GB/T 18639-2023 狂犬病诊断技术（正式版）

狂犬病诊断技术Diagnostictechniquesforrabies2023-11-27发布国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会 I 2规范性引用文件 3术语和定义 4缩略语 5临床诊断 26样品采集、保存和运输 27直接免疫荧光检测(DFA) 38直接快速免疫组化检测(dRIT) 3 510实时荧光RT-PCR检测 611实时荧光重组酶聚合酶扩增(RT-RPA)检测 712细胞培养物病毒分离检测 813小鼠脑内接种病毒分离检测 14综合判定 附录A(规范性)狂犬病诊断检测的生物安全措施 附录B(规范性)试剂配制 附录C(资料性)狂犬病病毒阳性和阴性脑组织制备 附录D(资料性)狂犬病病毒实时荧光RT-RPA检测及结果判定参照图 I本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件代替GB/T18639—2002《狂犬病诊断技术》,与GB/T18639—2002相比，除结构调整和编辑性改动外，主要技术变化如下：——更改了本文件所列各项诊断方法的适用范围(见第1章，2002年版的第1章);——增加了缩略语(见第4章);——增加了临床诊断(见第5章);——删除了“内基氏小体检查”(见2002年版的第2章);——增加了直接快速免疫组化检测(见第8章)、巢式RT-PCR检测(见第9章)、实时荧光RT-PCR检测(见第10章)和实时荧光重组酶聚合酶扩增(RT-RPA)检测(见第11章)4种检测方法；——将检测操作细化为细胞培养物病毒分离检测和小鼠脑内接种病毒分离检测(见第12章、第13章，2002年版的第4章); 增加了综合判定(见第14章);——增加了狂犬病诊断检测的生物安全措施(见附录A)。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中华人民共和国农业农村部提出。本文件由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。本文件起草单位：军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所。本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为：——2002年首次发布为GB/T18639—2002。——本次为第一次修订。Ⅱ作为病死率几乎100%的病毒性传染病，狂犬病的最终确诊依赖实验室诊断技术。自GB/T18639—2002首次颁布以来，狂犬病的实验室诊断技术不断发展。基于直接免疫荧光检测(DFA)的抗原检测方法被世界卫生组织(WHO)和世界动物卫生组织(WOAH)确定为“金标准”;通过对病毒核酸进行特异性扩增实现感染诊断的RT-PCR和实时荧光RT-PCR技术得到广泛应用；检测神经组织内病毒抗原的快速免疫组化检测(dRIT)获得WHO推荐；基于等温扩增的重组酶-聚合酶扩增技术(RPA)也在近几年获得大量应用。上述检测方法与GB/T18639—2002规定的病毒分离技术共同成为当前狂犬病实验室诊断的常用和可靠方法，并在WOAH《陆生动物诊断试验和疫苗手册》和WHO《狂犬病实验室技术》中列举和推荐。同时，GB/T18639—2002第2章中基于组织病理学技术的内基氏小体(negribodies)检查，因敏感性不高逐渐被淘汰。我国卫生疾控、动物疫控、动物检疫和科研机构同步开展了上述狂犬病实验室诊断技术研究，目前已被广泛应用，相关设备和配套检测试剂均有稳定供应。基于上述进展，参考WHO和WOAH推荐技术，结合我国实际情况和相关研究成果对GB/T18639—2002进行修订，旨在规范我国动物狂犬病诊断和检疫方法，提高检测水平，以有效指导防控措施的实施，保证人畜健康和安全，并为我国逐步实现犬传播的狂犬病消除发挥积极作用。本文件所列核酸扩增引物和探针序列均为通过对国内狂犬病流行毒株序列的综合分析设计获得，并经过大量试验验证，其检测敏感度和特异性均不低于国际组织推荐的引物和探针序列。