植物生理学中各项生理指标的测定方法

植物生理学中各项生理指标的测定方法PAGEPAGE1一.实验内容实验1MDA(丙二醛)含量测定所需试剂：10%三氯乙酸（TCA）（纯）0.25%硫代巴妥酸(纯)实验2：可溶性蛋白含量测定所需试剂：考马斯亮蓝G-25095%乙醇85%磷酸实验3：SOD(超氧化物歧化酶)酶活性测定所需试剂：dl-甲硫氨酸（Met）NBTEDTA-Na2核黄素实验4：CAT(过氧化氢酶)活性（过氧化氢酶）测定所需试剂：PBS（PH=7.0）30%H2O2实验五：Apx(抗坏血酸过氧化物酶)活性（即ASA—POD活性）测定所需试剂：ASA（分子量167.12）(乙=胺四乙酸=钠)EDTA—Na2PBS(pH7.0)30%H2O实验6：ASA(维生素C)含量测定偏磷酸95%乙醇磷酸4%2,2-二联吡啶FeCl3（或FeCl3·6H2O）实验7：GSH(谷胱甘肽,媚力肽GSHGSH是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸结合而成的三肽化合物)含量测定所需试剂：NaH2PO4·2H2ODTNB（二硫代硝基苯甲酸）PBS(PH6.8)实验8：脯氨酸测定所需试剂：磺基水杨酸甲苯茚三酮冰乙酸85%磷酸试验9：叶绿素含量测定。80%丙酮 试验9：GR活性测定试验10：过氧化氢含量测定。三氯乙酸试验11：超氧阴离子含量测定二．酶液和母液提取1.酶液提取所需试剂：50mmol/L磷酸缓冲液（PH=7.8）(内含1%(m/v)聚乙烯吡哆烷酮PVP），0.1mmol/LEDTANa2或EDTA)，也可为（内含2%(m/v)PVP），0.2mmol/LEDTANa2或EDTA）（先配制后用缓冲液定容）2.ASA.GSH母液提取所需试剂：5%偏磷酸1．抗氧化酶酶液提取（SOD.POD.CAT）：1g（根据样品的量,少的可以适当减少）叶片加入预冷5ml.50mmol/L磷酸缓冲液（PH=7.8）↓4℃冷冻1500↓上清液即为酶液（5℃下保存一两天内备用，中短期用-20℃2．ASA.GSH母液提取：0.1g叶片加入3ml预冷5%偏磷酸溶液↓4℃冷冻14000g↓蒸馏水（ml）1.00.80.60.40.20蛋白含量（μg）020406080100③各试管加入5mlG-250染色剂，翻转混合，放置2分钟，595nm比色，绘制过原点标准曲线（方程式）。（相关系数要两个9以上）2.2步骤：①标准曲线（参考邹琦）（595nm比色）注意：制作通过原点的标准曲线，以含0μg蛋白质液调零②取0.1g样品，加5ml蒸馏水提取，5000g离心10分钟，取上清1ml测定③1ml样液+5mlG-250液盖塞翻转混合数次，最后595nm比色，直接从标准曲线读含量。（此方法反应十分迅速，2分钟即达到平衡，其结合物在室温下1小时内保持稳定）实验3：SOD酶活性3.1步骤：1.取50μl酶液①加入2ml39mmol/L甲硫氨酸（Met）②2ml0.225mmol/LNBT,（氮蓝四唑）③1ml0.6mmol/LEDTA-Na2（①②③可以配制在一个试剂瓶里）④1ml0.012mmol/L核黄素，摇匀。（现配现用）2．（人工培养箱内）4000Lχ日光灯下放置30分钟后，温度控制在30℃（用大烧杯套着小烧杯，将试管放在同心圆内，每隔5min转过90度，转四次。对照（不加酶液）每次至少对称地放3支，调零的不照光和不加酶液）3．560nm处测吸光值，酶活性以抑制NBT光反应50%为一个酶活单位表示。（实验中可将除酶液和核黄素外其它试剂按比例混合好后，一次加入5ml，然后依次加入核黄素和酶液，以不加酶液的照光管为对照。）均以50mmol/LPBS均以50mmol/LPBS配置PH=7.8dl-甲硫氨酸（Met）39mmol/L1.1638g/200mlNBT0.225mmol/L(0.01840克)/100ml0.0368g/200mlEDTA-Na20.6mmol/L0.0223g/100ml核黄素0.012mmol/L0.0045g/L或0.0045g/100ml用时稀释10倍各试剂溶液均在用前配置，配置好后均应避光保存，尤其是核黄素，必须随用随配，避光保存。