微生物发酵制药技术基础（发酵制药课件）

培养基的选择微生物发酵制药技术基础培养基的类型和用途（一）按来源合成培养基:原料化学成分明确、稳定实验室范围作为有关营养、代谢、分类鉴定、生物测定及选育菌种、遗传分析定量研究工作天然培养基:采用天然原料（动植物组织或微生物的浸出液、水解液等物质）原料来源丰富(大多为农副产品)、营养丰富，价格低廉、适于工业化生产；组分复杂，不易重复，不加控制会影响生产稳定性。半合成培养基：天然成分+纯化学试剂M培养基(1L)：Na2HPO46g，KH2PO43g，NaCl0.5g，NH4Cl1g，MgSO4.7H2O0.5g，CaCl20.011g，葡萄糖2-10,pH7.0YPS培养基：酪蛋白胨10g，酵母提取物5g,NaCl10g，PH7.2培养大肠杆菌常用两种培养基（二）按状态1、固体培养基适合于菌种和孢子培养和保存，也广泛应用于有子实体的真菌类。常用麸皮、大米、小米、谷壳和琼脂等，有的还另加其他营养成分。（二）按状态2、半固体培养基即在配好的液体培养基中加入少量琼脂，一般用量为0.5-0.8%，培养基即呈半固体状态。主要用于：鉴定菌种，观察细菌运动特征及噬菌体的效价滴定等。（二）按状态3、液体培养基80-90%是水，内含可溶或不溶营养成分，是发酵工业大规模使用的培养基，有利于氧和物质传递。供菌种繁殖孢子用。要求：能使菌体迅速生长，产生较多优质的孢子，不易引起菌种发生变异。基本配制要求：营养不要太丰富(特别是有机氮源)，否则不易产孢子。所用无机盐的浓度要适量，不然也会影响孢子产量和颜色。注意培养基的pH和湿度。

1.孢子培养基（三）按用途常用的孢子培养基有：麸皮培养基、小米培养基、大米培养基、玉米碎屑培养基和用葡萄糠、蛋白陈、牛肉膏、食盐等配制成的琼脂斜面培养基。大米和小米常用作霉菌孢子培养基，因为它们含氮少，硫松、表面积大，所以是较好孢子培养基。2.种子培养基目的：扩大培养增加细胞数量；培养高活力细胞；加速细胞分裂或菌丝生长。特点必须有较完全和丰富的营养物质，特别需要充足的氮源和生长因子；各种营养物质的浓度不必太高；供孢子发芽生长用的种子培养基，可添加一些易被吸收利用的碳源和氮源；成分还应考虑与发酵培养基的主要成分相近。3.发酵培养基目的：供菌种生长、繁殖和合成产物用。除菌体生长所必需的元素和化合物外，还要有产物合成所需的特定元素、前体和促进剂等。提供合成微生物细胞和发酵产物的基本成分利于减少培养基原料的单耗利于提高培养基和产物的浓度以提高生产能力利于提高产物合成的速度，缩短发酵周期减少副产物的形成便于分离纯化原料低廉，质量稳定，取材容易原料减少对通气搅拌的影响，提高氧利用率，降能耗利于产品分离纯化，减少产生三废物质发酵培养基选择提供必要的营养成分配制合适的浓度主成分和其他成分的配比避免产生微生物不能利用的物质或形成沉淀注意代谢调节物的影响控制合适的pH添加有关前体物质和诱导物：一些酶的发酵生产需加入诱导物才能合成。阻遏物或抑制剂的影响金属离子的影响：檬酸发酵中铁、锰和锌离子都能明显影响产量；钴离子对葡萄糖异构酶的发酵是必需的，发酵培养基设计和注意事项pH的控制方法①可以在微生物培养过程中加入酸或碱或流加某些营养物质调节培养基的pH,配制培养基时考虑所用营养物质的组成成分。②注意有些营养物质被利用后培养基的pH变化情况。③在培养基中添加具有一定缓冲能力的物质作为营养物。如以磷酸盐作为磷的成分；避免使用容易产生生理酸性或碱性物质使培养基pH波动太大的物质。（四）根据主要成分或使用目的分基础培养基：含有一般微生物生长繁殖所需的基本营养物质的培养基增殖培养基：适合某种微生物生长而不适合其他微生物生长，从而达到从自然界分离这种微生物的目的。鉴别培养基：根据微生物能否利用培养基中某种营养成分，借助指示剂的显色反应，以鉴别不同种类的微生物。如：伊红美蓝培养基鉴别大肠杆菌选择培养基：在培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要菌的生长，而促进某种需要菌的生长。培养基的选择微生物发酵制药技术基础培养基的选择方法根据微生物的特点选择培养基液体和固体培养基的选择根据生产实践和科学试验的不同要求选择从经济效益方面考虑选择生产原料

用于大规模培养的微生物主要有细菌、酵母菌、霉菌和放线菌等四大类。它们对营养物质的要求不尽相同，要依据微生物的不同特性，来考虑培养基的组成。根据微生物的特点选择培养基液体和固体培养基的选择发酵工业中大多采用液体培养基培养种子和进行发酵，并根据微生物对氧的需求，分别作静止或通风培养。固体培养基则常用于微生物菌种的保藏、分离、菌落特征鉴定、活细胞数测定等方面。此外，工业上也常用一些固体原料，如小米、大米、麸皮、马铃薯等直接制作成斜面或茄子瓶来培养霉菌、放线菌。根据生产实践和科学试验的不同要求选择种子培养基主要是供微生物菌体的生长和大量增殖。种子培养基要求营养丰富、完全，氮源、维生素的比例应较高，所用的原料也应是易于被微生物菌体吸收利用。发酵培养基除需要维持微生物菌体的正常生长外，主要是要求合成预定的发酵产物。所以，发酵培养基碳源物质的含量往往要高于种子培养基。从经济效益方面考虑选择生产原料对于生产过程来讲，由于配制发酵培养基的原料大多是粮食、油脂、蛋白质等，且工业发酵消耗原料量大。因此，在工业发酵中选择培养基原料时，除了必须考虑容易被微生物利用并满足生产工艺的要求外，还应考虑到经济效益，必须以价廉、来源丰富、运输方便、就地取材以及没有毒性等为原则选择原料。培养基的选择微生物发酵制药技术基础淀粉制备葡萄糖的生产技术在发酵生产之前，必须将淀粉水解为葡萄糖，才能供发酵使用。大多数微生物不能直接利用淀粉（所有的氨基酸生产菌不能直接利用）有些微生物能够直接利用淀粉作原料，但必须在微生物产生淀粉酶后才能进行，过程缓慢，发酵周期延长。若直接利用淀粉作原料，灭菌过程的高温会导致淀粉结块，发酵液粘度剧增。淀粉水解制糖的意义在工业生产中，将淀粉水解为葡萄糖的过程称淀粉的糖化，制得的溶液叫淀粉水解糖。淀粉水解糖的制备方法及原理酸解法酶解法酸酶结合法原料：薯类、玉米、小麦、大米等根据原料淀粉的性质和水解使用的催化剂的不同水解过程：总反应式：(C6H10O5)n+nH2OnC6H12O6过程：(C6H10O5)n(C6H10O5)xC12H22O11C6H12O6

淀粉糊精麦芽糖葡萄糖H+对作用点无选择性，α-1,4-糖苷键和α-1,6-糖苷键均被切断。（一）酸解法

定义：以酸为催化剂，在高温高压下使淀粉水解生成葡萄糖的方法。

淀粉

葡萄糖复合二糖5‘－羟甲基糠醛

复合低聚糖有机酸、有色物质

在淀粉的酸水解过程中，三种反应同时发生复合反应分解反应盐酸副反应酸解法复合反应：在淀粉酸水解过程中，一部分生成的葡萄糖在酸和热的催化作用下，能通过糖苷键聚合，失掉水分子，生成二糖、三糖和其它低聚糖等，这种反应称为复合反应。生成的多数复合糖不能被微生物利用，使发酵结束时残糖高。酸解法分解反应：在淀粉的酸水解过程中，由于反应温度过高和时间过长，使部分葡萄糖脱水，发生分解反应，生成5´-羟甲基糠醛。5´-羟甲基糠醛的性质不稳定，又可进一步分解成乙酰丙酸、蚁酸等物质。这些物质有的自身相互聚合，有的与淀粉中所含的有机物质相结合，产生色素。生成的5‘－羟甲基糠醛是产生色素的根源，增加了糖化液精制脱色的困难。酸解法副反应的影响降低了葡萄糖的收率。给产物的提取和糖化液的精制带来困难。如何控制分解反应和复合反应的发生？淀粉乳浓度酸浓度不能过高温度酸解法酸解法工艺流程