另外，狂犬病中和抗体检测是动物免疫效果评估的重要手段，通常不用于动物狂犬病诊断，因此未列入本文件。1狂犬病诊断技术1范围本文件描述了动物狂犬病诊断的临床诊断、样品采集、保存和运输、直接免疫荧光检测(DFA)、直接快速免疫组化检测(dRIT)、巢式RT-PCR检测、实时荧光RT-PCR检测、实时荧光重组酶聚合酶扩增(RT-RPA)检测、细胞培养物病毒分离检测、小鼠脑内接种病毒分离检测和综合判定的方法。本文件适用于动物检疫、疫病监测和流行病学调查时的狂犬病诊断。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款，其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T34740—2017动物狂犬病直接免疫荧光诊断方法3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4缩略语下列缩略语适用于本文件。AEC:3-氨基-9-乙基咔唑(3-Amino-9-Ethylcarbazole)BHQ-dT:黑洞淬灭荧光标记的胸腺嘧啶脱氧核苷酸(Deoxythymidinenucleosidecarryingablack-DFA:直接免疫荧光检测(Directimmunofluorescenceassay)DMEM:Dulbecco's改良eagle培养基(Dulbecco'smodifiedeaglemedium)DMF:N,N-二甲基甲酰胺(N,N-Dimethylformamide)dNTP:脱氧核糖核苷三磷酸(Deoxyribonucleosidetriphosphate)dRIT:直接快速免疫组化检测(Directrapidimmunohistochemicaltest)EDTA:乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraaceticacid)FAM:羧基荧光素(Carboxyfluorescein)FAM-dT:羧基荧光素标记的胸腺嘧啶脱氧核苷酸(DeoxythymidinenucleosidederivatedwiththefluorophoreFAM)FITC:异硫腈酸荧光素(Fluoresceinisothiocyanate)HRP:辣根过氧化物酶(Horseradishperoxidase)2PBS:磷酸盐缓冲液(Phosphatebuffersaline)PBST:磷酸盐吐温缓冲液(Phosphatetweenbuffersaline)PCR:聚合酶链式反应(Polymerasechainreaction)RNA:核糖核酸(Ribonucleicacid)RPA:重组酶聚合酶扩增(Recombinasepolymeraseamplification)RT-PCR:反转录聚合酶链式反应(Reversetranscriptionpolymerasechainreaction)TAE:Tris-乙酸-EDTA电泳缓冲液(Tris-aceticacid-EDTA)THF:四氢呋喃(Tetrahydrofuran)5临床诊断处于狂犬病流行区、无狂犬病疫苗免疫史或虽经免疫而未产生保护水平中和抗体的所有温血动物密切的家畜时有散发或暴发。发病动物多有明确的咬伤或抓伤史，但发病无明显季节性。潜伏期平均6个月，短于10d或长于1年者罕见。患病动物主要表现为狂躁不安或精神沉郁；行为异常尤其具有攻击性；唾液分泌过多；叫声异常；异嗜等。病程一般2d～8d,不超过10d,最终死亡。具有5.1流行病学特点和5.2临床症状，最终发病死亡的易感动物，判定为疑似狂犬病，确诊需进行实验室诊断应采集包括脑干、小脑及海马回在内的新鲜脑组织样本用于检测。采集方法按照GB/T34740—2017中第7章规定的方法进行。腐败脑组织宜采用核酸扩增检测(见第9章～第11章)以保证检测敏采样人员应按照附录A要求采取必要的生物安全措施。将不同部位脑组织样本分别放入无菌离心管中，编号标识后保存待检。不具备采样条件时，可将整个尸体或动物头部送检，由检测实验室进行脑组织采集。