工业菌种的分离和纯培养技术（微生物育种技术课件）

工业菌种分离和纯培养技术项目二工业微生物菌种的培养方法①从少量培养→大规模培养②从浅层培养→厚层（固体制曲）或深层（液体搅拌）培养③从固体培养→液体培养④从静止式液体培养→通气搅拌式的液体培养⑤从单批培养→连续培养→多级连续培养⑥从分散的微生物细胞→固定化的细胞集团⑦从微生物细胞→动、植物细胞大规模培养；⑧从野生型菌种→突变株、遗传工程菌株；⑨从单菌发酵→多菌发酵；⑩从低密度培养→高密度培养；⑪从人工控制的发酵罐→到多传感器、计算机在线控制的自动化发酵罐等。微生物培养技术的发展特点：

任务一、实验室培养法（一）固体培养法（二）液体培养法好氧菌的固体培养厌氧菌的固体培养好氧菌的液体培养厌氧菌的液体培养（一）实验室固体培养法1.好氧菌的固体培养试管斜面、培养皿平板、茄子瓶2.厌氧菌的固体培养实验室中培养厌氧菌特殊的培养装置或器皿配制特殊的培养基六种营养要素加入还原剂和氧化还原势的指示剂①高层琼脂柱：培养基中加入还原剂，装入试管中灭菌后，只有表层有一些溶解氧，越是深层，其氧化还原电位势越低，有利于厌氧菌的生长。如韦荣氏管（Veillontube）：长25cm，内径1cm，两端可用橡皮塞封闭的玻璃管。②厌氧培养皿：

Brewer皿：利用凹形皿盖制造狭窄空间，加上还原性培养基达到厌氧环境。

Spray或Bray皿：利用焦性没食子酸+NaOH反应造成无氧环境。③厌氧罐：

常规的不很严格的厌氧技术；对厌氧罐反复抽真空、灌氮气，剩余氧在钯催化剂的催化下，与灌入混合气体中的氢气还原成水而除去，从而形成良好的无氧环境。

④

Hungate滚管技术：严格厌氧技术利用除氧铜柱在350℃下与氧反应来制备高纯度氮，再用此高纯度氮去驱除培养基配制、分装过程中各种容器和小环境中的空气，使培养基的配制、分装、灭菌和贮存，以及接种、稀释、培养、观察、分离、移种和保藏等操作的全过程始终处于高度无氧的环境。从而保证了严格厌氧菌的存活。⑤厌氧手套箱：严格厌氧条件箱内始终充满成分为N2：CO2：H2＝85：5：10（V/V）的气体，并有钯催化剂保证箱内处于高度无氧状态。通过塑料手套进行操作，外界物体进出通过交换室。

（二）实验室液体培养液体培养法：好氧菌：确保培养液中含有较高的溶解氧浓度是关键。试管液体培养；三角瓶浅层液体培养：仅适用于兼性厌氧菌摇瓶培养：又称振荡培养；台式发酵罐：几升至几十升，使用方便厌氧菌：放入厌氧罐或厌氧手套箱中；培养基中加入巯基乙酸、半胱氨酸等有机还原剂。

一般情况下（1.013×105Pa，20℃），氧在水中的溶解度仅为6.2mL／L（0.28mmol／L），这些氧只能保证氧化8.3mg（即0.046mmol／L）葡萄糖，仅相当培养基中常用葡萄糖浓度的1‰。