淀粉、水、盐酸→调浆→进料→水解→冷却、中和（Na2CO3)

→脱色（活性碳）→过滤→糖化液酸水解1.调浆：干淀粉用水调成10-11Bx的淀粉乳，加盐酸0.5-0.8％至pH1.5。2.糖化：水解锅预热，打料后直接蒸汽加热，加压0.25-0.4MPa，糖化10-20min。3.冷却：至80℃下中和。4.中和：烧碱中和，至pH4.0-5.05.脱色：活性炭脱色和脱色树脂。活性炭用量为0.6-0.8％，在70℃及酸性条件下搅拌后过滤。6.过滤除杂评价优点：工艺简单，水解时间短，生产效率高，设备周转快。缺点：要求设备耐腐蚀、耐高温和耐压。副产物多，影响糖液纯度，一般DE值只有90％左右。对淀粉原料要求严格，不能用粗淀粉，只能用纯度较高的精制淀粉。酸解法DE值：dextroseequivalentvalue

（葡萄糖当量值）表示淀粉糖的含糖量。还原糖含量（％）DE值＝

100％干物质含量（％）DE值定义用专一性很强的淀粉酶及糖化酶将淀粉水解为葡萄糖的工艺。分两步（1）液化：用α-淀粉酶将淀粉转化为糊精和低聚糖（2）糖化：用糖化酶（又称葡萄糖淀粉酶）将糊精和低聚糖转化为葡萄糖。淀粉的液化和糖化均在酶作用下进行，又称双酶法。

（二）酶解法淀粉水解的过程淀粉吸水膨胀糊化（无化学反应）α-淀粉酶液化

糖化酶糖化酶

糊精

低聚糖麦芽糖

葡萄糖（由7-12个葡萄糖残基组成）3-6个2个1

（二）酶解法1.液化淀粉在α-淀粉酶的作用下，分子内部的α-1，4糖苷键发生断裂。随着酶解进行，淀粉的相对分子质量变得越来越小，酶解液黏度不断下降，流动性增强，最终生成了能溶于水的糊精和低聚糖，这个过程称为液化。

（二）酶解法α-淀粉酶水解底物内部的α-1、4糖苷键，不能水解α-1,6糖苷键，但能越过

-1．6-糖苷键继续水解

-1、4-糖苷键，而将

-1.6糖苷键留在在水解产物中。直链淀粉葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖。支链淀粉以上+异麦芽糖及含有

-1、6-糖苷键的低聚糖（二）酶解法液化条件国内目前较为普遍采用的是一次升温液化法和连续进出料液化法一次升温液化法过程如下：用纯碱溶液将30％～35％淀粉乳（13～14°Bé）调整pH至6.2～6.4，然后加入Ca2+和α-淀粉酶，搅匀后泵入密闭的液化锅内，加热到88～90℃，保温15～20min。液化完毕，用碘液检查，合格后，即升温至100℃，加热使酶失活。α-淀粉酶用量为8～10U/g淀粉。反应液中Ca2+浓度为0.01mol/L。根据糖化酶对底物分子大小的要求，应以液化液与碘液反应显棕色（要求液化产物为20～30个葡萄糖单位）为淀粉的液化终点。2.糖化由糖化酶将淀粉的液化产物糊精和低聚糖进一步水解成葡萄糖的过程，称为糖化。（二）酶解法2.糖化糖化工艺具体如下：将30％淀粉乳的液化液泵入带有搅拌器和保温装置的开口桶内，加入糖化酶，用酶量按80-100U/g淀粉来计算，然后在一定pH和温度下进行糖化，48h后，用无水酒精检查糖化是否完全。糖化结束，升温至80℃，维持20min，杀灭糖化酶。糖化时的温度和pH取决于糖化酶的性质。一般，糖化温度为55～60℃，pH为4.4～4.6。（3）脱色与过滤通常采用粉末活性碳对糖化液进行脱色。

一般控制脱色的温度在60～65℃。3.评价优点：（1）副反应少，水解糖液纯度高（DE值可达98%以上）。（2）反应条件温和，不需高温、高压设备。（3）对原料要求粗放，可用粗原料并在较高淀粉乳浓度下水解。（4）糖液颜色浅，质量高。缺点：（1）生产周期长，一般需要48小时。（2）需要更多的设备，且操作严格。（二）酶解法

集酸解法和酶解法的优点而采取的生产工艺。根据原料淀粉性质分：

酸酶法酶酸法（三）酸酶结合法先将淀粉酸水解成糊精和低聚糖，再用糖化酶将其水解为葡萄糖。适用：淀粉颗粒坚硬（如玉米、小麦）的原料，若用

-淀粉酶液化，短时间液化，反应往往不彻底。酸酶法先用-淀粉酶液化，再用酸水解。适用：颗粒大小不一（如碎米淀粉）的淀粉原料，若用酸法，则水解不均匀。酶酸法培养基的选择微生物发酵制药技术基础培养基的营养成分六大营养物质包括碳源、氮源、能源、无机盐、生长因子和水。工业发酵培养基除了含有这些外，有的还含有某些前体、产物促进剂和抑制剂等。1.能源功能：微生物生长、繁殖、合成、分解、运动、热的产生等，即微生物的一切行为都需要消耗能源。一、培养基的营养成分1.能源光能------光能自养菌的能源。如：小球藻、螺旋藻利用光能生产单细胞蛋白；嗜盐藻利用光能生产甘油、β-胡罗卜素和单细胞蛋白等。氢、亚硝酸盐、亚铁盐等还原态的无机物------化能自养微生物的能源。如：细菌炼铜所使用的氧化亚铁硫杆菌，将亚铁盐作为能源。碳水化合物等有机物------异养微生物能源，同时也是碳源物质。一、培养基的营养成分1.能源2.碳源用于构成微生物细胞和代谢产物中碳素的来源，并为微生物的生长繁殖和代谢活动提供能源。主要功能提供微生物生长繁殖所需的能源；提供微生物合成菌体的碳成分；提供合成目的产物的碳成分。工业生产常用的碳源：糖类、油脂、有机酸、低碳醇和碳氢化合物等。如碳源贫乏时，蛋白质水解物或氨基酸等也被作为碳源使用。工业生产所用微生物绝大多数是异养菌，不像自养菌那样能够利用光、还原态无机物或碳酸盐作为能源物质，只能利用有机碳水化合物作为能源。对于异养微生物，碳源又兼做能源，称为双功能营养物。（1）糖类：发酵培养基中使用最广泛的碳源。