唾液样本仅在动物存活无法获得脑组织样本时采集，并多用于核酸扩增检测或病毒分离检测(见第9章～第13章)。应在妥善保定前提下收集动物唾液样本，采样人员应按照附录A要求采取必要的生采样量应不少于0.5mL,条件具备时，应采集多个时间点的唾液混合后用于检测，以提高检出率。唾液样本采集后加入等体积含双抗(终浓度1000U/mL青霉素及1mg/mL链霉素)的PBS(按照附录36.3样品保存与运输待检样品在2℃~8℃保存应不超过24h;在一20℃保存应不超过6个月；长期保存时，以-70℃以下为宜。样品应置于有干冰或冰块的冷藏包装中运输，保持全程冷链。样品运输的生物安全要求应符合国家规定及运输行业相关规定。7直接免疫荧光检测(DFA)按照GB/T34740—2017中第8章和第9章描述的方法执行。8直接快速免疫组化检测(dRIT)8.1仪器和设备8.2材料和试剂8.2.1狂犬病病毒阳性对照脑组织(见附录C中C.1)。8.2.2狂犬病病毒阴性对照脑组织(见C.2)。8.2.510%福尔马林溶液，按照B.2配制。8.2.6PBST,按照B.3配制。8.2.73%过氧化氢(H₂O₂)溶液，按照B.4配制。8.2.8生物素标记的狂犬病病毒核蛋白单抗(商品化试剂),用前以PBS稀释为工作浓度。8.2.9链霉亲和素-HRP复合物(商品化试剂),用前以PBS稀释为工作浓度。8.2.100.1mol/L醋酸盐缓冲液，按照B.5配制。8.2.115mg/mLAEC-DMF溶液，按照B.6配制。8.2.12苏木素染液，商品化苏木素染液，加等体积水即得，可使用1周。8.2.13水溶性封片剂(商品化试剂)。8.3试验操作按如下顺序编号、排列染片缸并盛装相应液体(除苏木素可每周更换外，其余现用现配)。123456789福尔PBSTPBSTPBST苏木素dII,OPBS马林H,O₂染液48.3.2组织触片制备取待检脑组织0.5g～2g(至少应包含脑干及小脑组织),按照GB/T34740—2017中8.1的方法在载玻片上制备组织触片；同时分别取狂犬病病毒阳性和阴性对照脑组织，制备触片各1张。以上触片编号，室温风干5min,插入染片架。触片在染片缸内的染色和浸洗操作均在染片架上进行。将所有触片浸入10%福尔马林溶液(第1缸)中，固定10min后，取出触片，放入PBST溶液(第2缸)中浸洗5次(浸没于液体内停留3s～5s后完全提出即为浸洗1次，下同),以除去残留的福尔马林。8.3.4去除组织内过氧化物酶全部触片移入3%过氧化氢溶液(第3缸)中，作用10min,以除去内源过氧化物酶。8.3.5生物素标记抗体反应在PBST溶液(第4缸)中浸洗触片5次，移入下一个PBST缸(第5缸)中，浸洗3次后，甩去多余缓冲液，用吸水纸从载玻片边缘将表面液体吸干。水平摆放触片于湿盒内，组织印迹处滴加生物素标记的抗狂犬病病毒核蛋白单抗200μL,使充分覆盖组织印迹，室温反应10min。8.3.6生物素-链霉亲和素反应弃去触片上反应液，以PBST(第5缸)浸洗触片，甩掉多余的PBST,并从载玻片的边缘将触片表面吸干，水平摆放于湿盒内。组织印迹上滴加链霉亲和素-HRP复合物200μL,充分覆盖组织印迹，室温反应10min,反应期间进行8.3.7。按触片数量，每10片取0.1mol/L醋酸盐缓冲液2mL,加入玻璃瓶(如青霉素瓶)内，滴入5mg/mLAEC-DMF溶液250μL,混匀后加入3%过氧化氢80μL,混匀后于1h内使用。8.3.8AEC染色反应后触片弃去表面液体，以PBST(第5缸)浸洗触片后甩掉多余的PBST,并从载玻片的边缘将其表面液体吸干，水平摆放于湿盒内。组织印迹上滴加AEC染色液200μL,充分覆盖组织印迹，室温反应10min,弃反应液。触片在蒸馏水(第6缸)中浸洗5次后，移入苏木素染液(第7缸)内复染2min。以蒸馏水(第8缸)浸洗触片5次以去除染色剂，再次用蒸馏水(第9缸)浸洗5次漂净。8.3.10返蓝和封片将触片移入PBS(第10缸)内返蓝，每次1张，停留5s～10s取出，甩净多余液体，表面滴加水溶性封片剂1滴～2滴，加盖玻片封片，读片前置于阴暗处保存。光学显微镜下观察，以20×物镜扫描视野，然后用40×物镜观察。