高效液相色谱HPLC基本原理

一、概述高效液相色谱(HPLC)是以溶剂液体为流动相的色谱方法。按照固定相不同可分为：液液分配色谱；吸附色谱(液固色谱)；离子交换色谱；尺寸排阻色谱(凝胶渗透色谱)。早期液相色谱，包括Tswett的工作，都是在直径1~5cm,长50~500cm的玻璃柱中进行的。为保证有一定的柱流速，填充的固定相颗粒直径多在150~200m范围内。即使这样，流速仍然很低(<1mL/min)，分析时间仍然很长！当加压增加流速(真空或空气泵)时，尽管分析时间减少，但柱塔板高度Hmin也相应增加了！或者说柱效下降了。为了解决分析时间及柱效问题，人们认识到：最为有效地增加柱效的唯一方法是减小填充物的粒径（3~10m）！直到60年代，由于在高压下操作的液压设备、高效固定相以及高灵敏检测器的出现及发展，才彻底解决了分析时间及柱效的问题。即所谓的高效液相色谱技术才真正得到广泛应用。2021/5/911）高效液相色谱与经典液相色谱方法的比较高速：HPLC采用高压输液设备，流速大增加，分析速度极快，只需数分钟；而经典方法靠重力加料，完成一次分析需时数小时。高效：填充物颗粒极细且规则，固定相涂渍均匀、传质阻力小，因而柱效很高。可以在数分钟内完成数百种物质的分离。高灵敏度：检测器灵敏度极高：UV—10-9g,荧光检测器—10-11g。2）HPLC与GC的比较分析对象及范围：GC分析只限于气体和低沸点的稳定化合物，而这些物质只点有机物总数的20%；HPLC可以分析高沸点、高分子量的稳定或不稳定化合物，这类物质占有机物总数的80%。流动相的选择：GC采用的流动相中为有限的几种“惰性”气体，只起运载作用，对组分作用小；HPLC采用的流动相为液体或各种液体的混合，可供选择的机会多。它除了起运载作用外，还可与组分作用，并与固定相对组分的作用产生竞争，即流动相对分离的贡献很大，可通过溶剂来控制和改进分离。操作温度：GC需高温；HPLC通常在室温下进行。2021/5/92极性增加不溶于水溶于水非极性离子非离子极性吸附反向分配分配正向分配离子交换尺寸排阻凝胶渗透凝胶过滤分子量3）应用由于HPLC分离分析的高灵敏度、定量的准确性、适于非挥发性和热不稳定组分的分析，因此，在工业、科学研究，尤其是在生物学和医学等方面应用极为广泛。如氨基酸、蛋白质、核酸、烃、碳水化合物、药品、多糖、高聚物、农药、抗生素、胆固醇、金属有机物等分析，大多是通过HPLC来完成的。右图是各种HPLC方法的应用范围及对象2021/5/93二、HPLC仪器

HPLC仪器包括：高压输液装置;

进样系统;

分离系统;

检测系统;

此外还配有梯度淋洗、自动进样和数据处理装置。其工作过程如图所示。2021/5/94He储液瓶分布器过滤2

m高压泵入口检查出口检查脉流消除抽气过滤器反压调节压力计注样阀分离柱到检测器2021/5/951.高压输液系统1）贮液器：1-2L的玻璃瓶，配有溶剂过滤器(Ni合金)，其孔径约2m，可防止颗粒物进行泵内。2021/5/962）溶剂脱气系统：为什么需要脱气防止在检测器中产生气泡，引起噪音。除去氧气的影响。超声波脱气真空加热脱气

He气鼓泡脱气在线脱气机脱气

溶剂通过脱气器中的脱气膜，相对分子量小的气体透过膜从溶剂中除去。2021/5/972021/5/98在线真空脱气和He脱气对保留时间在现性的影响2021/5/993）泵：