纯糖天然原料木糖单糖：葡萄糖、双糖：蔗糖、麦芽糖、乳糖

多糖：淀粉、糊精及其水解液糖蜜类：甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜糖类：麦芽汁淀粉质类：山芋粉、马铃薯粉、玉米粉、燕麦粉、木薯粉其它：纤维素水解液、乳清、碳源物质的易利用顺序：(单)葡萄糖→(双)蔗糖、麦芽糖、乳糖→(多)糊精→淀粉速效碳源迟效碳源葡萄糖是工业发酵中最常用的单糖，它是由淀粉加工制备的，有固体粉状和葡萄糖糖浆两种产品形式。葡萄糖是碳源中最容易利用的单糖，所以常作为培养基的主要成分，并且也作为促进细胞快速生长的一种有效的糖类物质。它被广泛用于抗生素、氨基酸、有机酸、多糖、甾体转化等发酵产品的生产中。但葡萄糖过多会加速菌体的呼吸，在通气不足、溶解氧不能满足需要的情况下，其代谢中间产物如丙酮酸、乳酸、乙酸等不完全氧化而积累在菌体或培养基中，会导致培养基的pH值下降，影响某些酶的活性，从而抑制微生物的生长和产物的合成。葡萄糖还会引起葡萄糖效应，阻遏微生物利用其他的糖。由于葡萄糖等快速利用的糖对产物合成有调节作用，应控制其浓度，一般是将其和缓慢利用的多糖组成混合碳源，即有利于菌体生长又有利于产物形成。工业发酵生产中用的双糖主要有蔗糖、乳糖和麦芽糖。蔗糖、乳糖可以使用其纯制产品，也可以使用含有此二糖的糖蜜和乳清，麦芽糖多用其糖浆。糖蜜是制糖生产时的结晶后母液，是制糖工业的副产物，主要含蔗糖(总糖含量可达50％～75％)、氮素、无机盐和维生素等营养物质，是微生物发酵培养基物美价廉的碳源。常用在酵母和丙酮、丁醇的生产中。糖蜜使用的注意点：除糖分外，含有较多的杂质，其中有些是有用的，但是许多都会对发酵产生不利的影响，需要进行预处理。例：谷氨酸发酵有害物资：胶体成分（起泡、结晶）、钙盐（结晶）生物素（发酵控制）预处理：澄清→脱钙→脱除生物素糊精、淀粉及其水解液等多糖是仅次于葡萄糖的常用碳源，尤其是淀粉可以克服葡萄糖代谢过快的弊病，价格也比较低廉。玉米淀粉及其水解液多用于抗生素、核苷酸、氨基酸、酶制剂等发酵；小麦淀粉、燕麦淀粉和甘薯淀粉等常在有机酸、醇等发酵中使用。另淀粉有直链淀粉和支链淀粉之分，在培养基中用量较大时，发酵液比较稠，一般>2.0%时要加入一定的α-淀粉酶先行水解。（2）油和脂肪在培养基中糖类物质缺乏或微生物生长的某一阶段，许多微生物可以利用脂类作为碳源和能源生长。许多霉菌和放线菌都具有比较活跃的脂肪酶，在脂肪酶的作用下，油或脂肪被水解为甘油和脂肪酸，在有氧时，进一步氧化成CO2和H2O，并释放出大量的能量。当微生物利用脂肪作为碳源时，所消耗的氧量增加，因此要供给比糖代谢更多的氧。可用的油脂类有豆油、菜油、葵花籽油、猪油、鱼油、棉籽油、玉米油、亚麻子油、橄榄油等在发酵过程中加入的油脂还兼有消泡的作用。（3）有机酸及其盐类一些微生物对乳酸、柠檬酸、乙酸、延胡索酸等及其盐类有很强的氧化能力，因此这些有机酸和它们的盐也能作为微生物的碳源。有机酸作为碳源，氧化产生的能量被菌体用于生长繁殖和代谢产物的合成。在利用有机酸时，发酵液的pH会随着有机酸氧化而上升，尤其是有机酸盐氧化时，常伴随着碱性物质的产生，使pH进一步上升。对整个发酵过程中pH的调节和控制增加困难。醋酸盐做为碳源被氧化时，反应如下：

CH3COONa+2O2

2CO2+H2O+NaOH（4）烃和醇类近年来随着石油工业的发展，烷烃(一般是从石油裂解中得到的14～18碳的直链烷烃混合物，以及甲烷、乙烷、丁烷等)用于有机酸、氨基酸、维生素、抗生素和酶制剂的工业发酵中。甘油、甲醇、乙醇、山梨醇等也用于发酵碳源或生产某些单细胞蛋白。其他碳源物质如石油、天然气等石油化工产品，也是许多微生物的碳源。例如乳糖发酵短杆菌以乙醇为碳源生产谷氨酸，对乙醇的转化率为31％，产率达78g／L。3.氮源氮源是指构成微生物细胞物质和代谢产物的氮素的来源。其主要功能是：构成微生物细胞结构物质，如氨基酸、蛋白质、核酸等；合成含氮代谢产物；作为酶的组成分或维持酶的活性；调节渗透压、PH值、氧化还原电位等；当培养基中碳源不足时，可作为补充碳源。氮源的种类无机氮源有机氮源氨基氮：

NH4OH(NH4)2SO4NH4NO3NH4Cl硝态氮：

NaNO3KNO3合成产物：尿素天然原料：植物蛋白：黄豆饼粉、花生饼粉、棉籽饼粉、菜籽饼粉、

麦麸、玉米浆、玉米麸质粉动物蛋白：蛋白胨、鱼粉、蚕蛹粉、牛肉膏微生物蛋白：酵母粉/浸膏、废菌丝粉其它：酒糟等工业上常用的有机氮源都是一些廉价的原料或副产品。（1）无机氮源铵盐((NH4)2SO4

、(NH4)2Cl、NH4NO3)、硝酸盐(NaNO3、KNO3)氨水等。特点有：①成分简单，质量稳定；②易被菌体吸收利用；铵盐中的NH4+与细胞中有机氮处于相同的氧化水平(细胞内的含氮物质也都以氨基或亚氨基的形式存在)，可被菌体直接吸收用于合成细胞物质；因此NH3·H2O最容易利用，(NH4)2SO4次之。硝酸盐中的硝态氮需还原成氨后才能被微生物吸收利用，因此铵盐比硝酸盐能更快被微生物利用。无机氮源被微生物利用后常会引起发酵液pH的变化铵态氮和硝基氮氮源同化结果：(NH4)2SO4→2NH3+H2SO4：NH3被菌体利用，留下H2SO4则使pH值下降；NaNO3+4H2→NH3+2H2O+NaOH：NH3被菌体利用，留下NaOH使pH值上升；经过微生物代谢作用后能产生酸性物质的营养成分称为生理酸性物质；生理酸性物质使pH值下降；经过微生物代谢作用后能产生碱性物质的营养成分称为生理碱性物质；生理碱性物质使pH值上升。正确使用生理酸性物质和生理碱性物质，对稳定和调节发酵过程的pH有积极作用。氨水是发酵工业常用的无机氮源，除了作为氮源之外，还可以调节pH，在许多微生物发酵生产中都有通氨工艺。例如在青霉素、链霉素、四环类抗生素的发酵生产中采用通氨工艺后，发酵单位均有不同程度的提高。在红霉素的发酵生产中通氨工艺不仅可以提高红霉素的产量，而且可以增加有效组分的比例。在采用通氨工艺时应注意两个问题：一是氨水碱性较强，因此在使用时要防止局部过碱，应少量多次加入，并强强搅拌；二是氨水中含有多种嗜碱性微生物，因此在使用前要用石棉等过滤介质进行过滤除菌，防止因通氨而引起的染菌。（2）有机氮源来源：工业上常用的有机氮源都是一些廉价的原料，花生饼粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒糟。成分复杂：除提供氮源外，有些有机氮源还提供大量的无机盐及生长因子。例如玉米浆：①可溶性蛋白、生长因子（生物素）、苯乙酸②较多的乳酸③硫、磷、微量元素等