58.4结果判定8.4.1对照成立条件阳性对照触片应在50%以上的显微镜视野内观察到不规则点状或条索状棕红色斑块，且数目众多，狂犬病病毒抗原的棕红色染色与蓝色组织背景反差明显；阴性对照触片镜下仅可见蓝色着染的组织背景，不应发现棕红色深染斑块。8.4.2待检触片判定在显微镜视野内可观察到不同大小和形状的棕红色斑块者，即判定为狂犬病病毒抗原阳性。9.1仪器和设备9.2材料和试剂9.2.1狂犬病病毒阳性对照脑组织(见C.1)。9.2.2狂犬病病毒阴性对照脑组织(见C.2)。9.2.3特异性扩增引物。9.2.3.1外套上游引物F1:5'-GTGTAACACCTCTACAATGG。9.2.3.2外套下游引物R1:5'-ACAGTCTCYTCNGCCATCT。9.2.3.3内套上游引物F2:5'-CAAGATGTGYGCYAAYTGGAG。9.2.3.4内套下游引物R2:5'-AGCCCTGGTTCGAACATTCT。9.2.4RNA提取试剂盒或试剂(商品化试剂)。9.2.5一步法RT-PCR试剂盒或相应酶类及缓冲液(商品化试剂),包括反转录酶、DNA聚合酶、dNTP、反应缓冲液、无RNA酶水等。9.2.6PCR试剂盒或相应酶类及缓冲液(商品化试剂),包括DNA聚合酶、dNTP、反应缓冲液、无RNA酶水等。9.2.7TAE电泳及制胶缓冲液，按照B.7配制。9.3试验操作分别从不同部位待检脑组织(至少应包含脑干及小脑组织)各取样品约1g,样品量少时可取全部组织。剪碎混匀，取其中约1g置组织匀浆器中，加入1mL生理盐水进行匀浆，以3000g离心2min后取100μL匀浆上清于1.5mL灭菌离心管中。狂犬病病毒阳性和阴性对照脑组织各取100μL,分别置于1.5mL灭菌离心管中。唾液样品直接取100μL置于1.5mL灭菌离心管中。使用RNA提取试剂盒，按试剂盒说明书提取待检样品和对照样品总RNA。6用无RNA酶水将9.2.3的引物溶解或稀释至浓度10μmol/L。使用一步法RT-PCR试剂盒，按说明书配制反应体系，进行扩增条件设置。50℃反转录30min;95℃预变性2min;95℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸90s,30个循环；72℃终延伸5min。使用PCR试剂盒，以9.3.4.1的外套扩增产物1μL为模板，按说明书配制反应体系，进行扩增条件设置。95℃预变性2min;95℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸30s,30个循环；72℃终延伸9.3.5扩增产物电泳取9.3.4.2的内套扩增产物5μL～10μL加样于含核酸染色剂的1.0%琼脂糖凝胶孔中，另孔加5μLDNAMarker,以100V～120V电压于1×TAE电泳缓冲液中电泳约20min,于凝胶成像仪内观9.4.1狂犬病病毒阳性对照样品出现255bp扩增条带、阴性对照样品无特异扩增条带时，检测结果成立。9.4.2被检样品出现255bp扩增条带时判定为狂犬病病毒核酸阳性，否则判定为阴性。9.5阳性扩增产物核酸序列测定仅在需要对扩增产物进行序列分析时进行，可委托专业技术服务机构测序。取9.3.4.2获得的内套扩增产物，以9.2.3.3引物F2或9.2.3.4引物R2对其进行DNA序列测定，有助于进一步确认狂犬病病毒基因组序列，分析其传播来源。10实时荧光RT-PCR检测A2型生物安全柜、小型台式冷冻离心机、荧光定量PCR仪等。10.2材料和试剂10.2.1狂犬病病毒阳性对照脑组织(见C.1)。10.2.2狂犬病病毒阴性对照脑组织(见C.2)。10.2.3特异性扩增引物和探针。10.2.3.1上游引物F:5'-CCCTACAATGGATGCCGAC。710.2.4RNA提取试剂盒(商品化试剂)。10.2.5一步法实时荧光RT-PCR试剂盒或相应酶类及缓冲液(商品化试剂，包括反转录酶、DNA聚合按照9.3.1进行。使用RNA提取试剂盒(商品化试剂),按试剂盒说明书提取待检样品和对照样品总RNA。用无RNA酶水将10.2.3引物和探针溶解或稀释至浓度10μmol/L.