《猪瘟荧光PCR快速检测技术规范》-（征求意见稿）

1猪瘟荧光PCR快速检测技术规范本文件规定了猪瘟荧光PCR快速检测技术的试剂和材料、仪器设备、样品的采集与处理、操作方法、结果判定和存储。本文件适用于猪瘟快速检测，适用于对临床样本中的猪瘟病毒（Classicalswinefevervirus，CSFV）RNA进行定性检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。农牧发[2019]2号生猪屠宰检疫规程NY/T541兽医诊断样品采集、保存于运输技术规范GB/T27540-2011猪瘟病毒实时荧光RT-PCR检测方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。指基因扩增，细胞内染色体上的某一个基因选择性地拷贝数大量增加的现象。3.2扩增曲线指在分子生物学实验中，通过连续监测反应体系内生物分子的浓度变化，得到的曲线图。4缩略语荧光PCR：荧光聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction）FAM：6-羧基荧光素（6-carboxfluorescein）CSFV：猪瘟病毒（ClassicalSwineFeverVirus）RNA：核糖核酸（RibonucleicAcid）EDTA：乙二胺四乙酸（EthyleneDiamineTetraaceticAcid）DEPC：焦碳酸二乙酯（Diethlpyrocarbonate）5试剂和材料除另有说明，所有试剂均为分析纯，所有试剂均用无RNA酶的容器分装。5.1.1PCR反应液5.1.2阳性对照品5.1.3阴性对照品25.1.4酶混合液5.1.475%乙醇用新开启的无水乙醇和DEPC水配制，-20°C预冷。5.1.5DEPC水去离子水中加入0.1%DEPC，37°C作用1h121±2）°C，高压灭菌15min。5.2材料放血工具、离心管、一次性手套、一次性注射器、抗凝剂（柠檬酸钠：水=1：10）、消毒剂、搅拌棒、编号笔、消毒液容器、拭子等。6仪器与设备6.1核酸提取仪6.2高速台式冷冻离心机6.3冰箱：2~8°C和-20°C以下6.4适用仪器试剂盒适用于ABI7000/7300/7500/7900、ABIStepOnePlus、宏石SLAN-48P/96S、RochelightCycler480、RochelightCycler96、AglientMX3000P/3005P、iCycleriQ、Bio-RadCFX96等荧光定量PCR仪。7样品采集与处理样品采集、保存与运输按照NY/T541执行，样本类型为RNA病毒，且需在提取后尽快检测。7.2采样人员采样人员需经过专业技术机构培训、掌握采样技术的人员实施。7.3样品采集7.3.1全血样品采集生猪样品采集部位为猪耳缘静脉或前腔静脉血液，生猪采集2mL~5mL血液置于采血管（含EDTA抗凝剂）中，密封后冷藏或冷冻保存。7.3.2拭子样品采集用无菌拭子在鼻腔内或口腔内轻轻擦拭并缓慢旋转至少3周，或用无菌拭子轻轻擦拭眼分泌物后，将拭子置于DEPC水中，密封后冷藏或冷冻保存。7.3.3内脏组织样品采集采集适量肝、脾、肺组织样品，并按1：5倍体积加入DEPC水，研磨匀浆，密封后冷藏或冷冻保存。37.3.4粪便样品采集称取适量粪便样品置入无菌保存管中，密封后冷藏或冷冻保存。7.3.5活体样品采集固定活猪的上唇，用开口器打开口腔，用采样枪采取扁桃体样品，用灭活牙签挑至无菌管中，密封后冷藏或冷冻保存。7.4样品处理7.4.1全血样品处理血液混匀后，转入1.5mL灭菌离心管中，直接用于核酸提取。7.4.2拭子样品处理将含有鼻咽拭子或口腔拭子或眼分泌物拭子样品，摇匀，保存管在涡旋震荡仪上充分混合，在4°C下3000rpm离心5min，取上清液，转入1.5mL灭菌离心管中。7.4.3内脏组织和粪便样品处理将含有组织或粪便匀浆液无菌保存管在涡旋振荡仪上充分混合后，在4°C下3000rpm离心15min，取上清液。7.4.4活体组织样品处理取适量样本于研钵或组织匀浆器中充分研磨，3000rpm15min，取上清液。8检测8.1检测方法8.1.1核酸提取在样本制备区进行。按照GB/T27540-2011执行。8.1.2扩增试剂准备在试剂存储和准备区进行。将试剂盒从-20°C冰箱取出，冰浴条件下融化，待其融化完全后，振荡混匀，瞬时离心，并按表1体系，在0.2mLPCR管中配制反应液。表1扩增试剂配制成分体积CSFV-PCR反应液酶混合液总体积20μL8.1.3荧光PCR扩增体系将提取的样本RNA，取5μL上样。8.1.4PCR扩增按如下步骤设置荧光定量PCR仪的程序：表2操作步骤步骤温度循环数150°C5min295°C4395°C40cycle62°C30s（采集荧光步骤）仪器检测通道选择：选择FAM通道（Reporter：FAM）检测CSFV；具体检测通道设置可参照各仪器使用说明。8.2检测结果说明通过检测样本扩增曲线和Ct值组合判定，阳性/阴性，具体数值如下：1、检测质控标准：如果阳性对照品有扩增曲线且Ct值≤30，空白对照的无扩增曲线，则本次试验有效，否则试验无效。2、结果判断：a）如果检测样本有扩增曲线且Ct值≤35，报告为CSFV检测阳性。b）如果检测样本有扩增曲线且35<Ct值<40时，需重新对样本进行检测。若重复检测结果显示有扩增曲