有机氮源在微生物分泌的蛋白酶作用下，水解成氨基酸被菌体吸收利用，或进一步分解，最终用于合成菌体的细胞物质和含氮的目的产物。其主要作用有：①除含有丰富的蛋白质、多肽和游离氨基酸外，还含有糖类、脂肪、无机盐、维生素及某些生长因子，因而微生物在含有机氮的培养基中表现出生长旺盛、菌丝浓度增加迅速的特点。在配制培养基时，应该将其他物质的含量充分考虑进去。②有机氮源还能提供次级代谢产物的氮素来源，影响微生物次级代谢产物的产量和组分。更为重要的是还含有目的产物合成所需的诱导物、前体等物质。玉米浆中含有的磷酸肌醇对红霉素、链霉素、青霉素和土霉素等的生产有促进作用；因此，有机氮源是影响发酵水平的重要因素之一。③某些氨基酸不仅能作为氮源，而且是微生物药物的前体物质，因此在培养基中直接加入这些氨基酸可以提高代谢产物的产量。在培养基中加入缬氨酸可以提高红霉素的发酵单位，因为在此发酵过程中缬氨酸既是菌体的氮源，又是红霉素生物合成的前体。色氨酸是合成硝吡咯菌素和麦角碱的前体。但是，由于氨基酸成本高，一般不直接使用，而是通过有机氮源的分解来获得氨基酸。常用的有机氮源黄豆饼粉是发酵工业中最常用的有机氮源。但是，黄豆的产地和加工方法不同，营养物质种类、水分和含油量也随之不同，对菌体的生长和代谢有很大影响。根据油脂的含量：根据加工方法不同：全脂黄豆粉(油脂含量在18％以上)低脂黄豆粉(含油脂量9％以下)脱脂黄豆粉(含油脂量2％以下)。热轧黄豆饼粉冷轧黄豆饼粉玉米浆是玉米淀粉生产中的副产品，为黄褐色的浓稠不透明的絮状悬浮物，是一种很容易被微生物利用的氮源。玉米浆有玉米浆粉和液态玉米浆(干物质含量住50％左右)两种，它们除了含有丰富的氨基酸(丙氨酸、赖氨酸、谷氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸)，还含有还原糖、有机酸、磷、微量元素和生长因子。由于玉米浆含有较多的有机酸(如乳酸、苯乙酸)，其pH偏低，一般在4.0左右。玉米的来源和加工条件不同，玉米浆的质量常有较大的波动，对菌体生长和代谢有很大的影响。其中含有的磷酸肌醇对红霉素、链霉素、土霉素等的生产有促进作用；苯乙酸和苯丙氨酸有青霉素前体的作用

。蛋白胨是由动物组织或植物蛋白质经酶或酸水解而获得的由胨、肽、氨基酸组成的水溶性混合物，经真空干燥或喷雾干燥后制得的产品。原材料和加工工艺的不同，蛋白胨中营养成分的组成和含量差异较大。酵母粉一般是啤酒酵母或面包酵母的菌体粉碎物；酵母膏是以酵母为原料，经酶解、脱色脱臭、分离和低温浓缩(喷雾干燥)而制成的。酵母粉和酵母膏都含有蛋白质、多肽、氨基酸、核甘酸、维生素和微量元素等营养成分。鱼粉是一种优质的蛋白质原料，约含60％左右的粗蛋白，还含有游离氨基酸、脂肪、氯化钠和微量元素等成分。尿素因其成分单一，所以不具有其他有机氮源的特点。但在青霉素和谷氨酸等生产中仍常被采用。在谷氨酸生产中，尿素可以使a-酮戊二酸还原并氨基化，提高谷氨酸的产量。工业上常用的有机氮源及含氮量(质量分数/%)氮源含氮量氮源含氮量大麦1.5～2.0花生粉8.0甜菜糖蜜1.5～2.0燕麦粉1.5～2.0甘蔗糖蜜1.5～2.0大豆粉8.0玉米浆4.5乳清粉4.5有机氮源都来自天然产物，受产地不同、加工方法不同，其质量不稳定，常引发发酵水平波动，因此，选择有机氮源时，要注意品种、产地、加工方法、贮藏条件对发酵的影响，注意它们与菌体生长和代谢产物合成的相关性。根据被微生物利用速度的不同，氮源也分为速效氮源和迟效氮源。无机氮源或以蛋白质降解产物形式存在的有机氮，如玉米浆，可以直接被菌体吸收利用，这些氮源被称为速效氮源。黄豆饼粉和花生饼粉、酵母膏等，有机氮源中所含的氮存在于蛋白质中，必须在微生物分泌的蛋白酶作用下，水解成氨基酸和多肽以后，才能被菌体直接利用，它们则被称为迟效氮源。速效氮源通常有利于菌体的生长，迟效氮源一般有利于代谢产物的形成。因此，在抗生素发酵过程中，往往将速效氮源和迟效氮源、有机氮源和无机氮源按一定比例配成混合氮源，以控制菌体生长与目的代谢产物的形成，达到提高抗生素产量的目的。早期：加入易同化的氮源—无机氮源或速效氮源；中期：菌体的代谢酶系已形成，则可利用迟效氮源。主要功能是构成菌体成分、作为酶的组成部分、酶的激活剂或抑制剂、调节培养基渗透压、调节pH值等。一般微生物所需要的无机盐为硫酸盐、磷酸盐、氯化物和含钾、钠、镁、铁的化合物。还需要一些微量元素，如铜、锰、锌、钼等。4.无机盐（1）磷酸盐组成细胞的矿质元素中磷的含量最高磷是合成核酸、磷酸、一些重要的辅酶NAD、NADP、CoA等以及高能磷酸化合物（ADP、ATP）的重要原料。磷还有利于糖代谢的进行，因此对微生物的生长有明显的促进作用。磷酸盐还是磷酸缓冲液的组成成分，对环境中的pH起着重要的调节作用。配置培养基时，必须加入一定量的磷酸盐.但是过量的磷常会抑制许多产物的合成。例如，谷氨酸发酵生产中，磷含量对谷氨酸发酵影响很大。磷浓度过高时，菌体生长旺盛，但是会抑制6-磷酸葡萄糖脱氢酶的活性，菌体转向合成缬氨酸，谷氨酸产量降低；但磷含量过低，菌体生产不好。但也有一些产物的生产需要较高浓度的磷酸盐。（2）硫酸镁镁

除叶绿素，不参与细胞的组成。酶激活剂，影响基质氧化与蛋白质合成。常以硫酸镁加入，碱性溶液中会生成氢氧化镁沉淀，配料时要注意。硫硫是含硫氨基酸的成分和某些辅酶的活性基，如辅酶A、硫辛酸和谷胱甘肽等。在某些产物中硫是组成元素。如青霉素分子含硫元素，在其生产培养基中，需要加入硫酸钠或硫代硫酸钠等含硫化合物作硫源。（3）铁是细胞色素、细胞色素氧化酶和过氧化氢酶的成分，是菌体有氧氧化必不可少的元素。铁制发酵罐内的溶液即使不加任何含铁化合物，其铁离子浓度已达30ug/ml。一些天然培养基的原料中也含有铁，所以在一般发酵培养基中不再加入含铁化合物。

铁：有些产品对铁很敏感：

例1：青霉素要求最适铁含量在20ug/ml以下。

例2：柠檬酸生产中，无铁培养基中产酸率可比含铁培养基提高近3倍。

例3：生产啤酒时，糖化用水若铁离子浓度高，就会降低酵母发酵活力。新发酵罐往往会造成培养基铁离子浓度过高，所以要加以处理。处理方法：罐内壁涂生漆或耐热环氧树脂，以防止铁离子脱落。（4）钙能控制细胞透性。常用碳酸钙，能与代谢产生的酸起反应，对pH有一定的调节作用。配制培养基时，要先将培养基用碱调到中性，才能将碳酸钙加入。当培养基中磷和钙均要求较高浓度时，可将二者分别消毒或逐渐补加。（5）钾、钠钾、钠离子虽然不是细胞的组成成分，但仍是微生物发酵所必须的成分。这些离子与维持细胞的渗透压和细胞透性有关。（6）镁、锌、Cu、Mn、Co等微量元素是某些酶的辅酶或激活剂。

5.生长因子生长因子为微生物必不可少的物质，一般为小分子有机物，需求量很小。包括：维生素、氨基酸、嘌呤和嘧啶及其衍生物、卟啉及其衍生物、固醇、胺类以及脂肪酸等。能够提供生长因子的天然物质有酵母膏、蛋白胨、麦芽汁、玉米浆、动植物组织或细胞浸液及微生物生长环境的提取液。也可以在培养基中加入已知成分和含量的复合维生素液。主要功能是提供微生物重要化学物质（蛋白质、核酸和脂质）、辅因子（辅酶和辅基）的组分和参与代谢。应用实例：生物素——合成生物质膜的重要辅酶，不足会造成细胞膜不完整，细胞内容物的渗漏。添加亚适量（5mg/L），可即使菌体生长少受抑制也可以使过多的谷氨酸因外泄而源源不断地合成。6.发酵培养基专用添加剂——

