酶工程制药(生物制药工艺课件)

游离酶制药游离酶制药是指游离酶在制药行业中的应用。例如，利用酶的专一性进行底物的拆分，也可利用酶的专一性和高效性，水解含有某一类基团的大分子，生成小分子化合物。例如：利用核糖核酸酶水解DNA，可获得核苷酸。酶基础知识酶是活细胞产生的一类具有催化功能的生物分子，所以又称为生物催化剂(biocatalysts）绝大多数的酶都是蛋白质。

酶催化的生物化学反应，称为酶促反应（Enzymaticreaction）。在酶的催化下发生化学变化的物质，称为底物（substrate）。酶是生物催化剂酶的分类与命名一酶的分类（一）根据酶的化学组成可将酶分为：1单纯蛋白酶类：只含有蛋白质成分2结合蛋白酶类（全酶）：含有蛋白成分（酶蛋白）和非蛋白成分（辅助因子）

全酶=酶蛋白+辅助因子辅助因子与酶蛋白结合比较疏松的小分子有机物与酶蛋白结合紧密的小分子有机物。金属离子可作为辅助因子。金属离子辅酶辅基酶蛋白和辅助因子单独存在均无催化活性，只有二者结合为全酶才有催化活性。酶蛋白决定酶催化专一性，辅助因子通常是作为电子、原子或某些化学基团的载体决定反应的专一性。

某些小分子有机化合物与酶蛋白结合在一起并协同实施催化作用，这类分子被称为辅酶（或辅基）。辅酶是一类具有特殊化学结构和功能的化合物。参与的酶促反应主要为氧化-还原反应或基团转移反应。大多数辅酶的前体主要是水溶性B族维生素。许多维生素的生理功能与辅酶的作用密切相关。（二）根据酶蛋白结构特点可将酶分为单体酶：以一个独立的三级结构为完整生物功能分子的最高结构形式的酶。寡聚酶：以一个独立的四级结构为完整生物功能分子的最高结构形式的酶。

多酶复合体：由多种酶彼此镶嵌成一个功能完整的具有特定结构的复合体,它们相互配合依次进行，催化连续的一系列相关反应。（三）、酶的分类

根据酶所催化的反应类型，按照国际系统分类方法，将酶分为六大类：1.氧化-还原酶2.转移酶3.水解酶4.裂解酶5.异构酶6.合成酶（一）习惯命名方法

（1）根据作用底物来命名，如淀粉酶、蛋白酶等。（2）根据所催化的反应的类型命名，如脱氢酶、转移酶等。（3）两个原则结合起来命名，如丙酮酸脱羧酶等。（4）根据酶的来源或其它特点来命名，如胃蛋白酶、胰蛋白酶等。二酶的命名（二）国际系统命名法系统名称包括底物名称、构型、反应性质，最后加一个酶字。例如：习惯名称:谷丙转氨酶

系统名称:丙氨酸：

-酮戊二酸氨基转移酶

酶催化的反应:谷氨酸+丙酮酸

-酮戊二酸+丙氨酸酶的编码乳酸脱氢酶EC1.1.1.27第1大类，氧化还原酶第1亚类，氧化基团CHOH第1亚亚类，H受体为NAD+该酶在亚亚类中的流水编号每个酶都有一个有四个数字组成的编码第二节酶催化作用的特性酶是生物催化剂，与无机催化剂相比，二者有共性；但酶的化学本质是蛋白质，又在生物体内作用，因此酶的作用又有特性。

一酶和一般催化剂的共性1.用量少而催化效率高；2.它能够改变化学反应的速度，但是不能改变化学反应平衡。3.只能催化热力学允许的反应，在反应前后不发生改变。二酶催化作用特性1．高效性2．专一性3．反应条件温和4.酶的催化活性可调节控制锁钥学说诱导契合学说1913年，德国化学家Michaelis和Menten根据中间产物学说对酶促反应的动力学进行研究，推导出了表示整个反应中底物浓度和反应速度关系的著名公式，称为米氏方程。Km

