氨基酸类药物的发酵生产（发酵制药课件）

氨基酸类药物的发酵生产

氨基酸基本知识的学习

氨基酸的主要理化性质氨基酸纯品均为白色结晶，熔点较高（200～300℃），各种氨基酸均能溶于水，但溶解度不同。所有氨基酸都不溶于乙醚、氯仿等非极性溶剂，而均溶于强酸、强碱中。1、一般物理性质由于空间的排列位置不同，氨基酸有两种构型：D型和L型，组成蛋白质的氨基酸，都属L型。20种氨基酸，除甘氨酸外，其它氨基酸的α-碳原子均为不对称碳原子。可以有立体异构、有旋光性。氨基酸的构型也是与甘油醛构型比较而确定的。从蛋白质酶促水解得到的α-氨基酸，都属于L-型，但在生物体中(如细菌)也含有D-型氨基酸。氨基酸的旋光性和光吸收3.氨基酸是两性电解质同一分子上带有能释放质子的正离子基团和能接受质子的负离子基团。兼性离子本身既是酸又是碱。因此它既可以和酸反应，也可以和碱反应。氨基酸在水溶液中或在晶体状态时，都以兼性离子形式存在。等电点理论的应用A.等电点时，氨基酸的溶解度最小，易沉淀。利用该性质可分离制备某些氨基酸。例如谷氨酸的生产，即将微生物发酵液的pH值调至3.22（谷氨酸的等电点）而使谷氨酸沉淀析出。B.利用各种氨基酸的等电点不同，可通过电泳法、离子交换法等在实验室或工业生产上进行混合氨基酸的分离或制备。氨基酸在结晶形态或在水溶液中，并不是以游离的羧基或氨基形式存在，而是离解成兼性离子。在兼性离子中，氨基是以质子化(-NH3+)形式存在，羧基是以离解状态(-COO-)存在。在不同的pH条件下，两性离子的状态也随之发生变化。PH1710净电荷+10-1正离子兼性离子负离子氨基酸的pK值和氨基酸解离的关系

4.氨基酸的特殊反应

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氨基酸及其衍生物在医药中的应用1.氨基酸的营养价值及其与疾病的关系氨基酸是构成蛋白质的基本单位，它参与体内代谢和各种生理机能活动。健康人靠膳食中的氨基酸或蛋白质获取机体对营养的需求。2.治疗消化道疾病的氨基酸及其衍生物此类氨基酸及其衍生物有谷氨酸及其盐酸盐、谷氨酰胺、乙酰谷酰胺铝、甘氨酸及其铝盐、硫酸甘氨酸铁、组氨酸盐酸盐等3.治疗肝病的氨基酸及其衍生物治疗肝病的氨基酸有精氨酸盐酸盐、磷葡精氨酸、鸟氨酸、天冬氨酸、谷氨酸钠、蛋氨酸、乙酰蛋氨酸、赖氨酸盐酸盐及天冬氨酸等精氨酸还是肝性昏迷禁钠病人的急救用药。蛋氨酸和乙酰蛋氨酸用于慢性肝炎、肝硬化、脂肪肝、药物性肝障碍的治疗。4.用于治疗肿瘤的氨基酸及其衍生物不同癌细胞的增殖需要大量消大量某种特定氨基酸,寻找这些氨基酸的类似物—代谢拮抗剂可能成为癌症治疗的一种有效手段。(1)以氨基酸作为载体的抗肿瘤药物，如苯丙氨酸芥子气，L-缬氨酸、L-谷氨酸、L-赖氨酸与苯二胺氮芥共结合物。(2)利用氨基酸衍生物作为肿瘤细胞所需氨基酸的结构类似物达到抗肿瘤的目的，如S-氨甲酰-L-半胱氨酸。(3)氨基酸衍生物作为酶抑制剂的抗肿瘤药物。如N-磷酸乙酰-L-天门冬氨酸是一个天门冬氨酸转氨甲酚基酶的过渡状况抑制剂，利用这个抑制剂可中断嘧啶核苷酸的合成途径达到抗肿瘤目的。(4)氨基酸衍生物作为中间产物的肿瘤抑制剂。(5)使癌细胞逆转的氨基酸衍生物。现已发现偶氮丝氨酸、E-羟基甘氨酸、N-甲基酪氨酸、N-氮乙基胺基-L-苯丙氨酸等抗肿瘤活性大于自力霉素。