前体、诱导物、促进剂和抑制剂前体前体指某些化合物加入到发酵培养基中，在生物合成过程中能直接被微生物结合到产物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但产物的产量却因加入前体而有较大的提高。在青霉素发酵时，人们发现添加玉米浆后，青霉素单位可从20μg/Lml增加到l00μg/ml。进一步研究表明，发酵单位增加的主要原因是玉米浆中含有苯乙酰胺，它能被优先结合到青霉素分子中，从而提高了青霉素G的产量。青霉素苯乙酸前体必须通过产生菌的生物合成过程，才能掺入到产物的分子结构中。在一定条件下，前体可以起到控制菌体代谢产物的合成方向和增加产量的作用。例如在青霉素发酵中加入苯乙酸或苯乙酰胺可以提高青霉素G的产量，而且使青霉素G的比例提高到99%，若不加入前体，青霉素G只占青霉素总量的20%-30%。根据前体的来源，可将前体分为外源性前体和内源性前体。外源性前体是指产生菌不能合成或合成量极少，必须由外源添加到培养基中供给其合成代谢产物，如青霉素G的前体苯乙酸、青霉素V的前体苯氧乙酸。外源性前体是发酵培养基的组成成分之一。内源性前体是指产生菌在细胞内能自身合成的、用来合成代谢产物的物质，如头孢菌素C生物合成中的α-氨基己二酸、半胱氨酸和缬氨酸是内源性前体。需要注意的是：有些外源性前体物质，如苯乙酸、丙酸等浓度过高会对菌体产生毒性；此外，有些产生菌能氧化分解前体，因此在生产中为了减少毒性和提高前体的利用率，补加前体宜采用少量多次的间歇补加方式或连续流加的方式。抗生素前体物质青霉素G苯乙酸或在发酵中能形成苯乙酸的物质，如苯乙基酰胺等青霉素V苯氧乙酸放线菌素C3肌氨酸链霉素肌醇、精氨酸金霉素氯化物红霉素丙酸、丙醇、丙酸盐灰黄霉素氯化物抗生素发酵常用的前体物质氨基酸发酵的前体物质氨基酸前体物质丝氨酸甘氨酸色氨酸氨茴酸色氨酸吲哚蛋氨酸2-羟基4-甲基硫代丁醇异亮氨酸α-氨基丁酸异亮氨酸D-苏氨酸苏氨酸高丝氨酸（2）诱导物诱导物一般是指一些特殊的小分子物质，在微生物发酵过程中添加这些小分子物质后，能够诱导代谢产物的生物合成，从而显著提高发酵产物的产量。根据诱导物的来源，可将诱导物分为内源性诱导物和外源性诱导物。内源性诱导物又称为内源性诱导因子或自身调节因子，是在微生物的代谢过程中产生的调节因子，如链霉素的产生菌灰色链霉菌的发酵液中有一种被称为A因子的物质能够使不产链霉素的突变株恢复产生链霉素，其他还有I因子、L因子等。外源性诱导物又称为外源性诱导因子，是添加在培养基中的外源性物质，如存在于培养基中的淀粉、糊精是淀粉酶发酵的诱导物。（3）促进剂和抑制剂

在发酵过程中加入某些对发酵起一定促进作用的物质，称为促进剂或刺激剂。在培养基中添加微量的促进剂可大大地增加某些微生物酶的产量。常用促进剂有各种表面活性剂（洗净剂、吐温80、植酸等）、二乙胺四乙酸、大豆油抽提物、黄血盐、甲醇等。巴比妥盐能使利福霉素单位增加，并能使链霉菌推迟自溶，延长分泌期。酵母甘露聚糖可诱导甘露糖苷酶的产生，促使甘露糖链霉素转化为链霉素。控制生物素的加入量，可以促进谷氨酸从细胞内分泌到细胞外。加聚乙烯醇衍生物可防止菌丝结球，提高糖化酶的产量。举例：（3）促进剂和抑制剂

在不同的情况下，不同的促进剂所起的作用也各不相同。抑制剂在发酵过程中加入某些化学物质会抑制某些代谢途径的进行，同时会使另一代谢途径活跃，从而获得人们所需的某种代谢产物，或使正常代谢的中间产物积累起来，这种物质被称为抑制剂。抑制剂举例1：如在四环素发酵时，加入溴化物可以抑制金霉素的生物合成，而使四环素的合成加强。举例2：微生物发酵生产甘油。在发酵液中加入亚硫酸氢钠，它与代谢中产生的乙醛生成加成物，使乙醇的产生受阻CH3CHO+NaHSO3→CH3CHOH-OSO3Na乙醛不能成受氢体，而使NADH在细胞中积累。

G

ATPADP6-P-G

6-P-F

1，6-二磷酸-果糖

2*3-磷酸-甘油醛2*NAD+2*乙醇（CH3CH2OH）

2*NADH+H+

2*1，3-二磷酸-甘油酸

2*ADP

2*乙醛（氢受体）

（CH3CHO）

2*ATP2*3-P-甘油酸2*丙酮酸

2*ATP2*2-P-甘油酸2*磷酸烯醇式丙酮酸2*ADP

EMP途径

乙醇发酵PiATPADPCO2乙醇脱氢酶

NADH在细胞中积累，激活３

-磷酸甘油脱氢酶的活性，使磷酸二羟基丙酮作为NADH的受氢体，而还原为３

-磷酸甘油酸，再甘油激酶催化形成甘油。亚硫酸氢纳是乙醇代谢的抑制剂，促使甘油形成。溴化剂能抑制金霉素形成的代谢途径，促使四环素的生成。抑制剂促进的抗生素被抑制的产物抑制剂链霉素甘露糖链霉素甘露聚糖去甲基链霉素链霉素乙硫氨酸四环素金霉素溴化物、巯基苯并噻唑、硫脲嘧啶、硫脲去甲基金霉素金霉素磺胺化合物、乙硫氨酸头孢菌素C头孢菌素NL-蛋氨酸利福霉素B其他利福霉素巴比妥药物抗生素生产中应用的促进剂或抑制剂培养基和设备的灭菌微生物发酵制药技术基础培养基灭菌的原理在发酵工业中，对培养基和发酵设备的灭菌，广泛使用湿热灭菌法。当培养基被加热灭菌时，常会出现这样的矛盾：加热时，微生物固然会被杀死，但培养基中的有用成分也会随之遭到破坏。因此，必须选择一个既能满足灭菌需要，又可使培养基的破坏尽可能少的灭菌工艺条件。致死温度：杀死微生物的极限温度。致死时间：在致死温度下，杀死全部微生物需要的时间。热阻：对热的抵抗力，指微生物在某一特定条件（主要是温度和加热方式）下的致死时间。相对热阻：微生物对热的相对抵抗能力。指微生物在某一特定条件下的致死时间与另一微生物在相同条件下的致死时间的比值。（一）微生物的热阻N—残存的活菌数；t—灭菌时间（s）；K—灭菌速率常数（s-1），或比死亡速率常数，此常数的大小与微生物的种类与加热温度有关；dN/dt—活菌数瞬时变化速率，即死亡速率。（二）对数残留定律

1.灭菌时间的确定

微生物受热死亡的主要原因是高热能使蛋白质变性，这种反应可认为是单分子反应，死亡速率可视为一级反应。

微生物的死亡速率与任一瞬时残存的活菌数成正比。灭菌时间的确定：对数残留定律

t取决于污染程度N0灭菌的程度Ns：Ns=0，t→∞；工程设计常用Ns=10-3个/mL，也就是每处理1000批培养基只允许残留一个活的微生物或1000次灭菌操作中有一次失败。