—米氏常数Vmax

—最大反应速度（二）米氏方程V=Vmax

[S]Km

+[S]米氏方程Km即为米氏常数，Vmax为最大反应速度当反应速度等于最大速度一半时,即V=1/2Vmax,Km=[S]上式表示,米氏常数是反应速度为最大值的一半时的底物浓度。因此,米氏常数的单位为mol/L。（三）米氏常数的意义及测定米氏常数Km的意义(1)不同的酶具有不同Km值，它是酶的一个重要的特征物理常数。(2)Km值表示酶与底物之间的亲和程度：Km值大表示亲和程度小，酶的催化活性低;Km值小表示亲和程度大,酶的催化活性高。(3)由若干酶催化一个连续代谢过程时，如果确定各种酶催化反应底物的Km值及相应的底物浓度时，可推断出其中Km值最大的一步反应为该连续反应中的限速反应，该酶为限速酶（关键酶）。

AB

C

D若>>，则哪酶为限速酶？E1E2E3

米氏常数的测定

基本原则：将米氏方程变化成相当于y=ax+b的直线方程，再用作图法求出Km。例：双倒数作图法（Lineweaver-Burk法）米氏方程的双倒数形式：1Km11—=——.—+——

vVmax[S]Vmax

1Km11

=

+

V

Vmax[S]Vmax取米氏方程式的倒数形式：1/Vmax斜率=Km/Vmax-1/Km米氏常数Km的测定：-4-202468100.20.40.60.81.01/[S](1/mmol.L-1)1/v酶的Km在实际应用中的意义（1）鉴定酶：通过测定Km，可鉴别不同来源或相同来源但在不同发育阶段，不同生理状态下催化相同反应的酶是否是属于同一种酶。（2）判断酶的最适底物(天然底物)。（3）计算一定速度下底物浓度。1、根据米氏方程，有关[s]与Km之间关系的说法不正确的是（）。A.当[s]<<Km时，V与[s]成正比；B.当[s]＝Km时，V＝1/2VmaxC.当[s]>>Km时，反应速度与底物浓度无关。D.[s]=2/3Km时，V=25％Vmax2、已知某酶的Km值为0.05mol.L-1，要使此酶所催化的反应速度达到最大反应速度的80％时底物的浓度应为（A）。A.0.2mol.L-1B.0.4mol.L-1C.0.1mol.L-1D.0.05mol.L-1二pH的影响在一定的pH下,酶具有最大的催化活性,通常称此pH为最适pH。pHv最适pH（optimumpH）pH稳定性：在一定pH范围内酶是稳定pH对酶作用的影响机制：1.环境过酸、过碱使酶变性失活；2.影响酶活性基团的解离；3.影响底物的解离。三温度的影响一方面是温度升高,酶促反应速度加快。另一方面,温度升高,酶的高级结构将发生变化或变性，导致酶活性降低甚至丧失。因此大多数酶都有一个最适温度。在最适温度条件下,反应速度最大。高温两种不同影响：1.温度升高，反应速度加快；2.温度升高，酶热变性速度加快。Tv最适温度低温影响：1.温度降低，酶活性降低2.温度过低,酶无活性但不变性四激活剂对酶作用的影响

凡能提高酶活力的物质都是酶的激活剂。如Cl-是唾液淀粉酶的激活剂。金属离子：Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+、Se3+、Co2+、Fe2+阴离子：

