产脂肪酶的微生物研究进展

产脂肪酶细菌的筛选与鉴定姓名：范丽萍学号：班级：生09级6班前言1.脂肪酶的简介脂肪酶(Lipase，EC3．1．1．3，甘油酯水解酶)是分解脂肪的酶uJ。在动植物体和微生物中普遍存在，它是一类特殊的酯键水解酶，催化如下反映：甘油三酯+水=甘油+游离脂肪酸。它的另一重要特性是只作用于异相系统，即在油(或脂)一水界面上作用，对均匀分散的或水溶性底物无作用即使作用也极缓慢，因此脂肪酶也可说是专门在异相系统或水不溶性系统的油(脂)一水界面上水解酯的酶。2.微生物产脂肪酶的研究历程脂肪酶是最早研究的酶类之一(见表1)。从1834年兔胰脂肪酶活性的报道至如今的微生物脂肪酶已有上百年的历史。微生物发酵法的应用前景要远远大于提取法及化学合成法。如今，黑曲霉、白地霉、毛霉等微生物来源的酶已制成结晶。根霉、圆柱假丝酵母、德氏根霉、多球、，粘质色杆菌等也得到高度提纯，并对它们的理化性质[1]开展进一步研究。早在60年代，假丝酵母[2]、曲霉、根霉等菌产生的脂肪酶相继在日本进入商品生产(见表2)。我国60年代也已开展脂肪酶的研究开发。1967年，中科院微生物所筛选到解脂假丝酵母(Candidalipolytica)AS2．1203并于1969年制成酶制剂供应市场。表1常见的产脂肪酶的徽生物菌名黑曲霉荧光假单胞菌白地霉无根根霉毛霉圆柱假丝酵母巢子须霉德氏根霉多球菌棉毛状酶圆弧青霉粘质色杆菌表2常见商品酶enzymeabbreviationmanufacturerCandidacylindracesCCSigina,amanoAspergillusnigerANAmino,flukaRhisopusdelemarRDamano就微生物脂肪酶而言，虽然在产酶菌株选育、培养条件、酶的性质及工业应用上已研究了几十年，但由于脂肪酶的结构及性质的多样性、酶的不稳定性、底物的水不溶性、酶的来源局限性、提纯困难以及应用范围不广泛等问题，脂肪酶的研究进展及工业应用与蛋白酶、淀粉酶相比要慢得多，窄得多。因此在微生物产脂肪酶方面尚有很大的研究空间，本实验重要就是通过对微生物的培养，筛选出产脂肪酶活力高的细菌。3.微生物产脂肪酶的用途微生物脂肪酶的应用虽不如淀粉酶，蛋白酶广泛，但在许多方面已显示出不可估量的开发潜力。比如脂肪酶食品的加工、乳制品的生产以及在食品添加剂的工业生产中都有着不可估量的价值[1]。又比如脂肪酶在纺织物的应用方面[2]也具有一定的奉献。4.国内外微生物脂肪酶的最新研究进展[3]微生物脂肪醇是一种重要的工业酶类，也是当前国内外研究的热点。（1）在食品工业中的应用脂肪酶现已用于奶制品，如奶酪、奶油和人造黄油的增香。由于奶制品中的香味是牛奶中的脂肪、蛋白质和乳糖代谢的产物，因此，脂肪酶和蛋白酶被广泛地用于加快奶酪的熟化和香味的产生。用脂肪酶解决过的奶制品比未解决的具有更好的香味和可接受性[4]。除奶制品外，脂肪酶也用于改善稻米和酒精饮料的香味，如在酒精饮料的发酵过程中加入一定量的低温脂肪酶[5]，产品具有类似奶酪的香味。脂肪酶还用于无脂肪肉的生产，如在鱼加工过程中脂肪的去除是用脂肪酶来完毕的。此外，在生面团中加入脂肪酶使三甘酯部分水解而增长单甘酯的含量可延缓腐败，单甘酯和双甘酯的形成也使蛋白的起泡性质得到改善[6]。（2）环境治理方面的应用每年由于各种因素排入海中的石油达200万t，如不及时解决，不仅会导致鱼类的大量死亡，并且石油中的有害物质也会通过食物链进人人体。人们用品有脂肪酶及其它成分的复合制剂解决海中的石油，可以将石油降解成适合微生物的营养成分，为浮在油表面的细菌提供优良的养料，使得分解石油的细菌迅速繁殖，以达成快速降解石油的目的。脂肪酶生物技术应用于被污染环境的修复以及废物解决是—个新兴的领域。石油开采和炼制过程中产生的油泄漏，脂加工过程中产生的含脂废物以及饮食业产生的废物，都可以用不同来源的脂酶进行有效的解决。