淋巴细胞表面抗原检测1113硕士班课件

淋巴细胞外表抗原检测--免疫荧光法2021-11-13硕士班2根本概念

所有参与免疫应答以及与免疫应答相关的细胞均被称为免疫细胞。

包括淋巴细胞、单核-巨噬细胞、DC、各种粒细胞、红细胞、肥大细胞、干细胞。3免疫细胞别离方法：根据不同免疫细胞外表标志:FACS、MACS根据细胞理化性质：1〕根据细胞比重差异：自然沉降法、密度梯度离心法、改变细胞密度法2〕根据细胞黏附特性：B细胞黏附于尼龙棉3〕根据细胞对渗透压变化的敏感度：红细胞对低渗敏感淋巴细胞是指在适应性免疫中起关键作用的白细胞，由淋巴器官产生，机体免疫应答功能的重要细胞成分。主要指B淋巴细胞和T淋巴细胞，二者外表抗原受体具有高度多样性，经抗原激发可分化为抗原特异性效应细胞，分别介导体液免疫和细胞免疫。淋巴器官根据其发生和功能的差异可分为：中枢淋巴器官〔又名初级淋巴器官〕：包括胸腺、腔上囊或其相当器官。它们无须抗原刺激即可不断增殖淋巴细胞，成熟后将其转送至周围淋巴器官。周围淋巴器官〔又名次级淋巴器官〕：包括脾、淋巴结等。成熟淋巴细胞需依赖抗原刺激而分化增殖，继而发挥其免疫功能。在此我们将要讨论CD4+

和CD8+

T淋巴细胞检测的方法和意义。2024/6/25淋巴细胞5T淋巴细胞是机体免疫系统中的主要调节及效应细胞，在正常机体内各淋巴细胞亚群相互作用，可通过对抗原识别、处理、递呈引起多种细胞因子同多种细胞之间的网络联系，构成维持免疫功能的生理平衡，维持着机体正常免疫功能。当不同淋巴细胞亚群的数量和功能发生异常时，可导致机体免疫功能紊乱并发生一系列病理变化。因此，Ｔ淋巴细胞亚群的免疫分型能够提供有关患者免疫状态的重要信息。T淋巴细胞2024/6/25早期将T细胞中的CD4+T细胞分为Thl和Th2两个亚群。Thl细胞通过分泌IL-2、、IL-12、IFN-γ和TNF-

α等细胞因子，介导与细胞毒和局部炎症有关的免疫应答，参与细胞免疫及迟发型超敏反响。在抗感染、抗肿瘤反响中发挥重要作用。Th2细胞那么通过分泌IL-4、IL-5、

IL-6、IL-10和IL13等细胞因子，其主要功能为刺激B细胞增殖并产生抗体，促进机体的体液免疫应答。2024/6/25调节T细胞(Treg细胞)也是近年来认识的一种重要的免疫调节细胞，CD4+T细胞在TGF-β单独的诱导下那么而分化成Treg细胞，分泌TGF-β并表达Foxp3，参与免疫的调节。Thl7是一种能产生IL-17却不产生IFN-γ和IL-4的CD4+T细胞，目前的研究证实了TGF-β和IL-6在Thl7细胞分化启动过程中的重要作用。同时，转录因子STAT3和RORγt，在Thl7的分化过程中也起着重要的调节作用。2024/6/25Th1/Th2

亚群及其相互之间的平衡在免疫应答的调节中起着关键的作用，Th1/Th2

平衡的失调与多种疾病的发生开展和预后有着密切的关系。目前已发现许多感染性疾病、自身免疫性疾病、过敏性疾病以及移植排斥反响等都与Th1/Th2

平衡有关。建立稳定有效的细胞内因子检测方法对于准确说明Th1/Th2细胞的作用非常重要。目前检测的主要方法：酶联免疫法、ELISPOT法、荧光定量法及原位杂交等方法。2024/6/25分化抗原cIusterofdifferentiation,CD不同谱系细胞在分化、成熟、活化过程中,出现或消失的细胞外表标志。细胞外表标志通常用单克隆抗体来识别。每个抗体都有指定的CD编号,能被特定抗体识别的特定抗原通常具有相同的编号,例如,被“CD1抗体〞识别的抗原称为“CD1抗原〞。CD4细胞，作为淋巴细胞的一种，是人体中调控免疫系统最重要的枢纽细胞，其数量能够最直接的反响人体免疫功能的状态。CD4细胞检测广泛应用于对人体免疫功能状况的评估，有助于肿瘤、糖尿病、冠心病、艾滋病等疾病的早期发现及临床诊疗2024/6/25人体内的淋巴细胞在光学显微镜下的形态根本是一样的，但其功能各异，对T细胞、B细胞和酝细胞及其有关的亚群的相应外表标志检测，藉以判断机体的免疫水平。一、T淋巴细胞外表标志的检测T细胞外表标志抗体致敏细胞花环法免疫细胞化学法免疫荧光法T细胞亚群检测