试验进行时一次性加5ml的反应混合液配置方法：Met+NBT+EDTA-Na2200mll+200ml+100mlSOD酶测定时，酶液量50μl偏少，改为100μl为佳，另外反应时间30分钟过长，改为20分钟适合。SOD活性（酶单位u/gFW）=(A0-A1)*V/A0*0.5*FW*aA0对照照光管光吸收值；A1样品管光吸收值。V样液总体积（ml）5mlFW鲜重（g）1ga测定用样品的量（ml）0.1ml实验4：CAT活性（过氧化氢酶）4.1所需试剂：①PBS（PH=7.0）50mmol/L（61份50mmol/lNa2HPO4,39份50mmol/lNaH2PO4）②15mmol/LH2O2(以30%H2O2配)（取85.2μL30%H2O2，以50mmol/LPBS((PH7.0)定容至100ml）4.2步骤：1.3ml50mmol/LPBS(PH7.0)加入50μl酶液（加比色杯的盖子摇2-3下，让酶液与缓冲液充分分散）再加入5μl15mmol/LH2O2摇匀（加比色杯的盖子摇2-3下，让酶液与缓冲液充分分散）。2．240nm处作时间扫描（每0.5分钟测1次，共测3分钟）3．CAT活性以每分钟消耗1μmol的H2O2为一个酶活单位。活性计算改动：（以每分钟OD值减少0.01为一个酶活单位u）（2005和2006年均是按OD值减少0.01算的）（以每分钟OD值减少0.1为一个酶活单位u）注意：以PBS作空白调零50mmol/L实验5：APX活性(抗坏血酸过氧化物酶)（即ASA—POD活性）5.1所需试剂：ASA（分子量167.12）0.3mmol=0.052836(g)(乙=胺四乙酸=钠)EDTA—Na2(以PBS配成0.1mmol/L=0.0372(g)/L) 50mmol/LPBS(pH7.0)9mmol/LH2O2(以30%H2O2配制)(51μl30%H2O2定容至100ml)计算为：K1=2.8，K2=3，K3=-1，K4=100可得到总取样（5ml酶液或1g样）的最终活性。酶活性单位为μmol/g(鲜重)·min以后APX活性测定可参考沈文飚：抗坏血酸过氧化物酶活性测定的探讨3ml反应液中含50mmol/LPBS,pH7.0,0.1mmol/LEDTA（或EDTA—Na2），0.1mmol/LH2O2，0.5(或0.3)mmol/LAsA，最后加入适量酶液（20、50、100ul均可）启动反应，连续记录测定室温下290nm吸收值的变化。以不加H2O2作为对照，H2O2本身对AsA的氧化作用在测定时间内由于吸收值变化太小可忽略不计。室温下每分钟氧化1umolAsA的酶量作为一个酶活性单位(U)(吸光系数为2.8mmol/Lcm)5.2步骤：1.配反应液（50mmol/LPBS(pH7.0)，内含0.1mmol/LEDTA—Na2，含0.3mmol/LASA）2.样品池加入3ml反应液，加入50μl酶液，最后加入5μl9mmol/LH2O2(盖上比色杯的盖子摇匀，2—3次)在290nm处作时间扫描，每10秒测一次，共测30秒。（注意：在测定中消光值应该是不断减小的）3.根据OD290值变化，计算单位时间内AsA消耗量，（ASA氧化消耗量按消光系数2.8mmol/L·cm。），酶活性以单位时间每消耗1μmol的ASA为一个酶活单位，最后计算样品的APX活性（单位为：U/g(鲜重)·min）。（活性计算改动）根据OD290值变化，计算单位时间内AsA减少量（ASA氧化量按消光系2.8mmol/L·cm），并计算样品APX终活性。酶活性单位为μmol/g(鲜重)·min实验6ASA含量测定6.1步骤：1.取样品母液0.2ml,1.4ml，75mmol/lNaH2PO4溶液（pH值7.4）(2.34gNaH2PO4·2H2O定容至200ml，用NaOH将pH调至7.4)混合；（75mmol/lNaH2PO4溶液亦可用150mmol/lNaH2PO4溶液稀释1倍得到）2.