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氨基酸的生产方法（一）蛋白水解法（二）化学合成法（三）酶法（四）直接发酵法（五）前体发酵法（六）氨基酸输液及其配制方法（一）蛋白水解法以毛发、血粉及废蚕丝等蛋白为原料，通过酸、碱或酶水解成多种氨基酸的混合物，经分离纯化获得各种氨基酸的生产方法。目前蛋白质水解分为酸水解法、碱水解法及酶水解法。水解法生产氨基酸的主要过程为水解、分离、精制结晶三个步骤。目前，我国至少有6种氨基酸尚需要用提取法生产，如组氨酸、精氨酸、亮氨酸、丝氨酸、胱氨酸及酪氨酸。（二）化学合成法最大优点是在氨基酸的品种上不受限制，除制备天然氨基酸外，还可用于制备各种特殊结构的非天然氨基酸。合成得到的氨基酸都是DL型外消旋体，必须经过拆分才能得到人体能够利用的L-氨基酸。故用化学合成法生产氨基酸时，除需要考虑合成工艺条件外，还要考虑消旋异构体的拆分与D-异构体的分离，三者缺一都必会影响其应用。现在用合成法制造的氨基酸有DL-丙氨酸、天冬酰胺、蛋氨酸、丝氨酸、色氨酸、苯丙氨酸。兼用合成法的有苏氨酸和缬氨酸。（三）酶法酶法是应用完整的菌体或自微生物细胞提取的酶类制备氨基酸的方法天冬氨酸已于1973年用固定化菌体进行工业规模的生产，这是世界上最早在发酵工业上用固定化菌体的例子。目前，能用酶法生产的氨基酸已有10多种，如：用延胡索酸和铵盐为原料，经天冬氨酸酶催化生产L-天冬氨酸；用L-天冬氨酸为原料，在天冬氨酸-β-脱羧酶作用下生产L-丙氨酸。氨基酸基质微生物产率/（g/L）丙氨酸天冬氨酸Ps.dacunbe200天冬氨酸延胡索酸Enoiniaaerbicda168酪氨酸甲酚+丙酮酸Enoiniaaerbicda62多巴（二羟基苯丙氨酸）儿茶酚+丙酮酸Enoiniaaerbicda55色氨酸吲哚+丙酮酸雷氏变形杆菌915-羟基-色氨酸5-羟基吲哚+丙酮酸雷氏变形杆菌28赖氨酸2-氨基己内酰胺罗伦隐球酵母140酶法生产氨基酸

以糖类和铵盐为主要原料的培养基中培养微生物,积累特定的氨基酸。这些方法成立的一个重要原因是使用选育成的氨基酸生物合成高能力的菌株。（四）直接发酵法野生菌株发酵营养缺陷型突变株发酵氨基酸结构类似物抗性突变株发酵营养缺陷型兼抗性突变株发酵。直接发酵法1、用野生株的方法

分离的野生菌株具备积累产物的特性，可用于直接发酵（产率低）。如谷氨酸发酵。

通过转换发酵，可延伸获得其它产物。主要采用改变培养条件。如谷氨酸发酵中改变铵离子浓度、磷酸浓度，使谷氨酸转向谷氨酰胺和缬氨酸发酵。2、用营养缺陷变异株的方法

这种方法中有用高丝氨酸缺陷株的赖氨酸发酵，有用精氨酸缺陷株的鸟氨酸发酵，还有用异亮氨酸缺陷株的脯氨酸发酵等。谷氨酸棒状杆菌的代谢调节与赖氨酸生产天冬氨酰磷酸天冬氨酸-β-半醛高丝氨酸高丝氨酸磷酸O-琥珀酸高丝氨酸二氢吡啶-2,6-二羧酸赖氨酸苏氨酸异亮氨酸蛋氨酸天冬氨酸12345黄色短杆菌的代谢过程

人工控制黄色短杆菌的代谢过程生产赖氨酸高丝氨酸脱氢酶可以大量积累天冬氨酸中间产物Ⅰ天冬氨酸激酶中间产物Ⅱ甲硫氨酸苏氨酸高丝氨酸赖氨酸人工诱变的菌种不能产生应用营养缺陷性突变株生成氨基酸氨基酸微生物营养缺陷型氨基酸微生物营养缺陷型赖氨酸谷氨酸棒杆菌高丝氨酸缬氨酸谷氨酸棒杆菌亮氨酸苏氨酸大肠杆菌蛋氨酸、缬氨酸鸟氨酸谷氨酸棒杆菌瓜氨酸或精氨酸苯丙氨酸谷氨酸棒杆菌酪氨酸瓜氨酸谷氨酸棒杆菌精氨酸酪氨酸谷氨酸棒杆菌丙氨酸、嘌呤高丝氨酸谷氨酸棒杆菌苏氨酸亮氨酸谷氨酸棒杆菌苯丙氨酸脯氨酸谷氨酸棒杆菌异亮氨酸3、类似物抗性变异株的方法用一种与自己想获得的氨基酸结构相类似的化合物加入培养基内，使其发生控制作用，从而抑制微生物的生长。这样，就可以得到在这种培养基中能够生长的变异株，而这种变异株正是解除了调控机制的，能够生成过量的氨基酸。利用此方法发酵的有:苏氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、组氨酸和精氨酸。抗结构类似物突变

一种氨基酸终产物，在正常的情况下，参与蛋白质合成，过量时可抑制或阻遏它自身的合成酶类。如果这种氨基酸的结构类似物也显示这种抑制或阻遏，但却不能用于蛋白质的合成，那么当用这种结构类似物处理菌株时，大多数细胞将由于缺少该种氨基酸而不能生长或者死亡，而那些对该结构类似物不敏感的突变株，仍然能够合成该种氨基酸而继续生长。

抗结构类似物突变突变株之所以能抵抗这种结构类似物，是因为被该氨基酸（或结构类似物）反馈抑制的变构酶的结构基因或调节基因发生突变，使结构类似物不能与结构发生了变化的阻遏蛋白或酶结合，突破了原有的反馈调节系统，这些突变株就可产生大量的该种氨基酸。这种突变称为抗结构类似物突变。

