(高清版)GBT 40254-2021 轮枝菌属实时荧光PCR检疫鉴定方法

ICSCCS65.020.01GB/T40254—2021轮枝菌属实时荧光PCR检疫鉴定方法DetectionandidentificationofVerticilliumNeesusingreal-timePCR国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会IGB/T40254—2021本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。本文件起草单位：中华人民共和国宁波海关、中国科学院微生物研究所、西宁市蔬菜技术服务中心、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国乌鲁木齐海关。1GB/T40254—2021轮枝菌属实时荧光PCR检疫鉴定方法1范围本文件描述了植物病原真菌轮枝菌属实时荧光聚合酶链式反应(PCR)检疫鉴定方法。本文件适用于携带轮枝菌属病菌的土壤、植物及其产品中轮枝菌属病菌的检测筛查。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。SN/T2589植物病原真菌检测规范3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4基本信息轮枝菌属隶属于真菌界(Fungi),子囊菌门(Ascomycota),盘菌亚门(Pezizomycotina),粪壳菌纲(Sordariomycetes)中的小不整球壳科(Plectosphaerellaceae)。5鉴定原理根据轮枝菌属病菌的DNA序列特征及实时荧光PCR原理，应用所设计引物或探针对轮枝菌属病菌进行检测鉴定。6仪器设备和器具、试剂和培养基6.1仪器设备和器具2GB/T40254—20216.2试剂除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。次氯酸钠、液氮、超纯水、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)提取液(2%CTAB,1.4mol/LNaCl,20mmol/LEDTA,100mmol/LTris·HClpH8.0)、Tris饱和酚、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、70%乙6.3培养基马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA):将200g马铃薯去皮，切小块，沸水煮20min后过滤，弃去滤渣，在滤液中加入葡萄糖和琼脂粉各20g,加蒸馏水定容至1L。配成溶液后121℃下灭菌20min。7检疫鉴定7.1样品的采集与处理样品的采集、分离、纯化和培养按照SN/T2589植物病原真菌检疫鉴定方法进行。7.2核酸的制备采用基因组提取试剂盒制备DNA,或采用改良的CTAB提取法，CTAB提取法应符合附录A。7.3DNA纯度与浓度的测定用微量紫外分光光度计测定DNA的纯度与浓度，分别取得260nm和280nm处的吸收值，计算核DNA浓度=50×OD₂60μg/mL用于实时荧光PCR检测的DNA溶液的OD₂60/OD₂s0比值应为1.7～1.9。7.4实时荧光PCR检测实时荧光PCR检测方法应符合附录B。8结果判定以疑似分离物或样品的实时荧光PCR检测结果作为鉴定依据。疑似分离物：阳性对照和空白对照正常，出现典型扩增曲线判定为阳性；无典型扩增曲线判定为阴性。增加DNA用量2倍～10倍再次测试，出现典型扩增曲线，且Ct值≤35,判定为阳性；其余情况判定为阴性。9样品保存与复核9.1样品保存与结果记录保存植物样品应置于2℃~8℃冰箱妥善保存，对检出轮枝菌属病菌的样品应至少保存6个月，以GB/T40254—2021分离到的轮枝菌属病菌应接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)中妥善保存。要有检测阳性结果照片。由指定的单位或人员负责，主要考察试验原始数据记录及实时荧光PCR检测结果等资料的完整性34GB/T40254—2021(规范性)DNA提取方法碾碎。A.4加入1/2体积(300μL)的Tris饱和酚及1/2体积(300μL)的三氯甲烷：异戊醇(24:1),颠倒混A.512000r/min离心10min,取上清液至另一离心管中。A.6可重复A.4至A.5步骤2次～3次，视两相界面处杂质的多少而定。A.7加入等体积三氯甲烷：异戊醇(24:1),轻轻颠倒混匀。A.812000r/min离心10min,取上清液至另一离心管中。A.9向上清液中加入等体积异丙醇，轻轻颠倒混合均匀后于4℃或-20℃冰箱沉淀1h。A.12加50μL无菌水或TE缓冲液(10mmol/LTris·HCl,1mol/LEDTApH8.0)溶解沉淀，—20℃冰箱贮存备用。