2024/6/25T细胞外表标志

T细胞是参与机体细胞免疫反响和在免疫应答反响中起主导调节作用的一组免疫细胞。所有的T细胞均有共同的标志性抗原，不同功能的T细胞亚群又具有各自的标志性抗原。最常用单克隆抗睐鉴定和检测计数T细胞及亚群的外表标志抗体致敏细胞花环法

用相应的抗CD3单克隆抗体吸附于醛化的红细胞(致敏)，当其与受检的细胞混匀后，结合有兰细胞的单抗与待测细胞上的CD3抗原结合形成桥联，由于参加的红细胞多于受检细胞，阳性的受程细胞能与致敏的红细胞结合而形成玫瑰把戏的花环，凡受检细胞周围黏附3个和3个以上红细胞牵为花环形成细胞，计算花环形成细胞与计数淋巴细胞之比。

2024/6/252024/6/25T细胞亚群检测

采用三色标记单克隆荧光抗体标记单个核细胞悬液，用流式细胞仪进行检测分析，可对

T细胞及亚群作出精确分类。2024/6/25免疫细胞定量检测，如T淋巴细胞亚群〔CD3、CD4、CD8等〕检测，能精确观察免疫细胞数值变化，评估免疫状况。通常采用流式细胞仪法，特别针对CD4细胞检测，此方法已被称作“金标准〞。T淋巴细胞亚群检测T淋巴细胞检测免疫细胞活性检测，如T淋巴细胞转化实验，根据淋巴细胞转化程度测定免疫应答功能，但功能检测仍需结合细胞定量检测，结果更可靠。流式细胞仪T细胞外表标志及其亚群T细胞有两大亚群：CD4+CD8+根据具体功能有分不同亚群：TdTiThTcTs受抗原或细胞因子激活就是活化的T细胞不同的活化细胞功能不同：Tc活化后成CTL主要杀伤被病毒感染的细胞或癌细胞，Ts活化主要抑制B细胞产生抗体和其他T细胞的分化，起调节免疫作用，Td活化那么适当多种淋巴因子导致炎症，排除抗原，Th也主要协助其他免疫细胞发挥功能，是免疫应答必不可少的。2024/6/25T细胞外表标志及其亚群

CD3+CD4+CD8-辅助性T细胞〔helpTcell,Th〕CD3+CD4-CD8+细胞毒性T细胞〔cytotoxicTcell,TcorCTL〕CD4+CD25+调节性T细胞〔regulatoryTcell,TrorTreg〕2024/6/2517SmIg、Fc受体、补体受体、EB病毒受体，局部CD分子是B细胞的重要外表标志，其中以SmIg为B细胞所特有，是鉴定B细胞可靠的指标。CD19/CD5分子：可将B细胞区分为B1细胞和B2细胞，B1细胞为CD19和CD5双阳性，而B2细胞仅为CD19阳性，B2细胞为通常所指的B细胞。B细胞外表标志18

人类NK细胞外表标志主要以CD16、CD56来认定，临床将CD3-CD56+CD16+淋巴细胞认定为NK细胞。NK细胞外表标志19FACS2024/6/250.4um40um细胞结构细胞大小细胞粒度DNA含量与细胞周期RNA含量蛋白质含量染色体分析细胞功能细胞外表/胞浆/核的特异性抗原细胞活性细胞内细胞因子酶活性激素结合位点细胞受体细胞凋亡在上述信号根底上的细胞分选流式细胞仪组成液流系统：形成层流系统，聚焦细胞光学系统：产生和收集光学信号电子系统：光信号转化为电信号，进行信号处理25荧光激活细胞别离仪别离法2024/6/25光学系统