高丝氨酸脱氢酶例如，在黄色短杆菌的赖氨酸、苏氨酸和蛋氨酸生物合成中，选育抗苏氨酸结构类似物2-氨基-3-羟基戊酸（AHVr）突变株，得到了具有反馈抑制抗性，高丝氨酸脱氢酶活性提高1300倍，能积累14g/L苏氨酸的突变株。氨基酸微生物结构类似物氨基酸微生物结构类似物赖氨酸乳糖发酵短杆菌S--（2-氨基乙基）-L-半胱氨酸（AEC）异亮氨酸黄色短杆菌AHV，2-氨基-4-乙硫丁酸（Eth），2-TA，AEC苏氨酸黄色短杆菌α-氨基-β-羟基戊酸（AHV）缬氨酸谷氨酸棒杆菌AEC苯丙氨酸黄色短杆菌对-氟苯丙氨酸（PFP）鸟氨酸谷氨酸棒杆菌D-精氨酸及精氨酸氧肟酸酪氨酸黄色短杆菌5-甲基色氨酸（5-MT）瓜氨酸黄色短杆菌磺胺胍色氨酸黄色短杆菌AHV精氨酸枯草杆菌精氨酸氧肟酸应用结构类似物抗性突变株生成氨基酸氨基酸微生物营养缺陷型结构类似物赖氨酸乳糖发酵短杆菌腺嘌呤、鸟嘌呤

苏氨酸黄色短杆菌蛋氨酸

苯丙氨酸谷氨酸棒状杆菌酪氨酸

酪氨酸谷氨酸棒状杆菌丙氨酸

色氨酸谷氨酸棒状杆菌苯丙氨酸、酪氨酸PAP，PFP，Yyrhx，

phehx（噻嗯基苯丙氨酸氧肟酸）异亮氨酸黄色短杆菌嘌呤AHV亮氨酸乳糖发酵短杆菌蛋氨酸、异亮氨酸2-噻唑亮氨酸鸟氨酸枯草杆菌精氨酸精氨酸氧肟酸瓜氨酸黄色短杆菌精氨酸硫代异恶唑精氨酸黄色短杆菌鸟嘌呤2-TA高丝氨酸谷氨酸棒状杆菌蛋氨酸、赖氨酸AHV4.应用营养缺陷型和抗性突变株生成氨基酸（五）前体发酵法此法是以氨基酸的中间产物为原料，用微生物将其转化为相应的氨基酸，这样可以避免氨基酸生物合成途径中的反馈抑制作用。目前，这一方法主要用于因不能避开其反馈调节机制，而难以用直接发酵法生产的氨基酸。已成功地用邻氨基苯甲酸作为前体物工业化生产L-色氨酸，用甘氨酸作为前体工业化生产L-丝氨酸。氨基酸前体（中间产物）微生物产率丝氨酸甘氨酸嗜甘油棒状杆菌16色氨酸氨茴酸异常汉逊酵母3色氨酸吲哚麦角菌13蛋氨酸2--羟基-4-甲基-硫代丁酸脱氨极毛杆菌11异亮氨酸α--氨基丁酸黏质赛氏杆菌8

D--苏氨酸阿氏棒状杆菌15（六）氨基酸输液及其配制方法常用的氨基酸输液是由多种结晶L-氨基酸依特定比例混合制成的静脉内输注液。这种输液对病人的蛋白质合成有良好促进作用，用于治疗肝性昏迷、消化道吸收功能障碍引起的低蛋白血症、大面积烧伤、严重创伤及感染等疾患。氨基酸输液的组成和要求有：（1）所有氨基酸均为L-型；（2）必须含8种必需氨基酸和两种半必需氨基酸；（3）必需氨基酸与非必需氨基酸应按一定比例组成；（4）有些输液还需加入山梨醇、木糖醇、维生素、无机离子等以补充能量，提高营养价值和氨基酸利用率。氨基酸输液的配制方法可按如下步骤：（1）取三分之二注射用水加温至90℃，依次投入稳定而难溶氨基酸、搅溶；（2）加入易溶氨基酸及稳定剂（NaHSO3、半胱氨酸）；（3）降温，用10％NaOH调pH4.5～5.5，补足注射用水；（4）加入0.1％～0.2％活性炭脱色30min，过滤；（5）超滤（截留值1～2万），分装，压盖，105℃蒸气灭菌30min，冷却后即为氨基酸输液成品。

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氨基酸的结构与分类一、氨基酸的组成与结构

含有一个碱性氨基又含有一个酸性羧基的有机化合物。其氨基直接连接在α-碳原子上，这种氨基酸被称为α-氨基酸。

肽和蛋白质的构件分子。氨基酸的结构

甘氨酸Glycine

脂肪族氨基酸

甘氨酸Glycine

丙氨酸Alanine脂肪族氨基酸

甘氨酸Glycine

丙氨酸Alanine缬氨酸Valine

脂肪族氨基酸氨基酸的结构

甘氨酸Glycine

丙氨酸Alanine缬氨酸Valine亮氨酸Leucine

脂肪族氨基酸

甘氨酸Glycine

丙氨酸Alanine缬氨酸Valine亮氨酸Leucine异亮氨酸Ileucine脂肪族氨基酸

甘氨酸Glycine

丙氨酸Alanine缬氨酸Valine亮氨酸Leucine异亮氨酸Ileucine脯氨酸Proline

亚氨基酸

甘氨酸Glycine

丙氨酸Alanine缬氨酸Valine亮氨酸Leucine异亮氨酸Ileucine脯氨酸Proline甲硫氨酸Methionine含硫氨基酸

甘氨酸Glycine

丙氨酸Alanine缬氨酸Valine亮氨酸Leucine异亮氨酸Ileucine脯氨酸Proline甲硫氨酸Methionine半胱氨酸Cysteine含硫氨基酸

