生物化学：蛋白质的重要性质

第四节蛋白质的重要性质一、蛋白质的两性解离与等电点蛋白质中可解离的酸性基团∶Glu的γ-COOHAsp的β-COOHTyr的酚羟基Cys的自由巯基碱性基团∶Lys的ε-NH2His的咪唑基Arg的δ-胍基蛋白质的等电点∶蛋白质溶液在特定的pH下，其分子所带的正、负电荷相等，净电荷为零，这一pH称为(用pI表示)。蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。根据蛋白质两性解离和等电点的性质发展起来的蛋白质纯化方法有∶等电点沉淀法蛋白质电泳（电荷的性质、强弱和多少）离子交换法（电荷的性质、强弱和多少）pH>PIpH=PIpH<PI等电点沉淀法电泳法

蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术,称为电泳。等电点聚焦二、蛋白质的胶体性质真溶液的溶质分子的颗粒大小<1nm；胶体溶液中溶质分子的颗粒大小在1-100nm；蛋白质分子的相对分子量在1-100万，其颗粒大小(2-20nm)属于胶体粒子的范围。另外，蛋白质分子表面有许多极性基团，亲水性极强，易溶与水形成稳定的亲水胶体溶液。1、稳定蛋白质胶体溶液的两个因素∶

(1)表面净电荷(在非等电点时)，构成双电层

(2)水化膜+++++++带正电荷的蛋白质－－－－－－－－带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质水化膜酸碱酸碱概念∶

蛋白质胶体溶液的稳定性是有条件的、相对的，若改变环境条件，破坏其水化膜和表面电荷，蛋白质亲水胶体便失去稳定性，发生絮凝沉淀的现象，就称为蛋白质的沉淀作用。蛋白质的沉淀可分为∶不变性沉淀∶用于分离活性的天然蛋白质产品（酶、抗体等）。变性沉淀∶用于生物制品中除去蛋白质。蛋白质的沉淀作用沉淀的方法∶

(1)等电点沉淀法（原理是什么）

(2)盐溶与盐析（分级盐析）盐溶∶在盐浓度很低时，蛋白质的溶解度随着盐浓度的增加而增加，这种现象称为蛋白质的盐溶。

盐析∶在蛋白质溶液中加入高浓度的中性盐后，它与蛋白质胶体粒子竞争水份，使蛋白质胶体粒子表面的水化层破坏而失去稳定性，同时降低了蛋白质与水的亲和力而使蛋白质沉淀的现象。不同的蛋白质的带电性质、分子量不同，水膜厚度不同，故盐析所需的盐浓度也不同。

盐溶（Salting-in）盐溶低浓度中性盐存在的情况下，蛋白质吸附盐类离子： （1）带电层（双电层）使蛋白质分子彼此排斥 （2）蛋白质与水分子间的相互作用加强盐析向蛋白质溶液中加入大量硫酸铵后蛋白质会沉淀析出——盐析（Saltingout）蛋白质分子表面的疏水区域，聚集了许多水分子，盐浓度高时，这些水分子被盐抽出（水化层被破坏），暴露出的疏水区域，它们发生相互作用而沉淀。（NH4）2SO4一般来讲，分子量越大的蛋白质分子，越容易盐析，所需盐浓度也越低。因此，对于不同分子大小的蛋白质，可采用不同的盐浓度进分级沉淀。

常用的盐是∶(NH4)2SO4(3)有机溶剂沉淀法∶ 一些极性的有机溶剂(如乙醇、丙酮等)能破坏蛋白质胶粒的水化层，使疏水基团暴露使蛋白质沉淀。(4)热变性沉淀法∶

蛋白质疏水集团暴露，破坏水化层。(5)重金属盐沉淀法∶ 蛋白质在碱性溶液中带负电，可与重金属离子如Zn+2、Cu+2、Hg+2、Pb+2、Fe+3等作用，产生重金属蛋白盐沉淀。蛋白质分子出水进水小分子溶质2、蛋白质胶体溶液：半透膜不透性蛋白质的膜分离技术利用蛋白质的半透膜不透性，将蛋白质中所含的、可以通过半透膜将低分子物质(如盐等小分子)分离的技术称为膜分离技术(或膜过滤技术)。

膜分离技术可分为∶透析和超滤（1）透析：利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。（2）超滤：应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。直流过滤模式去除机制-深度孔径拦截污染物膜产品滤出液产品进料液切向流过滤模式去除机制-表面孔径拦截进料液滤出液回流液

膜

产品

产品污染物超滤膜结构1、概念∶

天然的蛋白质在受到某些物理或化学因素的作用，有序的空间结构被破坏，致使生物活性丧失，并伴随发生一些理化性质的异常变化，但一级结构并未破坏，这种现象称为蛋白质的变性作用（proteindenaturation）。三、蛋白质的变性作用天然状态，有催化活性尿素、β-巯基乙醇去除尿素、β-巯基乙醇非折叠状态，无活性2、蛋白质变性的可逆性∶可逆变性∶是指使蛋白质变性的条件解除后，能恢复其原有性质。不可逆变性∶是指使蛋白质变性的条件解除后，仍不能恢复其原有性质。复性∶去除变性因素后，变性蛋白恢复原来的空间结构，恢复生物活性的现象为复性（renaturation）3、蛋白质的变性因素∶物理因素∶热、高压、UV、X-射线、超声波、表面张力、搅拌、剧烈振荡、研磨化学因素∶酸、碱、有机溶剂、重金属盐、脲、胍、表面活性剂、生物碱。4、变性蛋白质的性质∶

