以DC为基础的肿瘤疫苗策略

树突状细胞与DC疫苗2010.12.31肿瘤疫苗和DC简史肿瘤细胞的免疫逃避机制和DC抗肿瘤机制以DC为基础的肿瘤疫苗策略DC肿瘤疫苗的主要影响因素树突状细胞dendriticcell;DC1973

美国学者Steinman

小鼠的脾细胞因其成熟时伸出许多树突样或伪足样突起而得名目前所知的功能最强的抗原提呈细胞CD34骨髓干细胞肿瘤疫苗dendriticcellvaccineDCvaccine1、增强肿瘤的免疫原性2、增强机体的抗肿瘤免疫应答3、打破肿瘤免疫耐受核心问题诱导主动性免疫刺激宿主产生有效的免疫应答安全、无不良反应能为预防肿瘤复发提供保护性的长期免疫记忆功能理想肿瘤疫苗肿瘤疫苗的研究进展疫苗的出现1796EdwardJenner

接种疫苗——天花肿瘤疫苗尝试性研究提高肿瘤自身免疫原性的方法增加机体的抗肿瘤免疫反应1、WiUiamColey丹毒患者的活的链球菌→注射肿瘤患者肿瘤结节内→激发起肿瘤患者机体对肿瘤的免疫应答2、牛痘病毒感染的肿瘤细胞→肿瘤溶解物→注射人体3、混合卡介苗或短小棒状杆菌+经过照射灭活的肿瘤细胞→共孵育→注射人体没有取得明显肯定的治疗效果理论基础的奠定1971BurnetThomas

免疫监视学说免疫系统细胞免疫机制识别清除肿瘤细胞

临床和实验证据1、免疫缺陷（尤其是细胞免疫缺陷）→肿瘤发生率↑2、幼儿期（免疫功能未发育成熟）和老年期（免疫功能衰退）→肿瘤发生率比其他年龄↑3、经抗淋巴细胞血清处理或胸腺摘除的小鼠肿瘤发生率高肿瘤疫苗研究的飞跃20世纪末

90年代初以基因修饰肿瘤细胞为基础的疫苗发展肿瘤疫苗真正成为能够应用于临床的肿瘤治疗方法1997年美国Jefferson大学约60％的黑色素细胞瘤转移患者注射肿瘤疫苗后存活5年以上1998年波士顿研究人员制成一种经生物工程改造的肿瘤疫苗，它包含一种可以刺激机体免疫系统，使Ｔ细胞保持较长时间的攻击力。

（一）全肿瘤细胞疫苗

1、经物理、化学等方法处理的疫苗

2、转基因疫苗

3、感染病毒类疫苗

4、细胞融合疫苗（二）肿瘤抗原及抗原类分子疫苗

该类疫苗的研究最为广泛,该类疫苗特异性高,但免疫原性低

1、抗原疫苗

2、多肽类疫苗

3、抗独特型抗体疫苗

4、热休克蛋白—肽类复合物疫苗（三）核酸疫苗（四）重组病毒、病菌疫苗（五）树突状细胞疫苗肿瘤疫苗新热点近10年来以树突状细胞为基础的肿瘤抗原特异性疫苗1991年Steinman首次发现DC这一强大的抗原递呈功能以来，DC就被用于肿瘤的免疫治疗研究转基因疫苗表达的共刺激分子、细胞因子,通过激活ＤＣ细胞使更多的抗原被摄取呈递临床试验效果不如动物实验；瘤细胞获取复杂；灭活要求高；基因导入的安全问题直接携带肿瘤抗原的DC细胞作用则更为直接可以活化静息Ｔ细胞，激发更强抗肿瘤免疫反应DC疫苗VS易获取，操作简便，效果和转基因疫苗相当甚至更好美国密执安大学、瑞士苏黎世大学等应用树突状细胞分别携带乳腺癌、黑色素瘤抗原制备疫苗Dukes大学则应用肿瘤细胞ＲＮＡ转导ＤＣ细胞均已进入Ⅰ期或Ⅱ期临床试验。2005年中山大学肿瘤医院研发出一种除了干细胞移植、化疗等常规治疗方法外的白血病治疗方法——白血病DC疫苗已在14位患者身上获得明显疗效，国内尚属首创。肿瘤细胞免疫逃避机制和DC抗肿瘤的机制1）