苯丙氨酸Phenylalanine

芳香族氨基酸

苯丙氨酸Phenylalanine酪氨酸Tyrosine

芳香族氨基酸

苯丙氨酸Phenylalanine酪氨酸Tyrosine色氨酸Trytophan芳香族氨基酸吲哚基团

精氨酸Arginine

碱性氨基酸

精氨酸Arginine赖氨酸Lysine

碱性氨基酸2，6-二氨基己酸

精氨酸Arginine赖氨酸Lysine组氨酸Histidine碱性氨基酸

天冬氨酸

Aspartate

酸性氨基酸

天冬氨酸Aspartate

谷氨酸Glutamate酸性氨基酸

丝氨酸Serine

含羟基氨基酸

丝氨酸Serine

苏氨酸Threonine含羟基氨基酸

天冬酰胺Asnaragine含酰胺氨基酸

天冬酰胺Asnaragine谷氨酰胺Glutamine含酰胺氨基酸氨基酸的分类及特点1.根据极性非极性R基氨基酸：Ala、Val、Leu、ILe、Pro、Phe、Trp、Met共8种，这类氨基酸在水中的溶解度较小极性R基氨基酸（1）不带电荷的极性R基氨基酸

Ser、Thr、Tyr、Asn、Gln、Cys、Gly（2）带正电荷的R基氨基酸Lys、Arg、His（3）带负电荷的R基氨基酸Asp、Glu2.根据溶液中带电状况根据氨基酸在pH=5.5溶液中带电状况酸性：Asp、Glu中性：除酸性、碱性氨基酸除外的其它氨基酸碱性：Lys、Arg、His3.根据侧链的化学结构脂肪族：Gly、Ala、Val、Leu、ILe、Met、Ser、Thr、Asn、Gln、Cys、Lys、Arg、Asp、Glu芳香族：Phe、Tyr、Trp杂环族：His亚氨基酸:Pro4.从营养学的角度

必需氨基酸:指人体（或其它脊椎动物）不能合成或合成速度远不适应机体的需要，必需由食物蛋白供给的氨基酸。

成人必需氨基酸的需要量约为蛋白质需要量的20%～37%。必需氨基酸共有8种：赖氨酸：促进大脑发育，是肝及胆的组成成分，能促进脂肪

代谢，调节松果腺、乳腺、黄体及卵巢，防止细胞退化；色氨酸：促进胃液及胰液的产生；苯丙氨酸：参与消除肾及膀胱功能的损耗；蛋氨酸（甲硫氨酸）：参与组成血红蛋白、组织与血清，

有促进脾脏、胰脏及淋巴的功能；苏氨酸：有转变某些氨基酸达到平衡的功能；异亮氨酸：参与胸腺、脾脏及脑下腺的调节以及代谢；

脑下腺属总司令部，作用于甲状腺、性腺；亮氨酸：作用平衡异亮氨酸；缬氨酸：作用于黄体、乳腺及卵巢。

氨基酸类药物的发酵生产谷氨酸的发酵生产

谷氨酸的发酵生产（一）谷氨酸的种子制备通常谷氨酸发酵的接种量为1％，工业生产上一般采用两级扩大培养的方法来获得所需的菌量。1.斜面活化除节杆菌外，其他三属中有许多菌种适用于糖质原料的谷氨酸发酵。斜面培养一般采用由蛋白胨、牛肉膏、氯化钠组成及pH为7.0～7.2的琼脂培养基，32℃培养18～24h经质量检查合格，即可放入冰箱保存备用。2.一级种子培养：由葡萄糖、玉米浆、尿素、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸铁及硫酸锰组成。pH6.5-6.8。1000ml装200-250ml振荡，32℃培养12h。3.二级种子培养：用种子罐培养，料液量为发酵罐投料体积的1％，用水解糖代替葡萄糖，于32℃进行通气搅拌7-10h。种子质量要求：.无杂菌或噬菌体污染，菌体大小均一，呈单个或八字排列。活菌数为108-109个/ml。（二）发酵工艺控制1.培养基(1)碳源：国内多数厂家以淀粉为原料生产谷氨酸，少数厂家以糖蜜为原料生产谷氨酸，这些原料在使用前一般都需进行预处理。已知所有谷氨酸产生菌株都不含淀粉酶，不能直接利用淀粉，以淀粉为原料进行谷氨酸生产时，必须将淀粉质原料水解成葡萄糖后才能供使用。淀粉水解的方法酸解法（无机酸在高温高压下催化完成）双酶法（酶催化完成糖化过程）酶酸法（酶液化、酸糖化）酸酶法（酸液化、酶糖化）

糖蜜原料

甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜中都含有丰富的生物素。对于生物素缺陷型菌株来说，采用糖蜜作为培养基碳源，细胞膜的谷氨酸通透性差，谷氨酸不能透出细胞膜外，积累量将会减少。以糖蜜作为碳源时，可在发酵对数生长早期向培养基中添加一些对生物素产生拮抗作用的物质（如表面活性剂吐温-60、吐温-40），或添加一些能够抑制细胞壁合成的化学物质（如青霉素），来改善细胞膜的通透性，利于谷氨酸的透出。（2）氮源由于形成谷氨酸需要足够的NH4+存在，而且一部分氨用来调节pH，甚至形成谷氨酰胺，因此，谷氨酸发酵需要的氮源比一般的发酵工业产品多得多。一般的发酵工业碳氮比为100:(0.2～2.0)，谷氨酸发酵的碳氮比为100:(15～30)，当碳氮比在100:11以上才开始积累谷氨酸。在谷氨酸发酵中用于合成菌体的氮仅占总耗用氮的3%～6%，而30%～80%用于合成谷氨酸。碳氮比对谷氨酸发酵影响很大，可通过控制碳氮比促进以生长为主阶段向产酸阶段转化。在长菌阶段，如NH4+过量会抑制菌体生长。在产酸阶段:α-酮戊二酸（NH4+缺乏）←→谷氨酸（NH4+适量）←→谷氨酰胺（NH4+过量）氮源有无机氮源和有机氮源。无机氮如尿素、氨水、碳酸氢铵、硫酸铵、氯化铵和硝酸铵等。有机氮源有玉米浆、麸皮水解液、毛发水解液、黄豆饼粉等。有机氮丰富有利于长菌，因此谷氨酸发酵前期要求一定量的有机氮，通常在基础培养基中加入适量的有机氮，在发酵过程中流加尿素、液氨或氨水来补充无机氮。（3）无机盐磷酸盐：工业生产上可用K2HPO4·3H2O、KH2PO4、Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O等磷酸盐，也可用磷酸。