使用一步法实时荧光RT-PCR试剂盒，按说明书配制50μL反应体系，加入经10.3.3稀释的上游引物F、下游引物R各1.5μL,探针P1μL,10.3.2提取的样品总RNA5μL,混匀后瞬时离心，置荧光定量PCR仪内进行扩增。45℃反转录20min;95℃预变性2min;95℃变性15s,56℃退火15s,72℃延伸20s,或95℃变性15s,60℃退火和延伸30s,40个扩增循环。设定于延伸反应末收集FAM荧光信号。10.4.1狂犬病病毒阳性对照样品Ct<33、阴性对照样品无Ct或Ct>37时，检测有效。10.4.2待检样品Ct≤33时，判定为狂犬病病毒核酸阳性；无Ct或Ct>37时，判定为狂犬病病毒核酸阴性。10.4.3待检样品33<Ct≤37时，判为狂犬病病毒核酸疑似阳性。对疑似阳性样品应重新提取总RNA进行复检，复检配制10.3.4反应体系时将无RNA酶水体积减少为9μL,10.3.4加入的总RNA增加至10μL。复检后若Ct≤33,判定为狂犬病病毒核酸阳性，否则判定为狂犬病病毒核酸阴性。11实时荧光重组酶聚合酶扩增(RT-RPA)检测11.1仪器和设备A2型生物安全柜、小型台式冷冻离心机、荧光定量PCR仪或等温扩增检测仪等。11.2材料和试剂11.2.1狂犬病病毒阳性对照脑组织(见C.1)。11.2.2狂犬病病毒阴性对照脑组织(见C.2)。11.2.3特异性引物和探针。811.2.3.2引物RPA-R:5'-CTGGTCCAGTCYTCMGGRCATGTYGA(BHQ-dT)CCACGATAATC-*。其中*代表阻止引物延伸的基团，可采用磷酸化或者C3spacer修饰实现。11.2.4RNA提取试剂盒(商品化试剂)。11.2.5反转录-重组酶聚合酶扩增(RT-RPA)试剂盒(商品化试剂)。11.3试验操作按照9.3.1进行。使用RNA提取试剂盒，按试剂盒说明书提取待检样品和对照样品总RNA。用无RNA酶水先将11.2.3的引物和探针溶解或稀释至浓度10μmol/L。11.3.4扩增体系配制(此过程应在冰上进行)使用反转录-重组酶聚合酶扩增(RT-RPA)试剂盒，按说明书配制50μL反应体系，加入经11.3.3稀释的引物RPA-F、RPA-R各2.1μL,探针RPA-P0.6μL,11.3.2提取的总RNA模板2μL,混匀后加入混合酶反应管(试剂盒组分),最后加入280mmol/L醋酸镁(试剂盒组分)2.5μL。同时设置狂犬病病毒阳性对照样品、阴性对照样品和反应体系空白对照(不加模板RNA)。配制好的反应体系应立即上机扩增。使用荧光定量PCR仪时，设置39℃扩增30s,45个循环，于反应全程收集FAM荧光信号；使用等温扩增检测仪时，39℃扩增5min后，取出反应管颠倒混匀，短时离心后再以39℃继续扩增17.5min,在17.5min反应全程收集FAM荧光信号。11.4.1狂犬病病毒阴性对照样品无荧光曲线或Ct>42,阳性对照样品Ct≤30,反应体系空白对照无荧光曲线时判定检测反应成立(见附录D)。11.4.2待测样品Ct≤37时判定为狂犬病病毒核酸阳性；无荧光曲线或Ct>42时判定为狂犬病病毒核酸阴性：37<Ct≤42时判定为狂犬病病毒核酸疑似阳性，应重复检测。复检结果为阳性或疑似阳性时，判定为狂犬病病毒核酸阳性；复检结果为阴性时判定为狂犬病病毒核酸阴性(见附录D)。12细胞培养物病毒分离检测12.1仪器和设备二氧化碳恒温培养箱、小型台式冷冻离心机、A2型生物安全柜、倒置荧光显微镜、组织匀浆器等。12.2材料和试剂12.2.1DMEM培养基(商品化试剂)。912.2.2胎牛血清(商品化试剂)。12.2.3胰蛋白酶-EDTA(商品化试剂)。12.2.4含10000U/mL青霉素和10mg/mL链霉素的双抗溶液(商品化试剂)。12.2.5FITC标记的狂犬病病毒核蛋白单抗(商品化试剂)。12.2.6丙酮(商品化试剂)。12.2.7PBS,按照B.1配制。小鼠成神经瘤细胞系(N2a或MNA)。