肿瘤的免疫原性较弱,并具有抗原调变能力肿瘤细胞逃避免疫的机制2）MHC-I类分子表达下降或消失。B7，ICAM-1等共刺激分子在癌细胞上的表达异常；

3）肿瘤细胞表面抗原封闭或覆盖肿瘤细胞高水平表达包括唾液酸在内的粘多糖或其他的凝聚系统；血清中的封闭因子（封闭抗体）封闭肿瘤表面抗原表位。4）免疫系统无法清除大量肿瘤细胞使之漏逸。漏逸的少量肿瘤细胞不能引起足够的免疫应答，反而可以刺激肿瘤不断生长，产生免疫刺激。存在于某些肿瘤组织内的淋巴细胞可以为肿瘤细胞提供某些肿瘤营养因子并刺激肿瘤细胞生长。3）肿瘤细胞表面Fas表达下调；Fas/FasL反击Sakaguchi’等在1995年发现鼠源性的CD4CD25双阳性T细胞亚群，能通过细胞与细胞间接触以及分泌细胞因子显著抑制多种免疫细胞的功能。局部微环境的肿瘤抗原可显著诱导特异Treg细胞生成，称为肿瘤特异Treg细胞。很多资料显示Treg细胞在肿瘤微环境及患者外周血中富集存在。4）免疫抑制细胞的大量生成，如Treg细胞肿瘤免疫抑制因子可以使肿瘤细胞躲避局部免疫效应细胞的攻击，还能进入外周血循环，抑制宿主全身抗肿瘤免疫功能。Lyon小组应用“微量样本多指标流式蛋白定量技术(CytometricBeadArray，CBA)”对35例确诊乳癌患者及24例疑似患者的样本进行了检测对比，得出在所测的IL-1B、IL-2、IL4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12(p70)、IL-13、IL-17、G-CSF、GM-CSF、IFN-γ、MCP-1、MIP-1B和TNF-α细胞因子中，除了GM—CSF，INF-γ外，其他因子都有显著的增高。5）免疫抑制性细胞因子的生成，如VEGF、IL-10、PGE2、IL-6、TGF-β和M-CSF。6）DC数量减少或功能缺陷,不足以激发机体的抗原特异性免疫应答以杀灭肿瘤细胞。Ishigami等的研究显示,胃癌组织中DC数量与胃癌的淋巴结转移、临床分期和周围浸润呈负相关。1)未成熟DC与肿瘤细胞的直接接触影响了DC的成熟;2)肿瘤细胞释放的可溶性免疫抑制因子影响着全身的DC的成熟和功能,包括VEGF、TNF-α、TGF-β、M-CSF、GM-CSF、IL-6和IL-10等

。造成DC细胞这种缺陷的主要原因:肿瘤局部DC浸润数量可作为判断肿瘤预后的独立指标。正常DC细胞的抗肿瘤机制1）DC细胞加工抗原，启动MHC-I类和Ⅱ类分子限制性的CD8+T细胞CD4+T细胞反应。2)活化的DCIL-12Th0Th1IFN-γ、GM-CSF、TNF-α3）活化的DC高水平表达多种共刺激分子(如CD80／CD86和CD40)和黏附分子(如CD54、CD58)，使T细胞充分被激活4）启动活化的效应T细胞迁移至肿瘤部位。5）DC可能通过释放某些抗血管生成物质(IL-12，IFN-γ)及前血管生成因子而影响肿瘤血管的形成。以DC为基础的肿瘤疫苗策略以DC为基础的肿瘤疫苗策略以DC为基础的肿瘤疫苗策略肿瘤细胞/肿瘤细胞提取物冲击DC1蛋白质冲击DC2肿瘤抗原肽冲击DC3肿瘤抗原DNA/RNA冲击DC4肿瘤抗原在体内冲击DC51.肿瘤细胞/肿瘤细胞提取物冲击DC肿瘤细胞DCDC-肿瘤融合细胞1.肿瘤细胞/肿瘤细胞提取物冲击DC自体肿瘤细胞自体DCDC-肿瘤融合细胞1.肿瘤细胞/肿瘤细胞提取物冲击DC异体肿瘤细胞自体DCDC-肿瘤融合细胞1.肿瘤细胞/肿瘤细胞提取物冲击DC自体肿瘤细胞异体DCDC-肿瘤融合细胞Yasuda1.肿瘤细胞/肿瘤细胞提取物冲击DC优点1.所含抗原信息量大2.可在无须了解该肿瘤TSA（肿瘤特异性抗原）的情况下诱导出针对该肿瘤的特异性T细胞免疫3.可减少肿瘤对单一抗原表位发生的免疫逃避2.蛋白质冲击DC对于抗原表位尚不了解的肿瘤，可以可溶性蛋白作为抗原装载DC在肿瘤动物模型和肿瘤患者中，以肿瘤抗原蛋白转染的DC在体外和体内均可诱导出针对肿瘤的抗原特异性CTL反应优点：可使那些因MHC限制而排除在肽疫苗治疗之外的患者受益。3.肿瘤抗原肽冲击DC

以肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原肽装载DC的肿瘤疫苗优点：高度表位特异性，避免引起自身免疫反应不需要肿瘤组织或细胞，可以调控免疫强度抗原表位扩展缺点：抗原表位必须已知应用受MHC限制肿瘤细胞逃避免疫识别的可能性增加4.肿瘤抗原DNA/RNA冲击DC

分离、提取DNA/RNA扩增（PCR）电泳&DNA/RNAblotting转染DC载体4.肿瘤抗原DNA/RNA冲击DC

DNA/RNA疫苗可在体外合成而大量获得，并可包含多个抗原表位，还可经修饰使其功效加强。RNA疫苗只在宿主细胞的胞质中表达，DNA疫苗需进入细胞核后转录——癌变的潜在危险DNA疫苗稳定性好，功效长久5.肿瘤抗原在体内冲击DC抗原肽蛋白接种体内转染DC肿瘤抗原外周血单核细胞未成熟DCDC疫苗GM-CSF,IL-4脂质体DC装载抗原策略免疫佐剂的使用DC的体外扩增免疫途径临床病人的选择DC肿瘤疫苗的主要影响因素DC的来源DC的分离纯化DC的培养基DC培养使用的细胞因子DC细胞的鉴定DC的培养技术DC的来源——骨髓取材有限，HSC含量极少,大约为1/105

单个核细胞。BM为侵入性操作,患者不容易接受。

其增殖及多向分化能力随供者年龄增加体质衰弱而减弱。在体外培养过程中有自发分化和衰老的现象,且BM有病毒污染的可能DC的来源——外周血标本来源充足,取材方便,因子组合简单,培养步骤简单、经济。HSC含量极少,最终收获的DC数量少,活力和纯度均不高。其端粒及端粒酶活性均长于和高于BM及PBHSC/HPC,并且低表达或不表达细胞凋亡配基CD95/Fas,故体外生存期更长DC的来源——脐带血较丰富的原始且能重建长期造血的HSC/HPC,自我增殖及多向分化能力较强对刺激因子的反应和增殖能力、体外集落形成能力、刺激后进入细胞周期的速度以及自泌生长因子能力均强于BM及PB的HSC/HPC,脐带血优点缺点产量大、纯度高等母婴无不良影响,不涉及社会、伦理及法律等方面的争论,受胎盘屏障保护,被污染概率低CB量较少,通常只有50～150ml;CBHSC对理化变化较敏感,洗涤、分离或运用传统方法去除红细胞的方法均会导致HSC的严重丢失分离纯化操作简单,

细胞成分复杂,

多次传代后不能纯化,

增殖活力相对较低连续贴壁法操作简单,

成本低廉,

纯化率较低密度梯度离心法细胞纯度高(≥90%),

但操作复杂,价格昂贵,

单克隆抗体选择不当,容易丢失目的细胞免疫磁珠分选法联合DC的培养基10%胎牛血清——引起机体免疫反应自体单核细胞条件培养基细胞因子维持DC分化、发育、存活、功能的最基本的CK,主要使HSC向DC、单核及巨噬细胞分化,并以生成单核细胞为主GM-CSFIL-4IL-4通过抑制单核细胞向巨噬细胞方向的分化而诱导其向DC方向分化IL-4可以增加并稳固GM-CSF诱导的CD1a的表达IL-4与极低浓度GM-CSF协同刺激iDC后,促进DC成熟,上调MHCⅡ和共刺激分子表达;

IL-4还能促进IL-12分泌,TNF-αGM-CSF体外诱导DC的体系中是必需的,早期诱导细胞进入细胞周期,促进细胞增殖;后期阻止细胞向粒系的分化,上调GM-CSF受体表达,并促进DC成熟可抑制DC发生自发性凋亡DC的鉴定形态学鉴定表面特异性标记物的鉴定（CD1a、CD83）功能学鉴定：混合淋巴细胞反应促T细胞增殖作用

DC分泌IL-12的检测DC的鉴定形态学鉴定