过高：代谢转向合成缬氨酸。过低：菌体生长缓慢。硫酸镁：硫存在于细胞的蛋白质中，是含硫氨基酸的组成成分。硫参与构成一些酶的活性中心。

钾盐：酶的激活剂，钾含量低长菌体，多产谷氨酸。微量元素一般作为氮源的农副产物天然原料中本身就含有某些微量元素，不必另加。某些金属离子，特别是汞和铜离子，具有明显的毒性，因此，必须避免有害离子加入培养基中。（5）生长因子微生物生长不可缺少的微量有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称为生长因子。生长因子不是所有微生物都必需的，它只是对于某些自己不能合成这些成分的微生物才是必不可少的营养物质。生物素缺陷型的谷氨酸产生菌以生物素为生长因子。谷氨酸发酵最适的生物素浓度随菌种不同、碳源种类和浓度、供氧条件、发酵周期不同而异。在生物素缺陷型菌株发酵谷氨酸的传统工艺中，大量合成谷氨酸所需要的生物素浓度比菌体生长所需要的生物素浓度要低，通常将大量合成谷氨酸所需要的生物素浓度称为菌体生长需要的“亚适量”。受到发酵设备等因素的限制，传统工艺上的生物素浓度一般为5～6μg/L，习惯将此浓度称为“亚适量”。

生物素的来源：氨基酸生产上可以作为生物素来源的原料有玉米浆、麸皮水解液、糖蜜及酵母水解液等，通常选取几种混合使用。例如，许多工厂选择纯生物素、玉米浆、糖蜜这三种物质来配制培养基。各种原料来源及加工工艺不同，所含生物素的量不同。玉米浆含生物素500μg/kg，麸皮含生物素300μg/kg，甘蔗糖蜜含生物素1500μg/kg。（1）温度对谷氨酸发酵的影响谷氨酸产生菌的最适生长温度为30～34℃，其中T6-13菌株比较耐高温。产生谷氨酸最适温度为35～37℃。2.发酵条件控制（2）pH谷氨酸发酵前期，pH变化活跃，pH较高（7.5～8.5），对菌体生长繁殖影响不大，同时有利于抑制杂菌的生长。中后期主要是谷氨酸大量合成时期，在菌体内催化谷氨酸形成的谷氨酸脱氢酶和转氨酶在中性或弱碱性环境中催化活性最高，通常通过流加尿素等措施保持pH7.2～7.4，这样可提高谷氨酸的产量。（2）pH

一般谷氨酸产生菌而言，pH控制在中性或弱碱性有利于谷氨酸的积累。生产中，pH的控制通常是采用流加尿素、氨水或液氨等办法进行。①液氨或氨水添加法：根据pH变化，流加氨水或液氨调节pH，同时作为氮源。氨水作用快，应采用连续流加的方法，最好能够自动控制连续流加。②尿素流加法：是目前国内味精厂普遍采用的方法，优点是由于尿素的分解、利用及pH变化具有一定规律性，容易控制。（3）溶氧对谷氨酸发酵的影响供氧量多少，应根据不同菌种、发酵条件和发酵阶段等具体情况决定。在菌体生长期，供氧必须满足菌体呼吸的需氧量。若菌体的需氧量得不到满足，菌体生长缓慢，菌体密度低；但供氧远远大于需氧，也会抑制菌体生长，影响到谷氨酸生成。在发酵产酸阶段，若供氧不足，发酵的主产物由谷氨酸转为乳酸。如果供氧过量，不利于α-酮戊二酸进一步还原氨基化。（4）流加糖的控制间歇流加法：间歇流加法一般在发酵残糖浓度为30g/L左右时进行第一次流加。连续流加法：有条件的工厂可采用连续流加法，一般在发酵残糖浓度为10～15g/L时，才开始流加糖液，控制流加糖的流量，使发酵残糖浓度维持在10～15g/L。（5）泡沫控制谷氨酸发酵常用的消泡剂有：花生油、豆油、菜油、玉米油、棉籽油和泡敌（聚环氧丙烷甘油醚）以及硅酮等。天然油脂类的消泡剂用量较大，一般为发酵液的0.1％～0.2％（V/V），泡敌的用量为0.02％～0.03％（V/V）。

谷氨酸菌能够在菌体外大量积累谷氨酸，是由于菌体的代谢调节处于异常状态，也就是说，谷氨酸发酵是建立在容易变动的代谢平衡上的，是受多种发酵条件支配的。控制因子发酵产品转换氧气乳酸或琥珀酸（通气不足）←→谷氨酸（通气充足）NH4+α-酮戊二酸（缺乏）←→谷氨酸（适量）←→谷氨酰胺（过量）pHN-乙酰谷氨酰胺（酸性）←→谷氨酸（中性或微碱性）磷缬氨酸（高浓度）←→谷氨酸生物素乳酸或琥珀酸（丰富）←→谷氨酸（缺乏）谷氨酸产生菌的发酵条件与产物的关系