Cl-、Br-有机分子还原剂：抗坏血酸、半胱氨酸、谷胱甘肽金属螯合剂：EDTA

这些离子可与酶分子上的氨基酸侧链基团结合，可能是酶活性部位的组成部分，也可能作为辅酶或辅基的一个组成部分起作用。一般情况下，一种激活剂对某种酶是激活剂，而对另一种酶则起抑制作用；对于同一种酶，不同激活剂浓度会产生不同的作用。应用激活剂时应注意五抑制剂对酶活性的影响使酶的活性降低或丧失的现象，称为酶的抑制作用。能够引起酶的抑制作用的化合物则称为抑制剂。酶的抑制剂一般具备两个方面的特点：1.在化学结构上与被抑制的底物分子或底物的过渡状态相似。2.能够与酶以非共价或共价的方式形成比较稳定的复合体或结合物。一酶活力的测定(1)测一定时间内产物生成量(2)测定完成一定量反应所需时间测定时确定三种量：①加入一定量的酶；②一定时间间隔；③物质的增减量。二酶活力单位：是衡量酶活力大小的计量单位,规定条件（最适条件）下一定时间内催化完成一定化学反应量所需的酶量。据不同情况有几种酶活力单位或又称酶单位。(一）国际单位：1、国际单位U（Unit）：在最佳条件或某一固定条件下每分钟催化生成1μmol产物所需要的酶量为一个酶活力单位。1U=1μmol/min2、“Katal”单位：指在一定条件下1秒钟内转化1mol底物所需的酶量。

1Kat=1mol/s

Kat和U的换算关系：1Kat=6×107U，

1U=1/（6×107）Kat

以上的酶单位定义中，如果底物（S）有一个以上可被作用的化学键，则一个酶单位表示1分钟使1μmol有关基团转化的酶量。如果是两个相同的分子参加反应，则每分钟催化2μmol底物转化的酶量称为一个酶单位。

在“U”和“kat”酶活力单位的定义和应用中，酶催化底物的分子量必须是已知的，否则将无法计算。比活力（比活性）：每单位（一般是mg）蛋白质中的酶活力单位数（酶单位/mg蛋白）。实际应用中也用每单位制剂中含有的酶活力数表示（如：酶单位/mL（液体制剂），酶单位/g（固体制剂））。

对同一种酶来讲，比活力愈高则表示酶的纯度越高（含杂质越少），所以比活力是评价酶纯度高低的一个指标。

在评价纯化酶的纯化操作中，还有一个概念就是回收率。

回收率=某纯化操作后的总活力/某纯化操作前的总活力［总活力=总体积×酶活力或总质量×比活力］

三比活力称取25mg蛋白酶配成25mL溶液，取2mL溶液测得含蛋白氮0.2mg，另取0.1mL溶液测酶活力，结果每小时可以水解酪蛋白产生1500μg酪氨酸，假定1个酶活力单位定义为每分钟产生1μg酪氨酸的酶量，请计算：（1）酶溶液的蛋白浓度及比活。（2）每克纯酶制剂的总蛋白含量及总活力。解：（1）蛋白浓度=0.2×6.25mg/2mL=0.625mg/mL；（2）比活力=（1500/60×1ml/0.1mL）÷0.625mg/mL=400U/mg；（3）总蛋白=0.625mg/mL×1000mL=625mg；（4）总活力=625mg×400U/mg=2.5×10U。下表是从小牛肠中提纯碱性磷酸酶的例子。试计算其总活力、比活力、回收率和纯化倍数，并填入表中空格。纯化步骤酶液总体积/mL酶活力/U·mL-1总活力/U×103蛋白含量/mg·mL-1比活力/U·mg-1回收率/%纯化倍数初提取液1200020524602.12971001PH5.0沉淀50002160.82丁醇抽提44501660.0360%丙酮沉淀55123602.0536%丙酮沉淀20262501.9650%丙酮沉淀20189000.94活性炭吸附3273400.11下表是从小牛肠中提纯碱性磷酸酶的例子。试计算其总活力、比活力、回收率和纯化倍数，并填入表中空格。纯化步骤酶液总体积/mL酶活力/U·mL-1总活力/U×103蛋白含量/mg·mL-1比活力/U·mg-1回收率/%纯化倍数初提取液1200020524602.12971001PH5.0沉淀500021610800.8226343.93丁醇抽提4450166738.70.035533305760%丙酮沉淀5512360679.82.05602927.66236%丙酮沉淀20262505251.961339321.313850%丙酮沉淀20189003780.942010615.4207活性炭吸附3273402350.11667279.5688［总活力=总体积×酶活力或总质量×比活力］固定化酶制药