氧的供应是好氧菌生长、繁殖中的限制因子。提高溶氧速率的具体措施：①浅层液体静止培养；②利用往复式或旋转式摇床作摇瓶培养；③在发酵罐的底部通入加压空气，并用气体分布器使其产生均匀、密集的微小气泡；④对培养液进行机械搅拌，并在发酵罐的壁上设置阻挡装置等。厌氧罐或厌氧手套箱液体培养厌氧菌不必提供额外的培养措施单独放在有氧环境下培养有机还原剂加入能显著降低氧化还原电位的铁丝等巯基乙酸、半胱氨酸、维生素C或疱肉等加入无机还原剂用深层培养或同时在液面上封一层石蜡油或凡士林-石蜡油台式发酵罐实验室培养法固体培养法好氧菌的固体培养好氧菌的液体培养厌氧菌的固体培养厌氧菌的液体培养液体培养法试管斜面培养皿琼脂平板克氏扁瓶茄子瓶高层琼脂柱厌氧培养皿厌氧罐亨盖特滚管技术厌氧手套箱试管液体培养三角瓶浅层液体培养摇瓶培养台式发酵罐严格厌氧任务二、微生物工业培养法（一）工业固态培养法：好氧菌：曲法培养。依制曲容器的形状和规模分为：瓶曲、袋曲、盘曲、帘子曲、转鼓曲、通风曲等。——酱油酿造厌氧菌：堆积培养法。——白酒生产曲根据制曲的容器形状和规模的大小分类瓶曲袋曲（用塑料袋制曲）盘曲（用木盘制曲）帘子曲（用竹帘子制曲）转鼓曲（用大型木质空心转鼓横向转动制曲）通风曲（厚层制曲）机械化程度和生产效率较高的现代化制曲技术，酱油酿造业广泛使用。食用菌制种和培养小曲红曲挂曲（二）工业液体培养法液体培养法：好氧菌：

浅盘培养：早期青霉素与柠檬酸发酵；

深层液体通气培养：大型发酵罐+搅拌。

——糖化酶生产厌氧菌：

液体静止培养法：液体培养基置于发酵罐中，不通气，不搅拌，静置保温培养，简化了工艺，节约了能源。

——啤酒生产大型发酵罐案例：

——细菌接种技术按物理状态不同划分固体培养基液体培养基在液体培养基中加入一定量凝固剂，使其成为固体状态，琼脂含量一般为1.5%-2.0%琼脂含量一般为0.2%-0.7%不加任何凝固剂半固体培养基固体培养基常用来进行微生物的分离、鉴定、活菌计数及菌种保藏

观察微生物的运动特征、分类鉴定及噬菌体效价滴定

用于增菌，大规模工业生产及在实验室进行微生物的研究一、培养基的分类：固体培养基半固体培养基液体培养基按用途不同划分基础培养基鉴别培养基含有一般微生物生长繁殖所需的基本营养物。比如肉汤培养基。选择培养基利用细菌代谢产物不同而使指示剂显色反应不同的原理，鉴别和鉴定细菌。如麦糠凯琼脂培养基。营养培养基在培养基中加入相应的特殊营养物质或化学物质，抑制不需要的微生物的生长，有利于所需微生物的生长。用来将某种或某类微生物从混杂的微生物群体中分离出来。如SS琼脂培养基。在基础培养基中加入某些特殊营养物质制成的一类营养丰富的培养基。如血琼脂培养基。特殊培养基如厌氧培养基。用于厌氧菌的培养。二、接种方法1.斜面接种法用于鉴定和保存菌种。2.液体培养基接种法可观察细菌在培养基中的生长现象或用作生化反应实验3.半固体培养基接种法穿刺接种法，用于保存菌种或观察细菌动力二、接种方法

4.平板划线接种法目的：使混合的细菌呈单个分散生长，形成单个菌落，以便获得纯菌。方法：分区划线法：适用于含菌量较多的标本。连续划线法：适用于含菌量较少的标本。二、接种方法5.涂布接种法：用于测定标本中活菌数和药敏实验细菌接种6.倾注培养法：用于活细菌计数。将上述已接种细菌的培养基置37℃恒温培养箱中孵育18～24h，观察细菌的生长现象。三、具体接种方法接种工具：常用的有接种针、接种环、接种钩、接种圈、接种铲或接种锄、玻璃涂棒等。图－6斜面接种法-1①左手平托两支试管，拇指压住两支试管。外侧是菌种试管，内侧是待接种的空白斜面(两支试管的斜面同时向上)