对输液泵的要求：密封性好、输液流量稳定无脉动、可调范围宽、耐腐蚀。输液泵种类：恒压型和恒流型。恒压泵(类似于风箱)可迅速获得高压，适于柱的匀浆填充。但因泵腔体积大，在往复推动时，会引起脉动，且输出流量随色谱系统阻力（主要是柱填充物）变化而变化，现已较少使用。恒流型溶剂流量恒定，与柱填充情况无关，使用较多。有机械注射式和机械往复式两种。应用最多的是机械往复式恒流泵(见下图。每分钟往复25~100次，因此脉动小。对流量变化敏感的检测器也会有噪声干扰，此时可连接一脉动阻尼器)。2021/5/910串联泵单元泵原理2021/5/911单元泵工作原理AuthoringDivisionNameFileNameSecurityNotice(ifrequired)Damper阻尼器Seal密封垫Piston活塞杆BallScrewDriveGearOutletBallValve出口单向阀ActiveInletValve入口单向阀Purgevalve冲洗阀2021/5/912溶剂传输系统工作原理往复活塞泵(单向阀)（密封金垫）GoldSealSapphireInsertRubyBallSpringInsert入口出口自溶剂瓶至液相系统2021/5/9134）梯度洗脱装置：在分离过程中逐渐改变流动相组成的装置。如果只有一个泵，可采用低压混合设计（将两种或以上的溶剂按一定比例混合，再由高压泵输出）；如果有两个或以上泵，调节各自的流量，在高压下混合。2021/5/914低压梯度2021/5/915高压梯度2021/5/9162021/5/9172.进样系统进样装置包括两种：1）手动进样器：目前最常用的为六通阀。由于进样量可由样品管控制，因此进样准确，重复性好，如图。装入样品出口进样采样环泵入溶剂进色谱柱2021/5/918ToWasteSampleLoop(FixedVolume)FromToColumnSampleSyringeLoadInjectToColumnPumpFromPumpToWaste手动进样器－六通阀2021/5/9192021/5/9202）自动进样器2021/5/921工作原理2021/5/9222021/5/9233.色谱柱1）对色谱柱的要求：内壁光滑的优质不锈钢柱，柱接头的死体积尽可能小。柱长多为15~30cm，内径为4~5mm(尺寸排阻色谱柱常大于5mm，制备色谱柱内径更大)；2）柱的填充：主要采用匀浆法。根据使用匀浆试剂的性质不同可分为：平衡密度法：即使溶剂密度和填充颗粒密度相近，此时颗粒沉降速度趋于0。常用的匀浆试剂有四氯乙烯、四溴乙烷和二碘甲烷等；非平衡密度法：当采用粘度较大的试剂，如CC4，CH3OH,丙酮，二氧杂环已烷、THF等。填充方法：填充时，按上述方法制作匀浆液，用流动相充满色谱柱及其延长管中，然后将匀浆液倒入匀浆填充器，在较高压力下迅速将其注入色谱柱内。要求填充速度快(防凝聚、沉降或结块)、且无空气进入(影响填充均匀性)。2021/5/9240.090in.0.130in.0.090in.0.170in.SwagelokWatersParkerRheodyneValcoUptight0.090in.0.080in.2021/5/925柱温箱2021/5/9262021/5/9272021/5/9282021/5/9292021/5/9304.检测器液相色谱检测器包括紫外吸收、荧光发射、示差折光和安培检测器等。1）紫外检测器其检测原理和UV-Vis方法一样。只是，此时所采用的吸收池为微量吸收池，通常其光程为2-10mm,体积约为1~10

L。

HPLC分析中，约有80%的物质可以在254nm或280nm处产生紫外吸收。因此该类检测器应用很广。

在选择测量波长时注意：溶剂必须能让所选择的光透过，即所选波长不能小于溶剂的最低使用波长。石英窗接色谱柱UV光电倍增管废液2021/5/931LampOpticalmirrorsGratingDetectorcellSlitBeamsplitter2021/5/932TungstenlampLensDeuteriumlampLenssystemHolmiumfilterDetectorcellOpticalslitGratingDiodeArray2021/5/933TimeWavelengthmsecnmLIGHTSHIFTREGISTERSWITCHVIDEOLINEREADOUTCYCLEPHOTODIODECAPACITORTRANSISTOR2021/5/9342021/5/9352021/5/936TakepeakspectrumComparewithlibraryMatch:998Chlortoluron?250300Wavelength(nm)250300Wavelength(nm)*LibrarySearchingmaybeperformedinanautomatedfashion.SpectralLibraries:Principle2021/5/9372）荧光检测器许多有机物具荧光活性，尤其是芳香族化合物具有很强的活性。荧光检测器是一种选择性很强的检测器，其灵敏度比UV检测器高2~3个数量级。2021/5/9382021/5/9393）示差折光检测器原理：利用两束相同角度的光照射溶剂相和样品+溶剂相，利用二者对光的折射率不同，其中一束（通常是通过样品+溶剂相）光因为发生偏转造成两束光的强度差发生变化，将此差示信号放大并记录，该信号代表样品的浓度。为通用型检测器，灵敏度为10-7g/mL。但对温度变化敏感，且不适于梯度淋洗。2021/5/9402021/5/9412021/5/9422021/5/9432021/5/9442021/5/9454）安培检测器由恒电位仪和一薄层反应池（体积为1~5

L）组成。如图。该检测器是利用待测物流入反应池时在工作电极表面发生氧化或还原反应，两电极间就有电流通过，此电流大小与待测物浓度成正比。采用安培检测器时，流动相必须含有电解质，且呈化学隋性。它最适于与反相色谱匹配。但此检测器只能检测具有电活性的物质。接参比电极和对电极接色谱柱Teflon塑料块1cm工作电极(Pt,Au,碳糊)2