氨基酸类药物的发酵生产谷氨酸的发酵生产

谷氨酸的提取和精制1、等电点法：发酵液加盐酸调至pH4.0～4.5，初育晶2h，缓慢加酸调至pH3.0～3.2，搅拌20h，并降温至5℃，使结晶沉淀，静止沉降6h，虹吸除去上层菌体及细谷氨酸结晶（供进一步分离用），下层沉淀离心得粗谷氨酸（通称麸酸）。如果等电点沉淀时温度控制合适，一次沉淀收率可达80%以上。操作简单周期长，占地面积大。

成品干燥盐酸育晶（2h）起晶中和点（pH4-4.5)静置沉降4-6h离心分离发酵液等电点搅拌pH3-3.22母液湿谷氨酸晶体菌体及细小的谷氨酸晶体直接常温等电点法工艺流程2、离子交换法

可用阳离子交换树脂来提取吸附在树脂上的谷氨酸阳离子，并可用热碱液洗脱下来，收集谷氨酸洗脱流分，经冷却、加盐酸调pH3.0～3.2进行结晶，之后再用离心机分离即可得谷氨酸结晶。

若想得到味精即谷氨酸单钠，还需要将提取的谷氨酸通过转晶、中和、脱色除铁、浓缩结晶以及干燥等工序处理，最后包装就可得到味精成品。

氨基酸类药物的发酵生产谷氨酸的发酵生产

谷氨酸基本知识谷氨酸广泛存在于动植物的机体中，是食品中天然存在的营养成分。其参与许多代谢过程，在人体中有一些特殊的生理作用。谷氨酸能合成其他氨基酸谷氨酰胺能起脑组织的能源作用，它能通过血脑屏障。因此谷氨酸对改进和维持脑机能是必要的。谷氨酸有降低血液中氨中毒的作用。谷氨酸为神经患者的中枢神经及大脑皮质的补剂1.谷氨酸的结构和性质谷氨酸有L和D型之分，只有L型谷氨酸具有生理活性。谷氨酸含有一个碱性基团和两个酸性基团羧基，它可以和酸生成盐也可以和碱生成盐，是两性物质，pI为3.2。COOH—CH2—CH2—CH—COOH

︱NH2α-氨基酸的水溶液遇水合茚三酮生成蓝紫色产物。

现有谷氨酸生产菌主要是棒状杆菌属、短杆菌属、小杆菌属及节杆菌属中的细菌。

2.生产菌种（1）棒状杆菌属(Corynebacterium)

2.生产菌种（2）短杆菌属(Brevibacterium)

（3）小杆菌属(Microbacterium)

（4）节杆菌属(Arthrobacterium)

现有谷氨酸生产菌的主要特征细胞呈棒形或短杆形；革兰氏阳性菌，无鞭毛，无芽孢；不能运动；需氧性的微生物；生物素缺陷型；脲酶强阳性；不分解淀粉、纤维素、油脂、酪蛋白、明胶等；

发酵中菌体发生明显形态变化，同时细胞膜渗透性改变；二氧化碳固定反应酶系强；异柠檬酸裂解酶活力欠缺或微弱，乙醛酸循环弱；α-酮戊二酸氧化能力微弱；柠檬酸合成酶、乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶、谷氨酸脱氢酶活性强；具有向环境泄露谷氨酸的能力；不分解利用谷氨酸，并能耐高谷氨酸，产谷氨酸8%以上。国内谷氨酸生产菌（1）北京棒杆菌（As1.299）突变株：7338、D110、WTH-1（2）天津短杆菌（T6-13）突变株：TG-961、FM-415、S9114、CMTC6282（3）钝齿棒杆菌（As1.542）突变株：B9、F-263生物体内合成谷氨酸的前体物质是a-酮戊二酸，是三羧酸循环(TCA循环)的中间产物，由糖质原料生物合成谷氨酸的途径包括糖酵解途径(EMP途径)、磷酸己糖途径（HMP途径）三羧酸循环、乙醛酸循环、CO2的固定反应等。(1)糖酵解途径（EMP途径）将一分子葡萄糖分解成两分子丙酮酸,并且发生氧化(脱氢)和生成少量ATP。

葡萄糖6-磷酸葡萄糖3-磷酸甘油醛丙酮酸6-磷酸葡萄糖酸5-磷酸核酮糖HMP途径EMP途径(2)戊糖磷酸途径（HMP途径）可以生成酵解途径的中间产物6-磷酸果糖和3-磷酸甘油醛。(3)三羧酸循环（TCA循环）谷氨酸（胞内）转移到胞外草酰乙酸柠檬酸顺乌头酸异柠檬酸α-酮戊二酸琥珀酸延胡索酸苹果酸丙酮酸乙酰CoA乙醛酸+CO2乙醛酸循环中的两个关键酶——异柠檬酸裂解酶和苹果酸合成酶。异柠檬酸脱氢酶

α-酮戊二酸脱氢酶

（4）二氧化碳固定反应由于合成谷氨酸不断消耗a-酮戊二酸，从而引起草酰乙酸缺乏。为了保证三羧酸循环不被中断和源源不断供给a-酮戊二酸，在苹果酸酶和丙酮酸羧化酶的催化下，分别生成苹果酸和草酰乙酸，前者再在苹果酸脱氢酶催化下，被氧化成草酸乙酸，从而使草酸乙酸得到了补充。