变性蛋白质与天然蛋白质性质的差别主要表现在∶

(1)理化性质的变化 如：旋光性改变、粘度增加、光吸收性质增加、失去结晶能力、溶解度下降、易发生凝聚和沉淀。

(2)生化性质的变化 变性后的蛋白质易被酶水解。

(3)生物活性丧失

这是蛋白质变性的重要标志。5、蛋白质变性机理的应用

（1）利用变性：酒精消毒高压灭菌 （2）防止变性：低温保存生物制品 （3）取代变性：乳品解毒(用于急救重金属中毒)四、蛋白质的变构作用

对于具有四级结构、含有亚基的蛋白质来讲，当一个亚基的构象发生变化，而引起其余亚基和整个蛋白质分子构象、性质和功能发生改变的作用称为蛋白质的变构作用(或称别构作用allostericeffect

)。

如∶血红蛋白的变构作用五、蛋白质的沉降作用（自学）∶1、概念∶

蛋白质在离心力场中，由于其比重大于水，而下沉，这就是蛋白质的沉降作用。60000~80000转/分重力60万～80万倍2、蛋白质的沉降常数(沉降系数)∶不同的蛋白质由于其分子大小不同，在一定的离心力场中沉降的速度也不同。沉降的速度是蛋白质在单位时间内下沉的距离，即v=dx/dt。沉降常数(s小写)∶单位引力场中沉降分子的下沉速度。它表示沉降分子的大小特性。

s=v/ω2x沉降常数是蛋白质的特征性常数，它反应蛋白质分子的大小。由于已知的蛋白质分子的沉降常数在1×10-13～200×10-13秒之间，当蛋白质浓度为0时，沉降常数为1×10-13，故将1×10-13

用1个Svedberg单位表示(简写为1S，大写)。蛋白质的相对分子量与沉降常数的关系是∶

M=RTs/D(1-νρ) M∝s

D：扩散系数；

ν：蛋白质的偏微比容（0.74cm3/g）；

ρ：溶剂的密度六、蛋白质的水解反应∶完全水解产物是氨基酸。不完全水解产物可以是胨、小肽、二肽和氨基酸。七、蛋白质的颜色反应∶

1、一般颜色反应：

氨基酸所具有的颜色反应一般情况下蛋白质都有。一些氨基酸的R基团具有特殊地颜色反应：

米伦反应红色酚基 黄色反应黄色苯基 酚试剂反应蓝色酚基、吲哚基 坂口反应红色胍基2、特殊颜色反应——双缩脲反应两个以上肽键（双缩脲）在碱性溶液中与硫酸铜结合。生成紫红色或红色物质。八、蛋白质的紫外吸收性质∶一般蛋白质在280nm波长具有最大吸收，这是由于蛋白质分子中的Trp、Tyr和Phe存在共轭双键的缘故。蛋白质的分子量一般在一万至一百万道尔顿之间（1道尔顿＝1×C12绝对质量/12≈1.66×10-27千克）常用的测定方法有: 1、根据化学组成测定最低相对分子质量

2、渗透压法测定相对分子质最

3、蛋白质的扩散和扩散系数

4、沉降分析法测定相对分子质量

5、凝胶过滤法测定相对分子质量

6、聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子质量第五节蛋白质相对分子质量的测定1、凝胶过滤法原理：将具网状结构的葡聚糖凝胶装柱，对分子量不同的蛋白质，由于进入孔径程度不同而走不同的历程，从而有不同的洗脱体积。凝胶法主要适于球状蛋白分子测量2、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术,称为电泳。

SDS：十二烷基硫酸钠；CH3(CH2)11OSO3Na

聚丙烯酰胺凝胶——具网状结构。十二烷基硫酸钠原态蛋白质变性磺酸基极性亲水烷基亲油（蛋白质疏水区）原态蛋白质原理

样品中加入巯基乙醇和SDSSDS破坏Pro分子的氢键和疏水作用，并与之形成Pro-SDS复合物(SDS:Aa=1:2)含-SH的还原剂，打开Pro分子二硫键结果导致：复合物带大量负电，不同Pro电荷密度相同球状Pro变成雪茄状，长轴∝MW电泳迁移率仅与MW（长轴）有关聚丙烯酰胺凝胶电泳Pro胶体粒子在静止溶液中：扩散浮力重力因重力F=mg很小，沉降1cm需3.5～几年超离心法原理：

增加离心力强度(6万转以上），不同分子量的Pro颗粒就会以不同的速度沉降下来。用特殊的光学系统可观察到沉降界面，从而得Pro沉降速度。超离心沉淀