(高清版)GBT 40974-2021 核酸样本质量评价方法

核酸样本质量评价方法2021-11-26发布2022-06-01实施国家标准化管理委员会前言 I 2规范性引用文件 3术语和定义 4质量评价方法 3 4.1.1DNA浓度 34.1.2DNA纯度 44.1.3DNA完整性 4 54.2.1RNA浓度 54.2.2RNA纯度 54.2.3RNA完整性 5参考文献 7I本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由全国生物样本标准化技术委员会(SAC/TC559)提出并归口。本文件起草单位：上海生物芯片有限公司、中国计量科学研究院、上海芯超生物科技有限公司、上海交通大学医学院附属仁济医院、浙江省台州医院、广东省中医院(广州中医药大学第二附属医院)、国家卫生健康委科学技术研究所、上海医药临床研究中心有限公司、安捷伦科技(中国)有限公司、珀金埃尔默企业管理(上海)有限公司。本文件主要起草人：郜恒骏、王晶、张小燕、许靖曼、康晓楠、林爱芬、陈曲波、高华方、杜莉利、1核酸样本质量评价方法本文件描述了核酸样本的浓度、纯度和完整性的质量评价方法。本文件适用于人、动物、植物和微生物等来源的核酸样本的质量评价。本文件不适用于小分子核酸样本的质量评价。2规范性引用文件本文件没有规范性引用文件。3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。核苷酸nucleotide核苷的磷酸酯，是构成核酸的基本单位。由核苷酸或脱氧核苷酸通过3',5'-磷酸二酯键连接而成的一类生物大分子。具有非常重要的生物功能，主要是贮存遗产信息和传递遗传信息。包括核糖核酸和脱氧核糖核酸两类。脱氧核糖核酸deoxyribonucleicacid;DNA带有遗传信息的生物大分子。由四种主要的脱氧核苷酸(脱氧单磷酸腺嘌呤dAMP、脱氧单磷酸鸟嘌呤dGMP、脱氧单磷酸胞嘧啶dCMP和脱氧单磷酸胸腺嘧啶dTMP)通过3',5'-磷酸二酯键连接而成。注：它们的组成和排列不同，显示出不同的生物功能，如：编码功能、复制和转录的调控功能等。核糖核酸ribonucleicacid;RNA核酸的一类。由核苷酸通过3',5'-磷酸二酯键连接而成的多聚体。注：不同种类的RNA链长不同，行使各式各样的生物功能，如与蛋白质生物合成有关的RNA有信使RNA(mes-sengerRNA,mRNA)、转运RNA(transferRNA,tRNA)和核糖体RNA(ribosomeRNA,rRNA);与转录后加工有关的RNA有核小RNA(smallnuclearRNA,snRNA)、核仁小RNA(smallnucleolarRNAs,snoRNAs);与生物调控有关的RNA有微RNA(microRNAs,miRNA)、干扰小RNA(smallinterferingRNA,siRNA)等。质粒plasmid细菌细胞内一种自我复制的环状双链DNA分子，能稳定地独立存在于染色体外，并传递到子代，一般不整合到宿主染色体上。2单位体积核酸的含量，可使用质量浓度(如ng/μL)进行表示。注：简称浓度。核酸中含有蛋白质、多糖、盐离子、有机溶剂等杂质的程度。注1:杂质含量越少纯度越高。注2:简称纯度。核酸完整性nucleicacidintegrity核酸片段的长度大小和碎片化程度。注1:完整性反应样本的降解程度，直接影响后下游检测的结果。注2:简称完整性。电泳electrophoresis在分散体系中，荷电颗粒在外加电场的影响下，向电极移动的现象。凝胶电泳gelelectrophoresis在一定的电场强度下，按相对分子质量大小分离和纯化核酸分子的技术。表示颗粒物质或溶质在超速离心场中的沉降速率，即为每单位离心力场的沉降速度。注：s=v/a,其中a为重力加速度或离心加速度，v为沉降速度，可间接反映分子量大小。