酶法生产生物柴油[7]日益受到人们的青睐，可运用餐饮业废油脂和工业废油脂为原料，变废为宝的同时减少了生物柴油的生产成本[8]。（3）脂肪酶在奶酪、面包中的应用[9]脂肪酶可用于改良食品风味。在适当条件下，脂肪酶生成短链脂肪酸酯、乙醇、丙酮、乙醛、二甲硫醚及低档脂肪酸等风味成分，增强食品香味。如在奶酪生产中，脂肪酶将脂肪降解为游离脂肪酸，游离脂肪酸分解形成有挥发性的脂肪酸，异戊醛，二乙酰，3．羟基丁酮等呈味物质，改善了奶酪风味，并产生特殊香味。脂肪酶还能催化脂肪释放中链脂肪酸产生爽滑感。释放出游离脂肪酸参与化学反映，诱发合成乙酰乙酸、p一酮类酸、甲基酮、香味酯和内酯等香味成分[10]。（4）脂肪酶在生物传感器中的应用用脂肪酶的催化特性研制生物传感器逐渐受到关注。固定在pH或氧化电极的脂肪酶联合葡萄糖氧化酶可作为脂质生物传感器，测定甘油三酯、血胆固醇含量。（5）脂肪水解方面的应用水解反映是指脂肪酶催化脂肪或酯，将其水解为脂肪酸和甘油或醇。脂肪酶作为生物催化剂可催化由不同底物出发的水解反映，运用脂肪酶水解油脂的能力可获得重要的轻化工原料脂肪酸和甘油。用于这种目的脂肪酶[11]涉及来自Candidarliosa，Pseudomonashuorescen和蓖麻种子(castorbean)等的脂肪酶研究。水解的底物涉及各种植物油，如大豆油、蓖麻油、橄榄油等；动物油如牛脂、羊脂和鱼油及各种油的酯类。（6）脂肪酸的提纯方面的应用Hoshino等研制了一种富集n-3多不饱和脂肪酸的三甘酯的生物反映器，运用A．niger和C．rugosa、Brassicanapu岱脂肪酶不与多不饱和脂肪酸(PuFA)，如．R-亚油酸和二十二烷酸作用，而与其它脂肪酸作用使其优先被释放出来的性质，可制备PUFA含量高的甘油酯。用R．arrh／zus水解茴香油制备岩芹酸(顺式一6一十八烯酸)是完全也许的，因它对这种酸具有高选择性。（7）手性化合物合成中的应用脂肪酶催化具有高底物专一性、区域选择性或对映选择性等优点，使其成为有机合成中重要的生物催化剂。脂肪酶催化合成手性化合物的基本类型有两个：（1)前手性底物的反映；(2)外消旋化合物的拆分旧。催化的底物已由传统的前手性或手性醇和羧酸酯扩展到二醇、二酯、内酯、胺、二胺、胺基醇、Ct或B羟基酸，因此，大多数重要的功能有机化合物原则上都可被脂肪酶催化立体选择性地制备。典型的生物催化剂涉及细菌脂肪酶，如P．aeruginosa、P．fluorescens、Pseudomonas、B．cepacia、C．viscosum、Bacillussubtilis、Achromobactersp．、Alcaligenes和Serratiamarcescens以及来自真菌的C．antarcticaB和C．rugosa.5.微生物脂肪酶的前景与展望[12]脂肪酶来源不同，导致结构和性质的多样性、不稳定性，使脂肪酶研究进展较慢。固定化脂肪酶可反复运用，提高酶稳定性、有助于实现工业化生产，减少生产成本。目前，脂肪酶固定化因其经济性和技术可靠性，离产业化尚有相称大的差距，需对脂肪酶载体、固定化技术作进一步研究。此后，脂肪酶研究需生物遗传、生物化工、仪器分析、食品工程等领域的研究人员通力合作，筛选新的工业脂肪酶菌株，以解决工业生产和保护环境问题。实验目的1.掌握产脂肪酶细菌的筛选鉴定方法。2.筛选出产脂肪酶活性高的细菌，将其拟定到种。实验意义1.筛选出的产脂肪酶活性高的细菌，将其用于实际生产中。四．实验器材显微镜载玻片接种环酒精灯高压蒸汽灭菌锅超净工作台热鼓风干燥箱恒温磁力搅拌器离心机热恒温水箱精密电子天平隔水式电热恒温培养箱便携式pH计三角瓶（带棉塞）移液管天平（带砝码）钥匙称量纸三角瓶培养皿涂布器试管游标卡尺接种环五．试剂及药品5.1培养基成分及配制方法1.富集培养基：酵母粉0．2，Na2HPO43．5，K2HP041．5，MgS04·7H200．5，NaCl0．5，橄榄油10．