酵母菌杂交育种

关于酵母菌杂交育种12目录一酵母菌杂交特点1酵母菌的细胞结构和菌落形态2酵母菌的生活史和繁殖方式3酵母菌的杂交二酵母菌杂交育种的方法标记菌株的选择酵母菌杂交拓展：酵母群体杂交育种方法第2页,共32页，星期六，2024年，5月3一酵母菌杂交特点第3页,共32页，星期六，2024年，5月41酵母菌细胞结构和菌落形态

酵母菌（yeast）是低等真核微生物，分属于子囊菌纲、半知菌纲和担子菌纲。大多数酵母菌为单细胞，一般呈卵圆形、圆形或圆柱形。细胞结构类似于高等生物，细胞壁的主要成分为葡聚糖和甘露糖，此外还有蛋白质和脂类等。酵母细胞除细胞壁之外还有细胞核、核膜、核仁等结构。大多数酵母的菌落和细菌相似，第4页,共32页，星期六，2024年，5月5

酵母菌的细胞结构与细菌相似，但比细菌细胞大得多。一个椭圆形的酵母菌细胞长约7.2um，宽5.6nm(圆形直径1—5um).

菌落大而厚，菌落表面湿润、粘稠并多呈乳白色，少数为红色。

菌落特征表面湿润、粘稠，大多数是乳白色，少数红色（红酵母），在固体培养基上生长时间长了，颜色变暗，呈绉缩状。

第5页,共32页，星期六，2024年，5月62酵母菌生活史和繁殖方式酵母菌是真核生物中最简单的单细胞微生物，具有真核生物所有的共性，染色体结构、功能和高等生物细胞相类似。存在单倍体和二倍体的生活史，二倍体生活力强，生产能力高，可通过杂交得二倍体来育种。第6页,共32页，星期六，2024年，5月7酵母菌的生殖方式酵母菌可以进行无性生殖，也可以进行有性生殖。无性繁殖包括芽殖、裂殖(即少数种类的酵母菌与细菌一样，借细胞横分裂而繁殖)、芽裂(这种方式很少)三种。其中最主要还是出芽生殖(简称芽殖)，即成熟的酵母菌细胞先长出一个小芽体，芽体细胞长到一定程度脱离母细胞继续生长，而后形成一个新个体。有性生殖是以形成子囊孢子的方式进行。第7页,共32页，星期六，2024年，5月83酵母菌的杂交酵母菌的杂交最主要通过有性杂交，利用两种不同结合型的单倍体菌株或子囊孢子进行的。有的酵母如假丝酵母等不具有性生殖，即不产生子囊孢子，它们的杂交与霉菌一样，是通过准性生殖进行的。酵母菌杂交一般是指异接合型菌株杂交。杂交过程包括子囊孢子接触，结合，合子形成，直至二倍体细胞出牙为止的一系列过程。杂交步骤包括遗传标记菌株的选择和不同遗传标记的异接合型细胞杂交。第8页,共32页，星期六，2024年，5月9二酵母菌杂交育种的法第9页,共32页，星期六，2024年，5月101标记菌株的选择常用的标记是营养缺陷型或抗性突变基因

1．营养缺陷型标记2．抗性标记3．温度敏感性标记4．其他性状标记如孢子颜色、菌落形态结构、可溶性色素舍量、代谢产物产量高低和代谢返速度快慢等，以及利用的碳、氮原种类、杀伤力等其他性状都可以作为重组体检出的辅助性标记。第10页,共32页，星期六，2024年，5月11营养缺陷型菌株的筛选过程营养缺陷型菌株的筛选一般要经过诱变、淘汰野生型菌株、检出缺陷型和确定生长谱四个环节。１诱变剂处理诱变剂处理时与其它诱变处理基本相同。在诱变处理后的存活个体中，营养缺陷型的比例一般很低，通常只有百分之几至千分之几，采用抗菌素法或菌丝过滤法，可以淘汰为数众多的野生型菌株，从而达到浓缩营养缺陷型的目的。２