。右手将棉塞旋松，以便在接种时容易拔出。②右手拿接种环，在火焰上先将环端烧红灭菌，然后将有可能伸入试管的其余部位也过火灭菌。③将两支试管的上端并齐，靠近火焰，用右手小指、无名指和手掌将两支试管的棉塞一并夹住拔出，棉塞仍夹在手中，然后让试管口缓缓过火焰。12④将已灼烧过的接种环伸入菌种试管内。先冷却，而后再用环挑取少许菌种，将接种环抽出并迅速伸入待接种试管底部，在斜面上由底部向上划线。抽出接种环，塞上棉塞将试管插在试管架上，最后再次烧红接种环，则接种完毕。45678斜面接种法-1斜面接种（1）用左手大姆指、食指和无名指夹住菌种试管和待接种和斜面试管，右手拧松棉塞、不取下。（2）右手拿接种环，在火焰上烧灼灭菌，特别是箍处。斜面接种法-2（3）火焰边取下两个棉塞，不能放下；烧灼管口一周。（4）将接种环伸入试管内，冷却后，轻轻挑取少量菌体，立即将接种环抽出。（6）抽出接种环后，烧管口，塞棉塞，接种环灭菌。（5）火焰旁将沾有菌种的接种环迅速伸到斜面培养基的底部，由里向外画蛇形细线，线要画得细些。液体接种和穿刺接种液体接种法(从斜面菌种接入培养液)：用接种环挑取斜面菌种送入培养液中，使环在液体表面与管壁接触轻轻研磨，将环上的菌种全部洗入培养液中，取出接种环塞上棉塞。将试管轻轻撞击手掌使菌体在培养液中均匀分布。最后将接种环烧红灭菌。穿刺接种法(从斜面菌种接入(半)固体培养基)：用接种针经火焰灭菌后，挑取少量菌种，垂直地穿入试管固体培养基中心至底部，然后穿刺线缓慢将针抽出，塞上棉塞。烧红接种针灭菌，则接种完毕。四、细菌的生长现象（一）在液体培养基中的生长现象

浑浊生长、菌膜生长、沉淀生长（二）在固体培养基中的生长现象长出菌落

菌苔生长（三）在半固体培养基上的生长现象沿穿刺线生长沿穿刺线扩散生长1、细菌在固体培养基中的生长现象菌落定义：指单个细菌在平板培养基上生长繁殖，形成单一肉眼可见的细菌集团。菌落特征：大小、形状、边缘、颜色、表面、透明度、湿润度、黏度、溶血性。菌苔：指多个菌落融合在一起形成的细菌堆积物。菌落与菌苔菌落菌苔EMB琼脂平板上大肠菌菌落具有金属光泽SS琼脂平板上大肠杆菌为粉红菌落光滑型菌落粗糙型菌落2、细菌在液体培养基中的生长现象均匀混浊：大多数细菌沉淀：少数链状排列的细菌。如链球菌菌膜：结核分枝杆菌、铜绿假单胞菌等专性需氧菌呈表面生长。细菌在液体培养基中的生长现象菌膜菌沉淀对照3、细菌在半固体培养基中的生长现象有鞭毛细菌：在培养基中沿穿刺线并向外扩散生长，穿刺线边缘模糊。无鞭毛细菌：只沿穿刺线生长，穿刺线边缘清晰。细菌在半固体培养基中的生长现象有动力现象无动力现象工业菌种的分离和纯培养技术项目一工业微生物菌种的分离技术任务一无菌技术防止实验操作过程中其被其他微生物污染，其自身也不污染操作环境的技术。实验操作过程：分离、转接、培养纯培养物等。1微生物培养的常用器具及其灭菌培养皿试管三角瓶塞子灭菌（让容器内不含任何生物）2无菌接种操作最常用的基本操作。

要点：在火焰附近熟练操作；在无菌操作箱操作；在无菌操作室（无菌间）操作。接种环接种针无菌吸管移液枪3获得纯培养的方法固体培养基液体培养基固体培养基培养平板（cultureplate）或平板（plate）

菌落（colony）试管

菌苔（lawn）获得获得菌落菌苔液体培养基沉淀生长混浊生长表面生长平板划线分离法稀释法单胞子或单细胞分离法利用选择性培养基分离法任务二纯培养物分离方法稀释法稀释倒平板法:菌悬液稀释—不同梯度的稀释液少许与培养基混合—摇匀—倒培养皿中稀释混合平板法：稀释—培养皿中加入不同梯度的菌悬液1mL—加45℃左右的培养基—摇匀稀释涂布平板法：倒平板----稀释----接种0.1mL—涂布单胞子或单细胞分离法采取显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养的方法。操作技术要求比较高，要用显微操作仪或特制毛细管利用选择性培养基分离法利用选择培养基直接分离根据待分离微生物的特点选择不同的培养条件