0，pH7．0．2牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏0.3g，蛋白胨1.0g，氯化钠0.5g，琼脂1.5g，水100ml．橄榄油0.05溴甲酚紫在烧杯内加水100毫升，放入牛肉膏、蛋白胨和氯化钠，用记号笔在烧杯外作上记号后，放在火上加热。待烧杯内各组分溶解后，用10%盐酸或10%的氢氧化钠调整pH值到7.2～7.6,再加入15%琼脂，不断搅拌以免粘底。等琼脂完全溶解后补足失水，分装在各个试管里，加棉花塞，用高压蒸汽灭菌30分钟。3.复筛培养基：A.种子培养基：1％蛋白胨，0．5％酵母粉，0．5％橄榄油，0．05％MgSO4·7H2O，0.2％K2HPO4，调pH值至7．0，乳化分装灭菌。B..初始发酵培养基：1％蛋白胨，0．5％酵母粉，1％蔗糖，1％橄榄油，0．2％K2HPO40.05％MgSO4·7H20，0．01％CaCl2，1％吐温80，0．001％FeS04·7H20，调pH值至7．0，乳化分装灭菌4.LB液体培养基酵母膏5g／L，蛋白胨lOg／L，NaCIlOg／L用6mol／LNa2CO3调至pH9．0.5.V—P实验培养基蛋白胨0．5％，葡萄糖0．5％，K2HPO40.05％，pH7.2～7．4。每管分装4～5ml。6.硝酸盐还原实验培养基牛肉膏3g，蛋白胨lOg，NaCI5g，KNO3lg，水1000ml，PH7～7．6硝酸盐显色液：A液：对氨基苯磺酸0．5g，稀醋酸(10％左右)150ml，B液：a一萘胺0．1g，蒸馏水20ml，稀醋酸(10％左右)150ml7.脲酶检测培养基蛋白胨1g，NaCI5g，葡萄糖lg，K2HPO42g，0.2％酚红水溶液6ml，琼脂20g，蒸馏水1000ml，115.C蒸汽灭菌30min后调pH至6．8～6．9使培养基呈橘黄色，微带粉红，20％的尿素过滤灭菌后和冷却至50～55℃的基础培养基混合，使其终浓度为2％，摆成较大斜面。8.葡萄糖氧化发酵实验培养基蛋白胨2g，葡萄糖lOg，1％溴百里酚蓝水溶液3ml(先用95％乙醇溶解后，再加水配成1％水溶液)，NaCI59，KH2PO40.2g，琼脂6g，蒸馏水1000ml，pH7．0～7．2.9.明胶液化实验培养基蛋白胨O．5％，明胶10～15％，pH7．2～7．4，灭菌后用试管分装，培养基高度约为4～5cm.10.甲基红实验培养基蛋白胨O．5％，葡萄糖0．5％，K：HPO。0．05％，pH7．2～7．4。每管分装4～5ml.11.半固体培养基酵母膏0．5％，蛋白栋1．0％，NaCI1．O％，琼脂0．5％，用lmol／LNaOH调至pH7.012.菌体运动性实验培养基蛋白胨0．5％，明胶5～6％。pH7．2～7．4，灭菌后分装试管，培养基高度约为4～5cm。5.2常用用储存液及配制方法(1)lmol／LHCl：取86．2ml浓盐酸加入到900ml蒸馏水中，定容为1L。(2)lmol／LNaOH：称取40．OgNaOH溶于900ml蒸馏水中，定容为1L。(3)6mol／LNa2CO3：称取318．OgNa2CO3，溶于400ml蒸馏水中，完全溶解后用蒸馏水定容为500ml，分装，高压灭菌。(5)0．5％罗丹明溶液：称取0．5g罗丹明溶解在lOOml重蒸水中。(6)橄榄油／聚乙烯醇乳化液：称取1．8g聚乙烯醇，溶于90ml水中，用1mol／LNaOH溶液调至pH9．0，再加入30ml橄榄油，10000r／min搅拌乳化5分钟，使之成为稳定均匀的乳化液(7)革兰氏染色液：结晶紫染色液：称取2．0g结晶紫，0．8g草酸铵溶于20ml95％乙醇中，再加入80ml重蒸水浑匀，静置48h过滤使用。碘液：先用5ml重蒸水溶解2．0g碘化钾，再加入1．0番红复染液：称取0．5g番红，溶于2．5％番红的乙醇溶液20ml与80ml蒸馏水中。（8）溴甲酚紫(1.6%)的配制:溴甲酚紫1.6g溶于100ml乙醇（是95%的乙醇？）