（5）乙醛酸循环谷氨酸生产菌三羧酸循环中存在缺陷（丧失a-酮戊二酸脱氢酶氧化能力或氧化能力微弱）。在谷氨酸发酵的菌体生长期，为了获得能量和产生生物合成反应所需的中间产物，需要异柠檬酸裂解反应，走乙醛酸循环途径。使琥珀酸、延胡索酸和苹果酸的量得到补足，这对维持三羧酸循环的正常运转有重要意义。乙醛酸循环途径可看作三羧酸循环的支路和中间产物的补给途径。乙醛酸循环的作用谷氨酸生成期，为了大量生成、积累谷氨酸，最好没有异柠檬酸裂解酶催化反应，封闭乙醛酸循环谷氨酸合成的理想途径在发酵产酸期，EMP所占比例更大，约为74％。生物素充足菌EMP所占比例约为62％；由葡萄糖生物合成谷氨酸的代谢途径3.在谷氨酸发酵的菌体生长期，由于三羧酸循环中的缺陷(丧失a-酮戊二酸脱氢酶氧化能力或氧化能力微弱)，谷氨酸产生菌采用乙醛酸循环途径进行代谢，提供四碳二羧酸及菌体合成所需的中间产物等。2.此代谢途径至少有16步酶促反应。1.谷氨酸生产菌株为生物素缺陷型，生产过程分为菌体生长期和谷氨酸积累期。

4.在菌体生长期之后，进入谷氨酸生成期，封闭乙醛酸循环，积累α-酮戊二酸，就能够大量生成、积累谷氨酸。因此在谷氨酸发酵中，菌体生长期的最适条件和谷氨酸生成积累期的最适条件是不一样的。图4-2谷氨酸发酵工艺图3.发酵生产流程

氨基酸类药物的发酵生产赖氨酸的发酵生产

赖氨酸的发酵生产（一）种子制备赖氨酸发酵一般根据接种量及发酵罐规模采用二级或三级种子培养。斜面种子培养基组成：牛肉膏1%，蛋白胨1%，NaCl0.5%，葡萄糖0.5%（保藏斜面不加），琼脂2%，pH=7.0～7.2。经0.1MPa、30min灭菌，在30℃保温24h，检查无杂菌，放冰箱备用。

一级种子培养基组成：葡萄糖2.0%，(NH4)2SO40.4%，K2HPO40.1%，玉米浆1%～2%，豆饼水解液1%～2%，MgSO4·7H2O0.04%～0.05%，尿素0.1%，pH=7.0~7.2。0.lMPa、灭菌15min。接种量约为5%～10%。培养条件：在l000ml的三角瓶中，装200ml一级种子培养基，高压灭菌，冷却后接种，在30～32℃振荡培养15～16h，转速100～120r/min。二级种子培养基：除以淀粉水解糖代替葡萄糖外，其余成分与一级种子相同。培养条件：培养温度30～32℃，通风比1:0.2m³/（m³∙min），搅拌转速200r/min。培养时间8～11h。（二）发酵工艺控制赖氨酸发酵过程分为两个阶段，发酵前期（约0～12h）为菌体生长期，主要是菌体生长繁殖，很少产酸。当菌体生长一定时间后，转入产酸期。工艺的控制，应该根据两个阶段的不同而异。2.发酵培养基组成不同菌株，发酵培养基的组成不完全相同。（1）碳源由于赖氨酸产生菌株生长较缓慢，初糖浓度不宜过高，一般掌握在80～100g/L；为了提高单位发酵容积的产量，采用高浓度的葡萄糖液流加补充碳源，流加糖液浓度一般为500～600g/L。（2）氮源赖氨酸发酵消耗的氮源要比谷氨酸发酵多，由于液氨价格较贵，为了节省成本，故一部分氮源采用硫酸铵。通常，采用基础培养基添加硫酸铵和发酵过程流加硫酸铵两种方法结合的方式。（3）生长因子目前使用的菌株一般是多种缺陷型菌株，如生物素缺陷型、Hse-结合的菌株，生物素缺陷型、Thr-、Met-结合的菌株，因此必须根据菌株缺陷型的情况，在培养基中添加相应的生长因子。（4）无机盐培养基中无机盐的组成与配比与谷氨酸发酵培养基类似。参数控制

温度：发酵前期32℃，中后期34℃

pH

：6.5～7.5

种龄和接种量：二级种子接种量约2%，种龄8～12h

三级种子接种量10%，种龄6～8h

通风供氧：Lys的最大生成量是在供氧充足、细菌呼

吸充足的时候

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赖氨酸的提取和精制1.氨基酸:代谢主产物赖氨酸，含量7～8g/L；少量其他氨基酸2.菌体:一般含量在15～20g（干重）/L3.培养基残留物:残糖6～20g/L（随原料不同而异），无机离子（如NH4+、Ca2+、Mg2+、K+和一些阴离子，其中NH4+浓度较高。4.色素（一）赖氨酸发酵液的主要性质发酵液的预处理，包括去除菌体和影响提取收率的杂质离子。钙离子一般通过添加草酸或硫酸，生成钙盐沉淀而除去（二）发酵液的预处理（二）发酵液的预处理去除菌体的方法有离心分离法和添加絮凝剂沉淀两种方法。离心分离法采用高速离心机（4500～6000r/min）分离除去，菌体小需反复分离，成本高。添加絮凝剂沉淀法是先将发酵液调节到一定的pH值，加适宜的絮凝剂如聚丙烯酰胺，使菌体絮凝而沉淀，加助滤剂过滤除去。（三）赖氨酸的提取从发酵液中提取赖氨酸通常有四种方法：沉淀法有机溶剂抽提法；离子交换树脂吸附法；电渗析法。目前工业生产均采用离子交换树脂吸附法提取赖氨酸从发酵液中提取赖氨酸常选用强酸性阳离子交换树脂。赖氨酸是碱性氨基酸，等电点（pI）为9.59。在pH=2.0左右能最大程度地被强酸性阳离子交换树脂吸附。pH=7.0～9.0被弱酸性阳离子交换树脂吸附。从发酵液中提取赖氨酸均选用铵型强酸性阳离子交换树脂。（四）离子交换法提取赖氨酸的工艺条件