激发光学系统包括:-激光器-透镜和反射镜，将激光引导到检测区域收集光学系统包括:滤光片，将产生的光信号引导到对应的光学接收器光学系统

激发光学系统包括:-激光器-透镜和反射镜，将激光引导到检测区域收集光学系统包括:滤光片，将产生的光信号引导到对应的光学接收器悬浮状态的细胞单个流过流动室细胞被激发产生散射光和荧光信号信号被采集转换成数字信号存储于电脑上液流系统光学系统电子系统前向散射光forwardanglelightscatterFALS、FSC、FS光学检测器在入射光的正前方所收集的低角度光信号,与细胞或颗粒的大小和体积有关。侧向散射光sidescatter,SSC光学检测器在入射光的直角处所收集的细胞散射的光信号,与细胞或颗粒的内部和外表结构复杂程度有关,如细胞质颗粒性、膜不规那么性及核形等。2024/6/25荧光强度fluorescenceintensity结合到细胞或颗粒上的荧光素的量。荧光信号的通道数越大提示荧光强度越强。在恰当的条件下,荧光强度与一个细胞和特定荧光素相结合的位点数相关。自发荧光autofIuorescence未染色细胞白身发出的荧光。通常由嘧啶和黄素核苷酸所产生,自发荧光的强度取决于激发光的波长,且随所分析细胞的类型和(或)细胞活化状态而改变。通过特殊的标本处理方法可以降低自发荧光的强度(如用结晶紫孵育)。2024/6/25颜色补偿coIorcompensation由于一种荧光素发射的荧光叠加到其他荧光素发射的波长范围内而造成荧光信号重叠，通过在其他荧光信号中扣除已测定荧光信号的一局部而纠正颜色重叠造成的计数错误。扣除的荧光量是用恰当的单染对照来确定的。被校正的信号反映了单荧光信号的发射情况。设门gate在流式细胞仪显示的象限图上基于一组参数(如荧光对SSC、FSC/SSC等)来确定的所要分析的目的细胞群。对限定区内的目的细胞群通过其他参数(如荧光参数)进一步分析其表达情况。2024/6/25数据采集

三种数据：

-前向散射光FSC

-侧向散射光SSC

-各种荧光散射光FL1，FL2，FL3，FL4当使用激光光源时，在前向方向〔和激光行进的方向相同〕上可用前向散射光接收通道接收到一定量的散射光前向散射光的强度是和细胞或其他检测颗粒的大小、形状密切相关的数据采集-前向散射光当激光光源被使用时，侧向也有一定量的散射光产生，可以用90o

角的侧向散射光检测通道来采集侧向散射光的强度和细胞或其他检测颗粒的颗粒密度、内部复杂程度密切相关数据采集-侧向散射光外周全血细胞散射光双参数点图

颗粒杂质、气泡对检测的影响细胞标记上荧光物质后，这种荧光物质要求特定波长的激发光来激发，同时发出特定波长的光荧光物质被激发以后产生的发射光将由特定的荧光通道来接收特定检测是通过光学滤片和透镜来控制的数据采集-荧光信号荧光强度是和细胞上标记上的荧光染料的量正相关数据采集电压

信号放大方式：log、lin信号类型：A,W,H电压的调节:根据阴性对照管来调节阈值可以以任意参数及多个参数的组合作为阈值大多数样本都可以设定FSC/SSC阈值以下的信号不存储根据阴性对照管来调节目的是将不需要的杂质信号，噪音信号，无用的细胞信号等扣除，使收集到的都是有用信号补偿