5GB/T40254—2021(规范性)实时荧光PCR方法B.1引物及探针序列正向引物VF:5'-CTGTCCGAGCGTCGTTTCA-3';反向引物VR:5'-CCACTGCTTTTAAGGGCCTACA-3';探针VP:5'-FAM-TGGCCCGGTGTTGG-MGB-3',探针5'端含有FAM报告荧光染料，3'端含有不发荧光的淬灭基团并具有MGB分子。B.2扩增体系探针VP0.2μmol/L。反应总体积为25μL。将反应体系混合均匀后置于荧光PCR仪中进行反应。以轮枝菌属病菌DNA作阳性对照、不含轮枝菌属病菌的DNA作阴性对照、以无菌蒸馏水作空白对照，每个样品设置3个重复。B.3扩增反应条件注：DNA模板的取量根据DNA的提取浓度纯度而调节。不同仪器可根据仪器要求将反应参数作适当调整。6GB/T40254—2021[1]段维军，郭立新，顾建锋，等.基于COI基因分析的植物病原性轮枝菌条形码评价[J].植物检疫，2013,27(6):41-45.[2]段维军，郭立新，张慧丽，等.进境台湾芹菜上一株变黑轮枝菌的鉴定[J].植物检疫，2012,26(4):30-34.[3]段维军，郭立新，张祥林，等.检疫性轮枝菌及其近似种的鉴定[J].植物病理学报，2013,43(3):274-285.[4]段维军，张慧丽，郭立新，等.ITS片段作为轮枝菌DNA条形码的评价研究[J].植物保护，2013,39(4):72-77.[5]BarbaraDJ,ClewesE.PlantpathogenicVerticilliumspecies:howmanyofthemarethere?[J].MolecularPlantPathology,2003,4:297-305.[6]CameleI,MarconeC,CaponeroA,etal.FirstreportofVerticilliumdahliaecausingver-ticilliumwiltofSolanumaethiopicuminItaly[J].PlantPathology,2006,55(4):581-581.[7]CollinsA,OkoliCAN,MortonA,etal.IsolatesofVerticilliumdahliaepathogenictocru-cifersareofatleastthreedistinctmoleculartypes[J].Phytopathology,2003,93:364-376.[8]DebodeJ,VanPouckeK,FrancaSC,etal.DetectionofmultipleVerticilliumSpesoilusingdensityflotationandreal-timepolymerasechainreaction[J].PlantDisease,2011,95(12):1571-1580.[9]InderbitzinP,DavisRM,BostockRM,etal.TheascomyceteVerticilliumlongisporumisahybridandaplantpathogenwithanexpandedhostrange[J].PLoSONE,2011,6(3):18260.[10]GiraldoA,CrousPW.InsidePlectosphaerellaceae[J].StudiesinMycology,2018,92:227-286.[11]KirkPM,CannonPF,MinterDW,etal.Dictionaryofthefungi[M].Wallingford:CA-BI,2008:724.[12]KlostermanSJ,AtallahZK,ValladGE,etal.Diversity,pathogenicity,andmanagementofVerticilliumSpecies[J].AnnualReviewofPhytopathology,2009,47:39-62.[13]NeesvonE,GottfriedC.DasSystemderPilzeundSchwamme[M].Würtzburg,Germa-ny:StahelschenBuchhandlung,1817.[14]PramateftakiPV,AntoniouPP,TypasMA.ThecompleteDNAsequenceofthenuclearribosomalRNAgenecomplexofVerticilliumdahliae:intraspecificheterogeneitywithintheintergenicspacerregion[J].Fungalgeneticsandbiology,2000,29(2):19-27.[15]QinQM,ValladGE,WuBM,etal.PhylogeneticanalysesofphytopathogenicisolatesofVerticilliumspp.[J].Phytopathology2006,96(6):582-592.[16]ZareR,GamsW,Starink-WillemseM,SummerbellRC.Gibellulopsis,asuitablegenusforVerticilliumnigrescens,an