只有相对无菌，没有绝对无菌。灭菌速率常数k：是微生物耐热性的特征，k的大小与微生物的种类和灭菌温度有关。

2.死亡速率常数k

灭菌速率常数k是判断微生物受热死亡难易程度的基本依据，随微生物种类和灭菌温度而异。同一温度下，不同微生物的k值不同，k值愈小，微生物愈耐热。同一种微生物，灭菌温度越低，k值越小；灭菌温度越高，k值越大。因此，提高灭菌温度，k值增大，灭菌时间t显著缩短。A---频率常数，也称阿累尼乌斯常数，s-1；R---气体常数，8.314J/mol·K；T---绝对温度，K；ΔE---微生物死亡活化能，J/mol。或培养基成分分解所需活化能K—灭菌速率常数（s-1），或培养基内易被破坏成分的分解速率常数微生物的受热死亡及培养基受热破坏都属于单分子反应，符合一级反应动力学，两个方程中的速率常数K与温度之间的关系可用阿累尼乌斯公式表示：从上式可知，K值的大小与微生物或营养成分的种类与加热温度有关3.灭菌温度的选择温度为T1时，（2-9）温度为T2时，

（2-10）上述两式相除后，取对数得（2-11）培养基灭菌时，当加热温度由T1升至T2时，微生物的死亡速率常数k的变化情况为：对培养基成分的破坏而言，同样有：（2-12）灭菌时杀死微生物的活化能大于培养基成分的破坏活化能能，因此：

即随着温度的上升，微生物的死亡速率常数增加倍数要大于培养基成分破坏速率的增加倍数。从上述的分析可知，在热灭菌过程中，同时会发生微生物死亡和培养基破坏这两种过程。温度升高，菌体死亡速率大于培养基成分破坏的速率。灭菌温度（℃）灭菌时间（min）维生素B1的破坏量（%）1001101201301451504003640.50.080.0199.367.027.08.02.0＜1.0不同灭菌温度、时间与培养基成分破坏情况（Ns/No=10-3）灭菌温度越高，培养基达到完全灭菌所需时间越短，营养成分的破坏量也越少。提高灭菌温度，缩短灭菌时间，可达到相同的灭菌效果，并有利于减少培养基中营养物质的破坏。因此发酵培养基通常采用高温短时的灭菌方法。灭菌要达到杀死99.99%的细菌芽孢，有两种方法可以采用，一种是118℃灭菌15min，另一种是128℃灭菌5min。哪一种方法好，为什么？问题（三）影响灭菌的因素污染杂菌的种类、数量灭菌温度、时间（三）影响灭菌的因素培养基成分、物理状态脂肪、糖分和蛋白质等有机物增加微生物细胞的耐热性，高浓度盐类、色素等的存在会削弱微生物细胞的耐热性。固体培养基灭菌时间要比液体培养基灭菌时间长。培养基的pH值pH值6.0～8.0，微生物最耐热；培养基的pH值愈低，灭菌所需时间愈短培养基中微生物数量微生物数量越多，达到灭菌效果所需的时间愈长微生物细胞含水量、菌龄

微生物细胞所含水分越多，则蛋白质凝固温度越低，微生物细胞愈易受热而丧失生命力。年老细胞含水量低，对不良环境的抵抗能力比年轻细胞强。微生物的耐热性

芽孢＞孢子＞营养体空气排出情况搅拌、泡沫

实际生产中应防止突然减少进汽或加大排汽，减少进排汽不平衡，防止泡沫的大量生成，同时对极易发泡的培养基应加少量消泡剂减少泡沫量。培养基和设备的灭菌微生物发酵制药技术基础培养基灭菌方法（一）分批灭菌分批灭菌：分批灭菌就是将配制好的培养基全部输入到发酵罐内或其他装置中，通入蒸汽将培养基和所用设备一起加热至灭菌温度后维持一定时间，再冷却到接种温度，也称为间歇灭菌，实罐灭菌或实消，是中小型发酵罐通常采用的一种培养基灭菌方法。分为三个阶段：升温、保温和冷却。实罐灭菌是典型的分批灭菌。全过程包括升温、保温、降温三个过程

培养基的配制及输送：在配制罐中按照培养基配方配制培养基后，通过专用管道输入发酵罐中。灭菌前准备工作：开始灭菌时，将发酵罐的空气分过滤器进行灭菌，用压缩空气将分过滤器吹干，保压。放去夹套或蛇管中的冷却水，开启排气管阀。1.操作方法加热（1）预热开启搅拌，在夹套或蛇管中通入蒸汽进行间接加热，培养基的温度达到90℃左右时，停止搅拌，关闭夹套蒸汽阀门。预热的目的防止直接导入蒸汽时由于培养基与蒸汽的温度过大而产生大量的冷凝水使培养基稀释防止直接导入蒸汽所造成的泡沫急剧上升而引起的物料外溢。1.操作方法（2）三路进汽从空气管、取样管、放料管蒸汽旁通阀门向罐内直接通入蒸汽，排气管冒出大量蒸汽后，打开接种、补料、消泡剂、酸碱等管道阀门，调节好各排汽和进汽阀门的开度，使培养基温度达到120℃，1×105pa。三路进汽：蒸汽直接从空气管、取样管、放料管蒸汽旁通阀门进入罐内直接加热图2-4分批灭菌设备示意图保温：调节好各进汽和排汽阀门开度，使罐压和温度保持在120℃、1×105pa。凡进口在培养基液面下的各管道（空气、取样、排料）都应通入蒸汽，在液面上的各管道（接种、补料、消泡剂、酸碱补料等）则应排放蒸汽，保证灭菌彻底，不留死角。1.操作方法冷却：先关闭发酵罐顶部各路进料管道上的阀门，然后依次关闭放料管路、通风管路、取样管路上的阀门。保持罐顶的排气阀排蒸汽，使压力降低至0.05MPa时，打开通风管路上各空气阀，进无菌空气保压，一般调节罐压在0.1MPa左右。

再在夹套或蛇管中通入冷水，培养基温度降至70-80℃后，开搅拌，继续降温。使培养基温度降到所需要的温度。1.操作方法需注意问题配制的培养基体积应准确培养基灭菌前，要对发酵罐进行空消，对pH、DO传感电极进行校正夹套内可通入蒸汽对培养基进行间接加热（预热），也可通入冷却水使培养基降温，这两个过程均需进行搅拌，但必须在70-80℃下才能搅拌。在加热和保温过程中应使所有与发酵罐相连的管道中都有蒸汽通过，不留死角。加热和保温过程中，防止突然开大或关小进汽、排汽阀门，避免大量泡沫产生。冷却阶段，注意保压，防止二次污染3.培养基分批灭菌的优点设备要求低，不需另外设置加热冷却装置；操作要求低，适于手动操作；适合于小批量生产规模；适合于含大量固体物质的培养基灭菌。4.培养基分批灭菌的缺点培养基营养物质损失较多，灭菌后培养基质量下降；需反复进行加热和冷却，能耗较高；不适合于大规模生产过程的灭菌；加热和冷却所需时间较长，增加了发酵的准备时间，就相应地延长了发酵周期，使发酵罐得利用率降低。（二）连续灭菌将配制好的培养基通过专门设计的灭菌器，进行连续流动灭菌后，进入预先灭菌过的发酵罐中的灭菌方式，也称为连消。

依设备和工艺条件的不同，连续灭菌分：连消塔加热的连续灭菌流程喷射加热器加热的连续灭菌流程薄板换热器加热的连续灭菌流程1.连消塔加热的连续灭菌流程这是国内味精厂普遍采用的连续灭菌流程。培养基用泵打入连消塔与蒸汽直接混合，在连消塔内的停留时间为20～30s，达到灭菌温度132℃。再送入维持罐保温，时间8～25min，最后由喷淋冷却器冷却至后续的发酵或培养温度。

缺点：设备较庞大；维持罐直径较大，不能保证物料先进先出，易发生局部过热或灭菌不足的现象；喷淋冷却管道很长，对于黏度较高、固形物含量较多的培养基极易堵塞。2.喷射加热器加热的连续灭菌流程优点：能保证培养液在喷射加热器和维持管中的先进先出，避免了培养基过热和灭菌不彻底现象，培养基总的受热时间短，营养物质的损失不严重。缺点：真空冷却系统要求严格密封，以免重新污染。3.薄板换热器加热的连续灭菌流程