补偿方式：任意两个通道之间，可以采用手动或自动补偿。补偿的调节:根据单染对照管来调节数据分析流式数据直方图散点图等高线图密度图三维图统计数据直方图直方图(DistributionHistogram)横坐标代表荧光信号或散射光信号相对强度，单位是对数，可以是线性或对数坐标。纵坐标一般是细胞数。散点图散点图(DotPlot)X坐标为该细胞一参数相对含量，Y坐标为该细胞另一参数的含量，可以将细胞亚群分开。等高线图和密度图三维图统计数据Events百分比平均荧光强度荧光中位值CVSD……数据获取与分析电压阈值补偿获得数据画图设门统计荧光素标记的单克隆抗体采用荧光素直接标记的单克隆抗体(单抗)，称直标抗体。选择直标抗体是淋巴细胞亚群分析的关键步骤,要考虑所选抗体对细胞的反响性。单抗CD45、CD3、CD4、CD8、CD19、CD16、CD56。2024/6/25单抗对细胞的反响性CD45表达于所有白细胞;CD3表达于T淋巴细胞;CD4表达于T辅助/诱导淋巴细胞(CD4+T细胞)和单核细胞;CD8表达于细胞毒T细胞(CD8-T)和NK细胞;CD19表达于B淋巴细胞;CD16表达于NK细胞、单核巨噬细胞、粒细胞和树突状细胞等;CD56表达于NK细胞和细胞毒T细胞。单抗对淋巴细胞亚群的鉴定CD4、CD8、CD16和CD56单抗均不能特异性标记淋巴细胞某一亚群。采用CD45和(或)CD3作为设门抗体,同时兼做质控试剂。CD3+T细胞标记为CD3+,CD4+T细胞标记为CD3+CD4+CD8+T细胞标记为CD3+CD8+B细胞标记为CD3-CD19+NK细胞标记为CD3-CD56+或CD3ˉCD(16+56)+2024/6/25直标抗体常用荧光染料异硫氰酸荧光素(FITC)藻红蛋白(PE/RD1)藻红蛋白偶联物(PECY5)多甲藻叶绿素蛋白(PerCP)藻红蛋白-德州红偶联物(ECD)别藻青蛋白(APC)除别藻青蛋白(APC)外,其他荧光染料均采用488nm的激发光源激发,最大发射波长分别为525nm、575nm、670nm、675nm和613nm。别藻青蛋白(APC)的激发光源为630nm,最大发射波长为660nm。2024/6/25溶血素使用与仪器相匹配的溶血素(内含固定液),并严格按照使用说明和本卷须知进行操作。如果使用没有固定作用的溶血剂(如氯化铵和低渗缓冲液等),染色后标本需要保存在4℃,并在1h内完成上机固定液0.1%-2.0%多聚甲醛或甲醛缓冲液是常用的固定液,用于对感染的标本在分析前进行灭活,能够灭活HIV等病毒的3个-5个对数级的病毒载量。在染色过程中的最后一次离心后,用含有多聚甲醛或甲醛缓冲液(Ph7.0-7.4)处理,4℃保存待测。2024/6/2556流式细胞分析仪1973年BD公司与StanfordUniversity合作开发世界上第一台商用流式细胞仪FACSI。

1980年北京师范大学引进中国第一台流式细胞仪FACSIII。实验应用

流式细胞仪主要有两个最根本的用途：可以定量分析鉴定活细胞外表表达的特异分子，进行特定的活细胞群的别离和纯化。2024/6/25免疫细胞群的分类

静止淋巴细胞之间从其外观形态难以区分，都是以致密的核及少量细胞质组成的小而圆的细胞为特征。然而，这些细胞确是由功能各异的不同细胞亚群所组成，各种细胞群表达各自特殊的外表分子。B淋巴细胞上表达有特异的膜外表免疫球蛋白〔mIg〕，而成熟的T淋巴细胞外表表达特异的CD3分子。T淋巴细胞又可进一步按其表达的不同外表标志细分成不同的亚群，如CD4+CD8-和CD4-CD8+亚群。因此，可由这些特征性的外表标志，将细胞分为不同的群或亚群。2024/6/25免疫细胞的分化发育

免疫细胞分化发育的不同阶段，其外表标志也在不断地发生着变化。如胸腺细胞〔发育过程中的T淋巴细胞〕，在发育的不同阶段从不成熟到成熟，其外表标志经历了从双阴性〔CD4-CD8-〕到双阳性〔CD4-CD8-〕，直到单阳性〔CD4+CD8-或CD4-CD8+〕的过程。正常生理状态下，发育不同阶段的胸腺细胞以一定的比例存在于胸腺中。通过检测这些标志，即可判定某些因素〔基因突变等〕对胸腺细胞发育的影响。2024/6/25

免疫细胞的分子表达

免疫细胞的不同因素的影响下，其表达的分子也会发生变化。通过检测这些分子的变化，可分析细胞功能以及细胞分化状态等。静止的T淋巴细胞不表达或低水平表达CD69分子；而一经活化，其表达CD69分子数量明显增加。可通过检测这些活化标志的变化来判定细胞状态以及研究影响细胞活化状态的因素。2024/6/25器材10ml圆底试管，FACs专用离心管，滴管，吸管血球记数板，盖玻片4℃冰箱，离心机，流式细胞仪试剂抗凝全血、淋巴细胞别离液荧光素标记抗体FACs缓冲液Hanks液2024/6/25操作步骤抗凝全血