毛细管凝胶电泳capillarygelelectrophoresis以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力，将凝胶移到毛细管中作支持物，根据样品中各组分之间迁移速度而实现分离的一类液相分离技术。使用微管道(尺寸为数十微米到数百微米)处理或操纵微小流体(体积为纳升到微升)的系统所涉及的科学和技术。反应DNA完整性的数值。注：对DNA进行自动化电泳或微流控分析，通过分析软件自动测定DNA完整性，DIN值为1～10,数值越大表明DNA完整性越好。DQS值为0～5,数值越大表明DNA完整性越好。RNA完整性分数RNAintegrityscore;RISRNA完整值RNAintegritynumber;RIN(RIN)RNA质量分数RNAqualityscore;RQS反应RNA完整性的数值。3注：对RNA进行自动化电泳或微流控分析，其结果中28S和18S(或23S和16S)条带对应的RNA条带峰面积体现RNA完整性，RIS/RIN/RQS值均为0～10,数值越大表明RNA完整性越好。4质量评价方法DNA在260nm有最大的吸收峰，按式(1)计算DNA浓度：C——DNA浓度，单位为纳克每微升(ng/μL);OD₂s₀——在波长260nm处DNA的吸光度；n——DNA溶液的稀释倍数；C₀——OD值为1对应的DNA浓度。双链DNA对应的C。为50ng/μL,单链DNA对应的C。为33ng/μL,寡核苷酸对应的C。为20ng/μL～30ng/μL。样品不纯或超出分光光度计的量程范围时不宜使用分光光度法进行浓度测定。一般用标准品溶液的浓度(ng/mL)对应的荧光强度作回归曲线，将样本溶液的荧光强度代入回归方程，计算出样本的浓度。对于微量和低浓度样本，宜采用荧光染料检测法，此方法受其他杂质的影响较小。绝对定量分析：起始浓度(Log)与Ct值呈线性关系，通过已知拷贝数的标准品可以作出标准曲线。根据样本的Ct值，可计算出样本中的浓度。相对定量分析(2-△△Ct法):即通过计算测试样本目的基因相对于对照样本目的基因表达量的相对△△Ct=(Ct₂-Ct₁)—(Ct₂o-Ct₁o)△△Ct——测试样品与对照样品的差异倍数；Ct₂——测试样品的目的基因聚合酶链式反应(PCR)扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定阈值时所经过的扩增循环次数；Ct₁——测试样品的内参基因PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定阈值时所经过的扩增循环次数；Ct₂₀——对照样品的目的基因PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定阈值时所经过的扩增循环次数；Ct——对照样品的内参基因PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定阈值时所经过的扩增循环次数。4采用微滴发生器将含有核酸分子反应体系形成成千上万纳升级的微滴，其中每个微滴或不含待测DNA靶分子，或含一个至数个待测DNA靶分子，且每个微滴都作为一个独立的PCR反应器。经PCR扩增后，采用微滴分析仪逐个对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为1,没有荧光信号的微滴判读为0。根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例，通过分析软件可计算出待测靶DNA分子的浓度。4.1.2.1分光光度法纯双链DNAOD260/OD280比值应为1.8。低于1.6可能有蛋白和酚污染。高于1.9可能有RNA污染。纯双链DNAOD260/OD230比值应在2.0～2.2,若OD260/OD230比值低于2.0,可能有盐离子等杂质的残留。