离子交换法提取赖氨酸可用三柱串联的方式，以提高收率。1.上柱吸附（1）上柱方式上柱方式有正上柱和反上柱两种。2）交换量正向上柱时，一般为每吨树脂可吸附90～l00kg赖氨酸盐酸盐，反向上柱时可吸附70～80kg赖氨酸盐酸盐。流出液pH=5时表明吸附达饱和。（3）上柱流速上柱流速应根据上柱液性质、树脂的性质、柱大小及上柱方式等具体情况决定。应在小柱中进行试验确定合适的上柱流速。一般正向上柱流速大些，可以10L/min的流速吸附；反上柱流速小些。清洗上柱后，需用水洗去停留在树脂层的菌体、残糖等杂质，直至洗涤水清亮，同时使树脂疏松以利洗脱。2.洗脱剂从树脂上洗脱赖氨酸所采用的洗脱剂有氨水、氨水十氯化铵或氢氧化钠等。洗脱剂的浓度对洗脱效果有影响，一般来讲，为了浓缩需要较高浓度的洗脱剂，为了分离只能用适当浓度的洗脱剂。如果洗脱剂浓度太高，达不到纯化的目的。如果洗脱剂浓度太低，洗脱时间长，收集不集中，赖氨酸浓度低。使用氨水洗脱时，一般含量为3.6%～5.4%。如果用5%的氨水洗脱，收集液赖氨酸平均含量可达6%～8%，洗脱高峰段，赖氨酸盐酸盐含量可达15%～16%。洗脱操作及洗脱液收集，采用单柱顺流洗脱，为了使洗脱集中，赖氨酸浓度高，应控制好洗脱液流速。一般比上柱流速慢些，多用6L/min的速度洗脱，可根据柱的大小而异。用茚三酮检查流出液，当有赖氨酸流出时即可收集。一般为pH=9.5～12，前后流分赖氨酸浓度低而铵含量高，可合并于洗脱用氨水中，以提高收得率。（五）赖氨酸的精制1.浓缩与除氨经过离子交换提取的赖氨酸洗脱液，体积较大，赖氨酸含量较低，约为60～80g/L，还含有较多的氨，约为10～15g/L，因此需要进行浓缩和除氨。

（五）赖氨酸的精制1.浓缩与除氨为了收集蒸发出来的氨蒸气，可采用单效蒸发。蒸发的主要工艺条件为：温度70℃以下，真空度0.08MPa左右，加热蒸汽约为0.02MPa。浓缩液浓缩至19～20°Bé（赖氨酸盐酸盐含量约为340～360g/L）放出料液，用浓盐酸调节pH=4.9，再继续浓缩至22～23°Bé。2.赖氨酸盐酸盐的结晶与分离赖氨酸盐酸盐浓缩液放入搅拌罐中，搅拌结晶16～20h，在5℃左右结晶完毕停止搅拌，用离心机分离，用少量水洗晶体表面附着的母液。母液经浓缩、结晶、再结晶，直至不能析出结晶时，将母液稀释，上离子交换柱吸附回收赖氨酸。所得的晶体为赖氨酸盐酸盐粗晶体。3.赖氨酸盐酸盐的重结晶与干燥结晶析出的赖氨酸盐酸盐粗晶体含量约为78%～84%，除含有一定水分（15%～20%）外，还含有色素等杂质，制造食品级和医药级赖氨酸盐酸盐需要进一步精制纯化。

氨基酸类药物的发酵生产赖氨酸的发酵生产

赖氨酸基本知识1.赖氨酸的简介赖氨酸是人和动物营养的必需氨基酸，对机体的生长有重要的影响，且在八种必需氨基酸中是唯一的仅L型成分才能有效利用的基本氨基酸。广泛应用于营养食品、食品强化剂、饲料及医药等方面。

赖氨酸广泛存在于动物蛋白质中，最初赖氨酸的生产是用酸水解酪素，经分离谷氨酸后制得，其后又从血粉中提取（猪血粉中赖氨酸含量约9%～10%），但这种方法，工艺比较复杂，产量受到限制。1960年以来，日本用营养缺陷型的谷氨酸菌株直接发酵生产赖氨酸，其产量不断扩大。20世纪90年代我国广西赖氨酸厂开始生产医用级赖氨酸，其产品已被一些药厂用于制备氨基酸大输液和赖氨酸与维生素及葡萄糖酸钙等复合的口服制剂。目前，国家食品药品监督管理局已批准的L-赖氨酸及其复合药有3种：①L-赖氨酸盐酸盐颗粒剂；②复方赖氨酸颗粒剂；③盐酸赖氨酸注射液。2.赖氨酸的性质赖氨酸的化学名称为2，6-二氨基己酸具有不对称的α-碳原子，故有两种光学活性的异构体。游离的赖氨酸易吸收空气中的二氧化碳，故制取结晶比较困难。

一般商品都是赖氨酸盐酸盐的形式。赖氨酸含有α-氨基及ε-氨基，只有在ε-氨基为游离状态时，才能被动物机体所利用，故具有游离ε-氨基的赖氨酸称为有效氨基酸。故在提取浓缩中，要特别注意防止有效赖氨酸受热破坏而影响其使用价值。3.生产菌种赖氨酸的生产方法有抽提法、化学合成法、酶法以及发酵法