淘汰野生菌的方法1.抗生素法2.菌丝过滤法第11页,共32页，星期六，2024年，5月12２．１抗生素法：是利用野生型菌株能在MM中生长，而缺陷型不能生长，于是将诱变处理液在MM中培养短时让野生型生长，处于活化阶段，而缺陷型无法生长，仍处于“休眠状态”，这时，加入一定量的抗生素，结果活化状态的野生型就被杀死，保存了缺陷型。在选择抗生素时，细菌可以用青霉素，酵母可用制霉菌素。第12页,共32页，星期六，2024年，5月132．２菌丝过滤法：只适用于丝状真菌，其原理是在基本培养基中，野生型的孢子能发芽成菌丝，而营养缺陷型则不能。因此将诱变处理后的孢子在基本培养基中培养一段时间后，再进行过滤。如此重复数次后，就可以除去大部分野生型菌株，同样达到“浓缩”营养缺陷型的目的。

第13页,共32页，星期六，2024年，5月14具体方法：影印法、点种法、夹层法、限量补充培养法夹层培养法限量补充培养法影印接种法

逐个检出法３营养缺陷型的检出方法第14页,共32页，星期六，2024年，5月15酵母菌的杂交子囊孢子的制备：（以高产率酿酒酵母为例）诱导孢子形成的方法将酿酒酵母菌株于YPD固体斜面上28℃培养48h活化，活化两次后接入产孢培养基，25℃培养3一7天，在显微镜下观察子囊孢子形成情况，计算一个视野内酵母总数和子囊孢子数，并计算产孢率。产孢率(%)=子囊孢子数量/总细胞数注：YPD为酵母膏胨葡萄糖琼脂培养基第15页,共32页，星期六，2024年，5月16子囊孢子分离和单倍体的获得菌株活化后接入产孢培养基，3天后镜检观察，无菌水(2ml)倾于斜面上，用接种环刮下菌体，收集菌悬液于7ml离心管中，6000rpm离心10min收集菌体。0.85%生理盐水悬浮洗涤1~2次，分别加入0.7mlTris一Hcl(pH8.0，0.01M);200ul10%蜗牛酶(终浓度为0.02):l00ul10%琉基乙醇(终浓度为0.01)，120rpm(缓慢振荡)培养16h破子囊壁，使孢子释放。利用孢子比营养细胞耐热特性，采用58℃高温致死处理营养细胞，离心收集孢子，并用Tris一HCI(pH8.0，0.01M)洗涤两次。取适当稀释倍数，涂布于YPD平板上，28℃培养2一3d。第16页,共32页，星期六，2024年，5月17单倍体的鉴定：培养后挑取小菌落，镜检观察是否为单倍体。将获得的疑是单倍体再接入产孢培养基，培养7天左右观察子囊形成，以确定是否为真正的单倍体。有子囊形成者基本确认为二倍体，不形成子囊者基本确认为单倍体。把确定为单倍体的菌株分别保种(YPD斜面、甘油管)。第17页,共32页，星期六，2024年，5月18单倍体交配型的确定单倍体菌株与标准菌株在YPD斜面活化后，分别接种到装有10mlYPD液体培养基的250ml三角瓶中培养，30°C，200rpm/min，24h。取lml待测的单倍体菌株菌液和lml标准菌株菌液接种到新鲜的10mlYPD液体培养基中，30℃，200rpm/min镜检观察哑铃形细胞产生，混合菌液培养过夜后离心(300rpm/min，5min)，菌体沉淀后接种到产孢培养基中培养3一7天，镜检观察有无子囊产生，确定交配型，能与a型标准菌株杂交并且产孢的菌株交配型为α；能与α型标准菌株杂交并且产孢的菌株交配型为a。有性杂交第18页,共32页，星期六，2024年，5月19单倍体杂交与二倍体的检出将a型与α型单倍体菌株混合接种于YPD液体培养基中，30℃摇床培养，镜检观察接合子的形成情况。镜检杂交完成后吸取适量菌液，涂布于基本培养基平板，30°C培养。挑取较大的单菌落，在产孢培养基上鉴定菌株的产孢能力，能够产孢的菌株确定是经杂交形成的二倍体菌株，编号保存。第19页,共32页，星期六，2024年，5月20单倍体杂交与二倍体的检出