薄板换热器由于具有设备紧凑、占地面少、拆洗方便、传热面积和传热系数高、不使热敏物料产生局部过热现象等优点，被广泛用于食品、发酵、制药、化工部门作为加热、冷却或灭菌之用。采用板式换热器的连续灭菌流程，生培养液进入板式换热器的热回收与熟培养液先进行一次热交换达到预热，以便提高热量的利用率，然后进入加热阶段到灭菌温度后引入维持器进行保温，灭菌好的熟培养液再进入热回收段作为生培养液的加热介质，同时本身也得到一定程度的冷却，最后进入冷却阶段用冷却水冷却到所需培养温度。板式换热器的特点是：培养基在设备中同时完成预热、灭菌及冷却过程。虽然加热和冷却生培养液所需时间比使用喷射式连续灭菌较长，但灭菌周期比分批灭菌小得多。由于生培养基的预热过程即灭菌培养基的冷却过程，所以节约了蒸汽及冷却水的用量，板式换热器的缺点是制造加工复杂，必须有专业厂成批生产，密封要求高，密封填圈易损坏，需经常调换。连续灭菌的优缺点优点短时间内加热到保温温度且能快速冷却，减少养分的损失操作条件恒定，灭菌质量稳定易于实行管道化和自动化控制避免反复加热和冷却，提高了热利用率发酵设备利用率高缺点设备要求高，需另外设置加热冷却装置操作比较麻烦染菌机会多对蒸汽要求高不适合大量固体物料的灭菌注意问题连续灭菌前发酵罐应进行空消连续灭菌流程中使用的加热器、维持器、冷却器等应先进行清洗和灭菌培养基灭菌前应先预热耐热性物料和不耐热性物料可在不同温度下分消培养基和设备的灭菌微生物发酵制药技术基础设备和管道的灭菌种子罐、发酵罐、计量罐、补料罐等空罐灭菌

从各罐底部的有关管道通入蒸汽，使罐内压力达0.147MPa，维持45min。灭菌完毕，关闭蒸汽阀后，待罐内压力低于空气过滤器压力时通入灭菌空气保压至0.098MPa。空气总过滤器和分过滤器灭菌

从空气过滤器上部通入蒸汽，并从上、下排气口排气，维持压力0.147MPa，灭菌2h。灭菌完毕，通入压缩空气将空气过滤器吹干，然后保压。补料管路，消沫剂管路灭菌

可与补料罐、消沫剂罐同时进行灭菌，但保温时间为1h。接种管路灭菌一般要求蒸汽压力0.3～0.45MPa，保温1h。培养基和设备的灭菌微生物发酵制药技术基础

其他物料和实验用具的灭菌条件灭菌锅灭菌条件：固体培养基0.098MPa，20-30min；液体培养基0.098MPa，15-20min；玻璃器皿及用具0.098MPa，30-60min种子培养基实罐灭菌条件：121℃，30min消泡剂灭菌条件：121℃，30min尿素溶液灭菌条件：105℃，5min补料实罐灭菌条件：淀粉液121℃，5min

糖液120℃，30min培养基和设备的灭菌微生物发酵制药技术基础灭菌的方法培养基灭菌的定义是指从培养基中杀灭有生活能力的细菌营养体及其孢子，或从中将其除去。工业规模的液体培养基灭菌，杀灭杂菌比除去杂菌更为常用。热灭菌法(干热、湿热和火焰灭菌法)射线灭菌法臭氧灭菌法化学试剂灭菌法过滤除菌法(阻留微生物，达到除菌的目的)

（一）干热灭菌法

160℃，1-2h。使微生物体内的蛋白质发生氧化作用而死亡。用于玻璃和金属器皿的灭菌。（二）湿热灭菌法湿热灭菌法：利用饱和蒸汽灭菌。使微生物体内的蛋白质发生凝固作用而致死。由于蒸汽有很强的穿透力，冷凝时放出大量的潜热，来源方便，价格低廉，灭菌效果好，是目前最基本的适合培养基和设备的灭菌方法。一般条件为：121℃，30min。用于生产设备、培养基、管道、阀门、流加物料等的灭菌。（三）射线灭菌法原理：利用高能电子波、紫外线或放射性物质产生的高能粒子，可以穿透微生物细胞而达到灭菌的方法。常用的射线有：宇宙线（0.0001～0.1Å）、γ射线、x射线、紫外线、高速电子流的阴极射线等。适用范围有限，只用于无菌室、无菌箱等局部空间和器皿等的表面消毒。（四）化学试剂灭菌法消毒剂用途常用浓度使用方法1氧化剂：高锰酸钾漂白粉

皮肤消毒发酵工厂环境消毒

0.1-0.25%2-5%

环境消毒可直接用于粉体2醇类：乙醇

皮肤及器物的消毒

70-75%

器物消毒浸泡30min3酚类：石碳酸来苏尔

浸泡衣物、擦拭房间桌面、喷雾消毒皮肤、桌面、器械消毒

1-5%3-5%

作用10-15min4甲醛空气消毒1-2（10-15ml/m3）加热熏蒸4h5铵盐新洁尔灭

皮肤、器械、环境消毒

0.1-0.25%

浸泡30min化学消毒剂方法的局限性

由于化学试剂会与培养基中的成分作用，并且会残留在培养基中，所以只适合一些环境及器皿表面的消毒而不适合于培养基的灭菌。（五）火焰灭菌法利用火焰直接把微生物杀死。方法简单、灭菌彻底，但仅适用于接种针、玻璃棒、试管口、三角瓶口、接种管口等。（六）过滤除菌法

利用过滤介质将微生物菌体细胞截留过滤，从而达到除菌的方法。

工业上常用此法制备大量的无菌空气，供好气性微生物的培养使用。也可用于容易被热破坏的培养基的灭菌。过滤介质：发酵工业：棉花、玻璃纤维、石棉、滤纸实验室：硝酸纤维薄膜、聚碳酸胶片（核辐射和化学刻蚀处理滤器孔径：常用0.22μm、0.45μm。（七）臭氧灭菌法

利用臭氧的氧化作用而杀死微生物细胞的灭菌方法。

使用安全、安装灵活，杀菌作用明显，不仅能杀死

各种细菌还能杀灭霉菌。主要用于洁净室和设备内部的消毒。空气除菌微生物发酵制药技术基础空气除菌方法

适用于供给发酵需要大量空气的灭菌和除菌方法：加热灭菌：空气中的细菌芽孢在218℃维持24s，就被杀死。可杀死噬菌体

静电除尘：达不到无菌要求介质过滤除菌：用介质阻截尘埃和微生物。普遍使用。1、加热灭菌将空气加热到一定温度后保温一定时间,使微生物蛋白热失活而致死。热杀菌是有效的、可靠的杀菌方法，但是如果采用蒸汽或电热来加热大量的空气，以达到杀菌目的，这是十分不经济的。工业上是利用空气压缩时放出的热量进行杀菌。利用压缩热进行空气灭菌的流程空气进口温度为21℃，出口温度为187-198℃，压力为0.7MPa。压缩后的空气用管道或贮气罐保温一定时间以增加空气的受热时间，促使有机体死亡。为防止空气在贮罐中走短路，最好在罐内加装导筒。这种灭菌方法已成功地运用于丙酮、丁醇、淀粉酶等发酵生产上。空气空压机粗过滤器保温层贮气罐灭菌后空气

石油发酵的无菌空气系统采用涡轮式空压机，空气进机前利用压缩后的空气进行预热，以提高进气温度并相应提高排气温度，压缩后的空气用保温罐维持一定时间。空气吸收塔灭菌后空气粗过滤器预热器涡轮压缩机保温罐列管式冷却器空气缺点：空气的传热效率较低，温度分布不均匀；有些耐热的孢子需要非常长的时间才能杀灭，所以用加热的方法不能够大量制备无菌空气作用：可除去水分、油雾、尘埃、微生物。2.

