菌（N.gonorrhoeae）简称淋球菌，它是淋病的病原菌。主要通过不洁性交引起泌尿生殖系统化脓性炎症，也可通过污染器械、带菌衣物、用具发生间接污染。也有肛门及咽部的淋球菌感染病例。新生儿经过产道时，可被感染而患淋病性眼结膜炎。（1）形态与染色

淋球菌的形态与脑膜炎球菌很相似，菌体呈球形、肾形或豆形，成对排列，两球菌接触面平坦，形似一对黄豆。革兰染色阴性，无芽孢、无鞭毛、有荚膜。在急性淋病患者尿道脓汁标本中可见细菌被吞噬于中性粒细胞内；慢性淋病时多在细胞外。

本菌对营养要求高，需用巧克力平板，或含万古霉素、多粘菌素及制霉菌素的Thayer-Martin培养基（GC琼脂加生长添加剂）才能生长。初次分离需供给5~8%CO2，最适生长温度为36~37℃，最适pH值为7.5。经48h培养，形成圆形、不透明、灰白色凸起，细小颗粒状菌落。直径0.6~1.0mm，进一步培养，菌落可呈粘液样。

淋球菌只分解葡萄糖，产酸不产气，不产生靛基质，不产生硫化氢，硝酸盐还原试验阴性，氧化酶及触酶试验均阳性。（1）男性尿道炎患者，先以无菌生理盐水清洗尿道口，采集尿道脓性分泌物；前列腺炎患者则从直肠侧对前列腺进行按摩，待分泌物排出后采集。（2）女性尿道炎患者，先以无菌生理盐水清洗尿道口，从阴道后壁由后向前压迫尿道，使分泌物排出，然后用无菌拭子或接种环采集；对于宫颈炎患者，先无菌生理盐水清洗宫颈口和阴道壁，再用阴道窥镜压迫子宫阴道部，使分泌物排出，然后用无菌拭子或接种环采集标本；合并肠炎的患者，可在直肠镜下，用无菌绵拭子采集直肠窝粘膜的粘液进行送检。（3）眼分泌物、血液、关节液等以无菌操作方式采集。

最好在治疗前采集样品；取材前不论有无症状一律禁用消毒药；对女性患者取材时不要碰阴道粘膜，以防污染正常菌群；由于本菌抵抗力甚弱，标本采集要迅速并立即送检，最好床边接种，立即培养。（1）直接检查法取标本直接涂片进行革兰染色，急性期在脓细胞内可找到许多革兰阴性双球菌，有诊断意义。本法最适用于泌尿生殖道标本，男性与培养结果符合率达到98%，一般可不作培养；女性与培养结果符合率仅达50%左右，需进行培养鉴定。（2）培养检查法采取脓汁或粘液标本后，应立即接种于预温的巧克力平板上进行分离培养。（3）生化反应取纯培养物，如其形态、菌落特征典型，氧化酶阳性，可按表1进行鉴定。———————————————————————————————————菌名巧克力琼脂营养琼脂葡萄糖麦芽糖还原还原DNA酶乙酰脂酶（22℃）（35℃）NO3NO2

———————————————————————————————————脑膜炎奈瑟菌——+—————淋病奈瑟菌——++—V——卡他莫拉菌V+——++++其他奈瑟菌V+———*V—————————————————————————————————————*粘膜奈瑟菌阳性。V:不定。其他奈瑟菌大多寄居在人的上呼吸道中，很少有致病性。菌落较干燥，有咬琼脂的现象，大多呈黄色。也有少数菌落呈光滑型，且无色素，易于脑膜炎奈瑟菌及嗜血杆菌菌落相混淆，应注意鉴别，奈瑟菌落一般较粘，用接种环不易刮取。解乳糖奈瑟菌浅黄奈瑟菌编织奈瑟菌编织奈瑟菌

一般来说，不需要对淋病奈瑟菌中的β-内酰胺酶进行检测。当前经验治疗淋病的药物为头孢曲松、头孢克肟或喹诺酮类抗菌药物，而这些药物的抗菌活性均不受β-内酰胺酶的影响。由于多年前就已经不提倡用青霉素进行经验治疗，因此，不必要对淋病奈瑟菌进行β-内酰胺酶的