将a型与α型单倍体菌株混合接种于YPD液体培养基中，30℃摇床培养，镜检观察接合子的形成情况。镜检杂交完成后吸取适量菌液，涂布于基本培养基平板，30°C培养。挑取较大的单菌落，在产孢培养基上鉴定菌株的产孢能力，能够产孢的菌株确定是经杂交形成的二倍体菌株，编号保存。第20页,共32页，星期六，2024年，5月21酵母群体杂交育种方法第21页,共32页，星期六，2024年，5月22高耐性酿酒酵母的杂交育种1.单倍体的制备将酿酒酵母AY-15,M1分别于YEPD液体培养基（见表一）中于28℃培养48h,离心洗涤,弃上清液,将酵母泥接种于微量元素培养基平板上,于25℃培养5d,在显微镜下可以观察到有子囊孢子的形成,收集平板培养基上的菌体。制备菌悬液(106),用2%的蜗牛酶于30℃水浴处理60min,然后于50℃水浴振荡处理10min,杀死二倍体营养细胞,将粘连的孢子打散后第22页,共32页，星期六，2024年，5月23YEPD培养基（酵母浸出粉胨葡萄糖培养基，加入琼脂的又叫酵母膏胨葡萄糖（YPD）琼脂培养基）用于酵母菌的培养配方：表一

第23页,共32页，星期六，2024年，5月24涂布YEPD培养基平板,挑取小菌落点接在生孢培养基上,于25℃培养6d后镜检,不生孢子者为单倍体,将单倍体分别挑至斜面,统一编号,于4℃下保存。2.单倍体接合能力及接合型的鉴定将获得的单倍体菌株分别与标准a型、α型菌株混合培养,与a型菌株形成哑铃形接合子的待测菌株为α型,与标准α型菌株接合的待测菌株为a型,与a型、α型菌株均不接合的为不育型菌株。第24页,共32页，星期六，2024年，5月253.单倍体菌株的筛选取装有麦汁的试管(内装杜氏管),加入无水乙醇,使麦汁中酒精含量为16%,混匀。将AY-15的单倍体菌株分别接入麦汁中,于30℃培养,根据产气情况判断酵母的耐酒精性能,选出耐性好的菌株。然后利用TTC平板进行复筛。菌株点接到TTC平板下层培养基上,于30℃培养2～3d,待菌落长大后,倒入TTC上层培养基,覆盖原有的菌落,在30℃下避光培养2～3h,由菌第25页,共32页，星期六，2024年，5月26

落呈色的深浅判断酵母的产酒精能力,颜色较深的菌落为产酒精性能好的菌株。将M1的单倍体菌株分别接种到装有麦汁的试管中(内装杜氏管,NaCl含量为13%),于30℃培养,以亲本菌株作对照,产气速度快、产气量多的酵母为耐渗性好的菌株。第26页,共32页，星期六，2024年，5月274.单倍体菌株发酵性能的筛选菌株活化后,进行种子培养,然后接入发酵培养基,发酵一段时间后补加10%的葡萄糖。于30℃静置培养,每隔24h测CO2失重。发酵结束后测定发酵液的酒精度和残糖含量。根据产酒精能力选出发酵性能优良的单倍体菌株。第27页,共32页，星期六，2024年，5月285.单倍体杂交及杂交株的检出将a型与α型单倍体菌株混合接种于YEPD液体培养基中,于30℃摇床培养,观察接合子的形成情况,培养20h后收集菌体,涂布YEPD平板,挑取较大的单菌落,在微量元素培养基上鉴定菌株的产孢能力,能够产孢的菌株为二倍体杂交株,编号保存。第28页,共32页，星期六，2024年，5月296.杂交菌株的筛选利用耐酒精和耐渗杜氏管试验对杂交菌株进行筛选。首先将菌株分别接入含有酒精的麦汁中,于30℃温培养,根据产气情况判断酵母的耐酒精性能,选出耐酒精性能良好的菌株。将选出的菌株接入含有氯化钠的麦汁中,于30℃培养,根据菌株的产气情况判断其耐渗性,选出耐渗性能较好的菌株。第29页,共32页，星期六，2024年，5月307.杂交菌株发酵性能检测将筛选得到的菌株活化后,进行种子培养,转入耐盐发酵培养基,于30℃静置培养,每隔24h测CO2

失重,用CO2

失重来衡量酵母的发酵速度。发酵结束后测定发酵液的酒精度和残糖含量,