静电除菌静电除尘是利用静电引力来吸附带电粒子而达到除菌除尘的目的。优点：阻力小；染菌率低，除水除油效果好，耗电少。缺点：设备庞大，需采用高压电技术，一次性投资较大；一次捕集率尚不能满足要求。应用：主要应用于超净工作台和无菌室等所需无菌空气的第一次除尘，然后再配合高效过滤器使用。①绝对过滤绝对过滤介质的孔隙小于细菌和孢子，当空气通过时微生物被阻留在介质的一侧。绝对过滤易于控制过滤后空气质量，节约能量和时间，操作简便，它是多年来受到受到国内外科学工作者注意和研究的问题。它采用很细小的纤维介质制成，介质空隙小于0.5um。3.介质过滤除菌②深层介质过滤深层过滤介质的截面孔隙大于微生物，为了达到所需的除菌效果，介质必须有一定的厚度，因此称为深层过滤介质。深层介质过滤除菌是目前工业上用的较多的空气除菌方法，它是采用定期灭菌的介质来阻截流过的空气所含的微生物，而取得无菌空气。空气除菌微生物发酵制药技术基础

提高空气过滤除菌效率的措施保证进口空气清洁度，如加强生产场地卫生管理，正确选择进风口，加强空气压缩前的预处理。设计和安装合理的空气过滤器，选用除菌效率高的过滤介质。设计合理的空气预处理设备，选择合适的空气净化流程，以达到除油、水和杂质的目的。降低进入空气过滤器的空气相对湿度，如使用无油润滑的空气压缩机，加强空气冷却和去油，提高进入过滤器的空气温度。空气除菌微生物发酵制药技术基础空气过滤除菌1.棉花

使用要求：有弹性、纤维度适中，纤维直径16～21μm，在过滤器里的填充密度为150～200kg/m3，

填充率为8.5%～10%。缺点：阻力大，易结团，过滤效果不稳定，拆装劳动强度大，不能再生。容易潮湿，受潮后阻力更大。（一）常用过滤介质与过滤器2.活性炭要求：小圆柱状颗粒活性炭，大小为φ（3×10）～（3×15）mm，应质地坚硬，颗粒均匀，不易压碎，装填前应将粉末和细粉筛去。填充密度为470～530kg/m3，填充率44%，其滤层厚度为总滤层厚度的1/3～1/2。常将活性炭夹装在两层棉花中使用，以降低介质层的阻力。

3.玻璃纤维使用无碱的玻璃纤维，其直径一般为5～19μm。直径越小越好，但小易断，缺点：更换时碎末飞扬，过敏。散装时装填系数不宜过大，一般为5%～11%。超细玻璃纤维：超细玻璃纤维直径一般为1～1.5μm，一般制成厚度为0.25～0.44mm的纤维纸，3～6张滤纸叠在一起，夹在平板式纤维纸过滤器中。密度为380kg/m3,形成的网格空隙为0.5～5μm，具有较高的过滤效率。4.烧结材料烧结材料过滤介质是将金属、陶瓷、塑料的粉末加压成型后，然后在其熔点温度下粘结固定，由于只是粉末表面熔融，其保持了粒子的空间和间隙，形成了微孔通道，具有微孔过滤的作用。由于这种过滤介质加工困难，空隙不可能做得很小，一般都在10～30μm。

(1)深层纤维介质（棉花、活性炭、玻璃纤维）过滤器：棉花活性炭过滤器的过滤效率可达99%。过滤介质装填为：上部和下部装填棉花，其厚度为总过滤层的2*（1/4~1/3），中间再装入1/2~1/3厚度的活性炭。一般棉花的填充密度为150~200公斤/米3，活性炭40~450公斤/米3。

5.过滤器

(1)深层纤维介质（棉花、活性炭、玻璃纤维）过滤器：填充物顺序：孔板－铁丝网－麻布－棉花－麻布－活性炭－麻布－棉花－麻布－铁丝网－孔板

棉花-活性炭过滤器示意图棉花经过多次加热灭菌后，颜色逐渐变深，靠近过滤器壁的棉花，因经受夹层蒸汽的烤干，受热更为剧烈，更容易变成粉末，而被空气带走，造成过滤层有缝隙，使过滤层疏松而漏风．甚至还因过高的压力和过长时间的烘烤而引起棉花活性炭着火的事故。(2)平板纤维纸过滤器结构：筒身、顶盖、滤层、夹板、缓冲层孔板→铜丝网→麻布→滤纸（3-6层）→铜丝网→孔板(二）空气的过滤除菌原理

当气流通过滤层时，基于滤层纤维的层层阻碍，迫使空气在流动过程中出现无数次改变气速大小和方向的绕流运动，从而导致微生物微粒与滤层纤维间产生惯性撞击截留、拦截截留、布朗扩散、重力沉降及静电引力等作用，从而把微生物微粒截留、捕集在纤维表面上，实现了过滤的目的。惯性冲击滞留作用微粒随气流以一定速度通过深层介质时，受到纵横交错的纤维丝阻迫，空气不断改变运动方向绕过纤维丝从孔隙中通过，而微粒由于惯性大，未能及时改变运动方向，一直运动到纤维表面，由于与纤维的磨擦粘附作用，被吸附在纤维表面上。直径很小的微粒不随气流运动，而是不规则的直线运动，即布朗扩散运动，如果撞在过滤器纤维上就被捕获。气流速度很小、纤维网格孔隙较小时发生。布朗扩散作用拦截滞留作用小而轻的微粒随气流运动，气流绕过纤维前进时，离纤维表面太近的微粒就会被截留下来。静电吸附作用空气中微生物颗粒一方面带有与介质表面相反的电荷或由于感应而得到相反电荷而被介质吸附；另一方面空气流过介质时，介质表面就感应出很强的静电荷而使微生物微粒被吸附而沉淀。在过滤除菌中，有时很难分辨上述各种机理各自所作贡献的大小。随着参数的变化，各种机理所起的作用也不相同。一般认为惯性撞击截留、拦截截留和布朗运动截留的作用较大，而重力和静电引力的作用则很小。气流速度小：布朗扩散起主要作用气流速度中等：拦截截留作用显著气流速度大：惯性冲击滞留作用显著气流速度过大：微粒被气流夹带返回气流（三）过滤除菌效率过滤效率就是滤层所滤去的微粒数与原来微粒数的比值，它是衡量过滤器过滤能力的指标：

空气过滤器的过滤效率主要与微粒的大小、过滤介质的种类和规格(纤维直径)、介质的填充密度、介质层厚度以及气流速度等因素有关。

空气除菌微生物发酵制药技术基础空气的预处理过滤除菌的一般流程空气过滤除菌一般是把吸气口吸入的空气先进行压缩前过滤，然后进入空气压缩机。从空气压缩机出来的空气(一般压力在0.2MPa以上，温度120-160℃)，先冷却至适当温度(20-25℃)除去油和水，再加热至30-35℃，最后通过总空气过滤器和分过滤器(有的不用分过滤器)除菌。1.高空取气管为远离地面几十米的管子。每升高10米，空气中杂菌降低一个数量级。因此从高空取气要比从低空取气有利得多。主要作用：捕集较大的灰尘颗粒。减轻压缩机的磨损和主过滤器的负荷，提高除菌后空气的质量。常用的粗过滤器有：过滤丝网、纸框粗过滤器、麻袋等。2.粗过滤器（安装在压缩机前）作用：增加空气能量，克服阻力，完成输送。3.空气压缩机作用：（1）消除压缩空气的脉动，使排气均匀而连续。（2）使部分液滴在罐内沉降。（3）保温灭菌。4.空气储罐5.压缩空气的冷却高温压缩空气直接通入空气过滤器的后果：引起过滤介质的炭化或燃烧。增大反应罐的降温负荷，给培养温度的控制带来困难。措施：管壳式换热器、翘板式换热器、

沉浸式换热器、喷淋冷却器来进行冷却。6.压缩空气的除水除油压缩空气经冷却会有水滴出，混在空气中，如果使用活塞式空气压缩机，空气中还混杂有油滴（油作润滑作用），为了保证空气过滤器的效能，必须除去空气中的水分和油滴。

旋风分离器——利用离心