中，贮存于棕色瓶中保存备用。用作培养指示剂时，每1000ml培养基中加入1ml1.6%溴甲酚紫。六．实验环节1.土壤的采集本实验是从绵阳师范学院食堂的排污口采集土壤样品。共6份。2.土壤菌悬液的制备及富集降每份土样称取2g，加入到20mL灭活的无菌水3.菌种的初筛将富集培养液用无菌水进行梯度稀释，各取200uL10-5、10-6和10-73个梯度的稀释液涂布于三丁酸甘油酯筛选平板上，28℃下培养2～3d后，挑选有明显水解圈的菌落，平板划线法接种到新的初筛平板上，同样条件下培养2---3d培养基500ml，并加入0.5ml的溴甲酚紫和橄榄油乳化液12ml（橄榄油：20g/L，聚乙烯醇（PVA）为1:3，转速10000r/min,5min或是将2%的聚乙烯醇与橄榄油按体积3:1超声波混匀，121℃湿热灭菌20min）4.菌种的复筛挑取有水解圈的单菌落接种于种子培养基，30℃下200r／min摇床培养24h，按10％体积接种于基础发酵培养基，30℃140r/min摇床培养40h后，无菌操作条件下，挑取筛选的菌株，接种于发酵培养基中，置于5.酶活的测定[14]挑取平板上经复筛后的细菌，接种于LB液体培养基中，30℃原理：脂肪酶在一定条件下将甘油三酯水解，在不同水解阶段可释放出脂肪酸，甘油二酯，甘油单酯及甘油。水解释放出的脂肪酸可用标准碱液滴定，以此表达酶活力。酶活力单位(u)“定义为：在一定条件下，以每分钟分解底物(橄榄油)释放出lumol游离脂肪酸所需酶量定义为1个脂肪酶活力单位，国际单位(1u)，以lu／m1表达。 试剂：(1)反映底物乳化液的制备：称取308聚乙烯醇(PVA)，加900ml水，加热溶解，冷却后用6mol／L氢氧化钠调至pH为9．0，过滤，定容为1000m1．量取上述PVA溶液150ml，加入橄榄油50ml，用高速组织捣碎机搅拌6min，4000r／min，前后各3min，间隔5min，液备用。(2)0.05mol／L甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液的制备：称取1.889甘氨酸，加入约480mL水溶解，用6mol／L氢氧化钠调节pH至9.0，再定容为500ml，备用。需新鲜配置。(3)0.05mol／L氢氧化钠溶液的制备：取4.589固体氢氧化钠溶于lL水中，用邻苯二甲酸氢钾标定，使用时再稀释一倍。(4)1％酚酞作指示剂，95％乙醇作反映终止剂。测定方法：在三角瓶中加入5ml缓冲溶液和4ml乳化液，放入40。C恒温水浴锅中，再加入酶液反映并计时，一定期间(10min或30min)后终止反映，用0.05mol／L氢氧化钠滴定游离出的脂肪酸，同时做空白样(先加终止剂，后加酶液，其余同样品操作)计算：酶活力(U)=(V2-V1)×N／t其中：v2为样品消耗碱的体积(m1)V1为空白消耗碱的体积(m1)t为反映时间(min)N为稀释倍数，这里N=50，50为1mlO.05mol／L氢氧化钠的微摩尔数5.菌种的鉴定与对筛选出来的菌株进行纯培养，然后对其进行形态学上的观测，通过形态特性初步判断所筛选的菌株属于哪一类微生物，然后根据此依据对其进行相应的生理生化等方面的鉴定。其具体过程如下所示：将产脂肪酶活力较高的菌落划线在LB培养基上30℃1..细菌形态的显微观测(1)制片制片要采用干净的载玻片，用接种环挑菌体涂布到载玻片上。操作时需注意接种环的无菌操作，注意菌体量适中。(2)固定涂片后最佳先在室温下自然干燥，然后固定。固定常用高温。手执载玻片一侧，标本面朝上，在火焰外层快速来回通过3～4次。共约3～4s，规定载玻片表面温度不超过60。C，此时以手背皮肤接触，不觉烫为度。放置待冷后染色。(3)染色标本固定以后，滴加结晶紫染色液，使整个标本固定在染色液中。染色时间为1～3min。