4.1.2.2琼脂糖凝胶电泳法琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法；琼脂糖凝胶具有的网络结构，将之置于电场中，带有负电荷的核酸分子就会向正电极迁移。泳道口中如果存在较亮的条带，说明含有蛋白污染，宜在提取过程中增加去蛋白的步骤，去除多余蛋白等杂质。电泳条带最前面如果有较小的条带，说明存在RNA污染，宜在提取过程中加入适当浓度的RNA酶进行消化处理。4.1.3.1凝胶电泳法完整性好的DNA(包括人类、动物、植物、细菌、真菌)进行凝胶电泳时，主带完整，条带弥散不明显，条带位置为滞后于标记(Marker)的最大的条带。质粒DNA存在三个构型，共价闭合环状的超螺旋构型，开环DNA构型和线性DNA构型，这三种构型分子电泳时的迁移速度大小顺序为：超螺旋、线性和开环。超螺旋比例越高，质粒DNA完整性越好。自动化凝胶电泳可提供DNA完整值参数，用于评价从高度完整的DNA(DIN值为10)到严重降解的DNA(DIN值为1)的各种样品。4.1.3.2毛细管凝胶电泳法毛细管凝胶电泳分析方法可提供DNA片段峰分布分析如下：a)质量好的DNA,目标主峰锐利起峰，目标主峰前无弥散片段；b)部分降解的DNA,目标主峰前有少量弥散片段(目标主峰依然明显);c)严重降解的DNA,目标主峰不明显(无目标主峰),有大量弥散片段。4.1.3.3微流控分析法微流控分析是在精细加工的微流控芯片上进行电泳分离样品，检测激光激发的荧光信号，由分析软件生成可视化电泳图和凝胶样图像，对DNA、RNA及蛋白样本进行大小测定、定量分析与质量评价。微流控分析法可测量从高度完整的DNA(DQS值为5)到严重降解的DNA(DQS值为0)的各种5样品。用标准样品测得在波长260nm处，RNA的吸光度为1(即OD2s₀为1),则样品中RNA浓度为44ng/μL。注：此结果仅适用于中性pH的缓冲体系下的测量。根据提取量将RNA稀释到适当的浓度范围，再用分光光度计进行检测，按式(3)计算RNA浓度：C=0D₂₀×n×C,式中：C——总RNA浓度，单位为纳克每微升(ng/μL);OD₂so——在波长260nm处RNA的吸光度；n——RNA溶液的稀释倍数；C₀——OD值为1对应的RNA浓度。注1:样品不纯则无法用分光光度法对RNA进行浓度测定，可使用其他方法。注2:C。值一般为44ng/μL。一般用标准品溶液的浓度(ng/mL)对应的荧光强度作直线回归，将样本溶液的荧光强度代入回归方程，计算出样本的核酸含量。对于微量和低浓度样本，宜采用荧光染料检测法，此方法受其他杂质的影响较小。RNA溶液的OD260/OD280比值在1.9～2.1,说明纯度较好。OD260/OD280值<1.8,说明蛋白质污染较多；OD260/OD280值>2.2,说明RNA已经降解，且可能有异硫氰酸残存。4.2.2.2琼脂糖凝胶电泳法电泳后点样孔较亮甚至点样孔与目标带之间有明显拖尾现象，说明杂质(例如蛋白质)残留较多。如在4kb～5kb甚至再高分子量处出现条带，说明有明显DNA残留。核糖体RNA(rRNA)占总RNA的80%～85%,在凝胶上可以清晰地看到28S和18SrRNA。完整的RNA,电泳条带显示28S(2kb左右):18S(1kb左右)约为2:1。如果出现条带变小或明显的拖尾甚至弥散，说明RNA有降解。自动化凝胶电泳可以提供RNA完整值参数，用于评价从高度完整的RNA(RIN°值为10)到严重降解的RNA(RIN°值为1)的各种样品。6依据RIS值可对RNA的完整性进行评分，RIS值越高，代表RNA的完整性越好。微流控分析可提供RNA的浓度以及大小片段峰的分布比值(例如rRNA28S、18S、5.8S占总RNA的80%～85%)。RNA28S:18S比值约为2:1,二者的峰面积较大，电泳条带清晰且宽，说明RNA完RIN值可作为RNA研究领域内质量评估的常规标准，用于总RNA、mRN