学习目标能力目标：能判断与区分各种固定化酶的方法；知识目标：了解固定化酶的研究历史；掌握固定化酶的定义，理解固定化酶的优缺点；理解固定化酶制备的一般原则与注意事项一、游离酶的缺点1.酶的稳定性较差，在温度、pH、和无机离子等外界因素的影响下，容易变性失活。2.酶一般都是在水溶液中与底物反应，反应结束后酶难以回收。3.反应结束后，酶成为产物的杂质。

二、概念固定化酶是指固定在载体上并在一定的空间范围内进行催化反应的酶。固定化酶既保持了酶的催化特性，又克服了游离酶的不足之处，具有增强稳定性，可反复或连续使用以及易于和反应产物分开等显著特点。直接固定菌体或菌体碎片的，称为固定化菌体或固定化细胞。

三、酶固定化的历史？1953年Grubhofer,Schleith以聚氨基苯乙烯固定羧肽酶、淀粉酶、胃蛋白酶1969年千畑一郎固定化氨基酰化酶，DL-氨基酸拆分1971年第一届国际酶工程大会固定化酶：ImmobilizedEnzyme1973年日本固定大肠杆菌生产天冬氨酸1979年日本固定化植物细胞：长春花和毛地黄细胞1982年日本固定原生质体生产谷氨酸

一、酶的固定化方法交联法凝胶包埋法半透膜包埋法（半透膜）离子键结合法共价键结合法热处理法结合法包埋法吸附法1.吸附法吸附法是利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上而使酶固定化的方法。活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石。优点：操作简单、条件温和、载体廉价易得、可反复使用。缺点：结合力不牢、容易脱落。选择载体的原则：（1）要有巨大的比表面积（2）要有活泼的表面（3）便于装柱进行连续反应。2.包埋法将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定化的方法称为包埋法。载体：琼脂、琼脂糖、海藻酸、角叉菜胶、明胶、聚丙烯酰胺……（1）凝胶包埋法：以各种多孔凝胶为载体，将酶、细胞或原生质体包埋在凝胶的微孔内的固定化方法。海藻酸：来自海藻的由D-甘露糖醛酸和L-古洛糖醛酸组成的多糖。可抑制大鼠肠道对锶(90Sr)吸收。除褐藻等海藻外，棕色固氮菌等细菌亦产生藻酸类型的多糖。海藻酸为淡黄色粉末；无臭；几乎无味，在水、甲醇、乙醇、丙酮、氯仿中不溶，在氢氧化碱溶液中溶解。有助悬、增稠、乳化、粘合等作用。可用为微囊囊材，或作为包衣及成膜的材料。卡拉胶：鹿角菜胶、角叉菜胶。是从某些红藻类海草中提炼出来的亲水性胶体，化学结构是由半乳糖及脱水半乳糖所组成的多糖类硫酸酯的钙、钾、钠、铵盐。由于硫酸酯结合形态的不同，可分K型、I型、L型。在果冻，软糖，冰激凌等食品工业应用广泛。（2）半透膜包埋法（微囊）将一定量的酶或微生物包埋在具有半透性聚合物膜的微囊内。

优点：结合力牢、活力回收高、底物专一性不变。缺点：制备较难，载体无法回收、扩散限制。包埋法酶溶液被包裹在膜内，膜既能使酶存在于类似于细胞内的环境，又阻止了酶的脱落或直接与外环境接触。3.结合法选择适宜载体，使之通过共价键或离子键与酶结合在一起的固定化方法称为结合法。（1）离子结合法：通过离子键使酶与载体结合的固定化方法。载体：DEAE纤维素、TEAE纤维素、DEAE葡聚糖凝胶

……++++++++++++----------------++++++++（2）共价结合法：通过共价键将酶与载体结合的固定化方法。载体：纤维素琼脂糖凝胶葡聚糖凝胶甲壳质氨基酸共聚物……酶分子中可以形成共价键的基团：氨基、羧基、巯基、羟基、酚基、咪唑基载体活泼基团

共价键结合法制备固定化酶的步骤：3载体活化的方法4.交联法（不需载体）