(4)水洗与干燥染色时间一到，用细小的缓流水将多余染料从标本上洗去，洗净后，将标本置桌上风干，也可用吸水纸轻轻吸去水分。有时也可微微加热，待干后再镜检。(4)显微镜观测菌体形态。细菌的生理生化鉴定1）革兰氏染色[13]A制片制片要采用干净的载玻片，并注意接种环的无菌操作。做斜面菌体时，要防止菌体和水混合不均匀有结团现象，注意菌体量适中。B固定涂片后最佳先在室温下自然干燥，然后固定。固定常用高温。手执载玻片一侧，标本面朝上，在火焰外层快速来回通过3～4次a共约3～4s，规定载玻片表面温度不超过60。C，此时以手背皮肤接触，不觉烫为度。放置待冷后染色。C媒染与染色标本固定以后，滴加结晶紫染色液，使整个标本固定在染色液中。染色时间视标本与染料的性质而定，一般染色时间为2～3min，用水洗。碘液作用1min，水洗，吸干。D脱色与复染A．用95％乙醇或丙酮乙醇溶液脱色，流滴到脱色液为无色，约30秒。B．脱色后需再用蕃红液染色2～3min。E水洗与干燥染色时间一到，用细小的水缓缓流滴将多余染料从标本上洗去。洗净后，将标本置桌上风干，也可用吸水纸轻轻吸去水分。有时也可微微加热，待干后再镜检。(2)过氧化氢酶实验A．接种于LB斜面培养基上，30℃B．滴加3％双氧水于斜面培养基上，若有气泡为阳性。(3)V--P实验A．接种于V—P斜面培养基上于30℃B．培养2、4、9天后观测，若仍为阴性，可适当延长培养时间。C．取培养液和40％氢氧化钠等量混合，加入少许肌酸，lOmin后如培养液显红色，则V—P为阳性，有时需放置更长时间才出现红色反映。(4)硝酸盐还原实验A．将测定菌接种于硝酸盐还原液体培养基中，置室温培养l、3、5天，另两管不接种作对照。B．倒出少许l、3、5天液体培养基，再各加一滴A液和B液。C．如溶液变为红色、橙色、棕色等表达亚硝酸盐存在，为硝酸盐还原阳性；如无红色可再加一滴二苯胺试剂，如呈蓝色则无硝酸盐还原作用，否则按硝酸盐还原阳性解决。(5)脲酶检测实验A.接种于脲酶检测培养基斜面上，于30℃B.分别于2h、4h过夜观测，培养基变桃红色为阳性，不变者为阴性，阴性结果要观测4天。(6)葡萄糖氧化发酵实验A.将灭菌的葡萄糖氧化发酵培养基分装到试管中，然后穿刺接种。B.每株鉴定菌种分别接种4支试管，其中两支试管用通过高温灭菌的凡士林一石蜡油(含2／3的凡士林和1／3的液体石蜡)液封，以隔绝空气。此外两支试管不液封，同时需准备两支未接种的试管，一支用凡士林一石蜡油液封，此外一支不液封，以做空白对照。C.室温培养I、2、3、7、14天观测结果。D.结果检查：a.只有开管产酸变黄的为氧化型。b.开管、闭管均产酸变黄的为发酵型。(7)明胶液化实验A.取培养18～24小时的明胶液化培养基作穿刺接种，于20℃B.培养2、7、10、14和30天的试管，在20℃以下观测菌的生长情况和明胶是否融化。菌生长，明胶表面无凹陷，且为稳定的凝块，则为明胶水解阴性；如明胶凝块部分或所有在20(8)甲基红实验A.接种于甲基红实验培养基，30℃B.培养2、4、9天后观测，若仍为阴性，可适当延长培养时问。c.在培养基中加入一滴甲基红试剂，假如显红色，则为M—R阳性，如黄色则为阴性。(9)菌体运动性实验A.接种针穿刺接种于半固体培养基内，30℃B.培养l、2、3后观测，细菌的运动性可用透射光目测。C.假如细菌只沿着穿刺线生长，则没有运动性。若有细菌(非气泡)存在穿刺线周边，说明细菌有运动性。(10)好氧性测试A.将菌种穿刺接种在半固体培养基内，30℃B.培养3天后观测，细菌的好氧性可以用透射光目测。C.若菌体只在培养基表面和穿刺线上段出现，则属于好氧菌。若菌体生长物在穿刺线上生长良好，属于兼性厌氧菌。假如菌体沿穿刺线向培养基内生长，则属于厌氧菌。参考文献[1]纵伟.董海丽.脂肪酶及其在食品工业中的应用[期刊论文]-安徽农学通报2023．13(15)：14-15[2]张中义.吴新侠.脂肪酶的研究进展[期刊论文](2023)12—0054—03[3]