按9.3.1制备待检脑组织匀浆1mL,加入2mL含双抗(终浓度1000U/mL青霉素、1mg/mL链霉素)的DMEM培养基，于1.5mL灭菌离心管中10000g离心5min,取上清加入另一离心管备用；唾液样品直接取1mL,加等体积含双抗(终浓度1000U/mL青霉素、1mg/mL链霉素)的DMEM培养鼠成神经瘤细胞(N2a或MNA)传入2个～4个T25细胞瓶，培养过夜使其长成单层，弃上清，每瓶接入12.4.1制备的样品0.5mL～1.0mL,在恒温培养箱内(37℃,5%二氧化碳)吸附1h,加入含有2%胎牛血清的DMEM培养基8mL～10mL,置恒温培养箱(37℃,5%二氧化碳)内继续培养。设不接种样品的正常细胞对照2瓶，同时培养。每天观察1次，细胞长满后按1:3传代，连续传代3次，传代后细胞至少保留原接种瓶数继续培养，其余用于感染鉴定。接种后各代细胞累计观察至少15d,记录细胞生长状态。12.5细胞培养物感染病毒检测12.5.1直接免疫荧光检测(首选)弃去细胞瓶内培养基，加3mL80%丙酮溶液室温平放固定30min后，弃丙酮，以5mLPBS(按照B.1配制)冲洗2遍，每次3min;按第7章方法以工作浓度的FITC标记的狂犬病病毒核蛋白单抗染色60min后于倒置荧光显微镜下观察并判定。刮取瓶内细胞，以第9章、第10章、第11章任一方法进行狂犬病病毒核酸检测。12.6.1对照细胞培养物为狂犬病病毒抗原或核酸阴性时本检测成立。12.6.2待检样品接种的细胞培养物经12.5检测为狂犬病病毒抗原或核酸阳性时，判定为待检样品含有活狂犬病病毒；否则，判定为待检样品内不含有活狂犬病病毒。13小鼠脑内接种病毒分离检测A2型生物安全柜、小型台式冷冻离心机、小鼠饲养笼具及设备、倒置荧光显微镜、组织匀浆器、胰岛素注射器等。13.2材料和试剂13.2.1DMEM培养基(商品化试剂)。13.2.2含10000U/mL青霉素和10mg/mL链霉素的双抗溶液(商品化试剂)。13.2.3FITC标记的狂犬病病毒核蛋白单抗(商品化试剂)。13.2.4丙酮(商品化试剂)。13.3.1小鼠脑内接种与观察按12.4.1制备的待检脑组织匀浆上清或唾液除菌滤过液，吸入胰岛素注射器。每份待检样品脑内接种2日龄～5日龄小鼠(乳鼠)5只。左手固定小鼠头部，用碘伏或酒精棉消毒颅顶部位。右手持注射器在小鼠双眼连线后等边三角形顶点旁开约0.5cm处刺入颅腔，每只小鼠注射待检样品0.01mL~0.03mL。对照组小鼠2只，按同法同剂量脑内注射DMEM培养基。与母鼠同窝正常饲养，每天早晚各观察1次，记录是否有发病小鼠。至少观察28d。脑内注射5d以后死亡的小鼠应取脑组织进行狂犬病病毒检测。13.3.2死亡小鼠脑组织狂犬病病毒检测以第7章(首选)、第8章～第11章任一检测法进行检测。13.4.1对照组小鼠应健活。13.4.2接种待检样品的小鼠如在接种5d以后发病，并呈现痉挛、麻痹或兴奋等神经症状并死亡，可初步判定为狂犬病病毒感染，应取脑进行狂犬病病毒检测。13.4.3死亡小鼠脑组织检测为狂犬病病毒抗原或核酸阳性时，判定该待检样品含有活狂犬病病毒。13.4.4接种小鼠均健活，或死亡小鼠经上述方法检测均为阴性，判定待检样品内不含有狂犬病活14综合判定以第5章临床诊断进行判定。判定为疑似狂犬病的动物，应按本文件要求采集脑组织进行病毒抗原、核酸检测或病毒分离检测。待检组织中同时包含脑干和小脑，按照第7章～第11章检测技术中的至少1种进行检测后，检测结果均为阴性时，判定待检动物未发生狂犬病。待检组织中不同时或不包含脑干和小脑，或待检组织腐败时，所得阴性检测结果不能判定动物未发生狂犬病。疑似狂犬病动物，按照第7章～第13章任一检测方法检测，获得阳性结果时，即判定为待检动物发生狂犬病。(规范性)狂犬病诊断检测的生物安全措施A.1生物安全设施狂犬病病毒分离检测(见第12章、第13章)应在BSL-3或ABSL-3级实验室进行；其他诊断检测(见第7章～第11章)可在BSL-2级实验室进行。狂犬病诊断检测的操作者在上岗之前应完成狂犬病暴露前免疫，此后每半年进行1次血清狂犬病病毒中和抗体检测，中和抗体效价应维持在不低于1.0IU/mL水平。低于1.0IU/mL时，应暂停狂犬病检测工作，加强免疫1剂狂犬病疫苗，经检测达到上述标准后返岗。A.3检测者个人防护检测操作时应佩戴口罩、双层手套，着长袖工作服或隔离服。采样时应在此基础上加戴护目镜或面屏。满足A.2时，检测者操作时避免锐物刺伤和割伤。发生暴露性外伤后，应立即停止试验，以肥皂水冲洗伤口不少于15mi