依次加入（1）10%偏磷酸（26.3158g（2）44%磷酸（26ml85%磷酸+41ml蒸馏水）0.4ml;(3)4%2,2’二联吡啶（称取4.0g70%酒精配制（95%乙醇70份重量+蒸馏水25份重量）3%FeCl30.2ml(称取5.0gFeCl3·6H2O定容至100ml)，摇匀，于37℃保温1.0h（5）4.以标准曲线方程计算ASA含量6.2标准曲线的制作：（1）称取10mgASA分析纯，以5%偏磷酸定容至100ml,成100微克/毫升的标准液；（2）按下表取8支试管，按照表中的程序加液试管编号12345678标准液（ml）00.020.040.060.080.100.120.145%·偏磷酸（ml）0.200.180.160.140.120.100.080.06ASA含量（微克）02468101214按前面步骤1、2所述依次加入各反应液，最后测525nm波长下的光吸收值，作过原点标准曲线，求线性方程。实验7：GSH含量测定7.1步骤：1.取样品母液0.2ml，加入150mmol/LNaH2PO4溶液（pH7.7）（11.70gNaH2PO4·2H2O定容至500ml用氢氧化钠调pH至7.7）2.6ml2.混匀再加入0.2mlDTNB溶液（=硫代硝基苯甲酸DTNB75.3mg溶于30ml0.1mol/L磷酸缓冲液pH6.8）摇匀。[实际配置时，称75.3×2=150.6mg，即0.1506gDTNB溶于60mlPBS中]3.在30℃保温5分钟，【有些文献（如龚吉蕊、於丙军）方法同样用DTNB显色，都是在常温下显色30分钟因此可将反应时间适当延长至10分钟】7.2根据标准曲线（GSH）方程，计算GSH含量。标准曲线制作：1.称取100mgGSH分析纯，以5%偏磷酸定容至100ml，成1mg/ml即1000ug/ml的标准液。2.参照实验6标液方法。试管编号12345678标准液（ml）00.020.040.060.080.100.120.145%·偏磷酸（ml）0.200.180.160.140.120.100.080.06GSH(微克）×02468101214正确GSH含量（微克）0204060801001201403.以GSH含量为0的溶液调零，制作过原点标准曲线（及方程）所需试剂：NaH2PO4（150mmol/L）→称23.41gNaH2PO4·2H2O定容至1L（或称5.85定容至250ml）DTNB（二硫代硝基苯甲酸）0.1mol/LPBS(PH6.8)（参照邹琦的书）实验8：脯氨酸测定8.1步骤：1.取0.5g叶片，用5ml3%磺基水扬酸溶液提取，匀浆液在沸水浴浸提10分钟，冷却后，以3000g2.取2ml待测液，加入2ml蒸馏水，再加入2ml冰乙酸和4ml2.5%茚三酮溶液，置沸水溶显色60min，冷却后，加入4ml甲苯充分振荡提取红色物后，静置后，取甲苯相（将移液枪的量程调至3.0ml吸取甲苯相，注意不要将枪伸到水相中。）测定520nm，波长处的吸收值，依据标准曲线计算含量。8.2标准曲线制作：1.标准液配制；准确称取25mg脯氨酸，用蒸馏水溶解后定容至250ml，其浓度为100μg/ml，再取10ml此液，蒸馏水定容至100ml，即为10μg·ml-1的脯氨酸标准液。（脯氨酸标准液最好现用现配，放在冰箱也易变性）2.取7支20ml具塞试管按下表加入各试剂1234567标准脯氨酸（ml）00.20.40.81.21.62.0H2O（ml）21.81.61.20.80.40冰乙酸（ml）2222222显色液（ml）4444444脯含量（ug）02481216203%磺基水杨酸（ml）22222223.置沸水浴中显色60min。冷却后（以后步骤同前）依据测定值绘制造原点标准曲线（以脯含量为0的试管作空白调零）为方程。8.3所需试剂：★3%磺基水杨酸水溶液（称3g磺基水杨酸，蒸馏水定容至100ml）★甲苯★85%磷酸★冰乙酸 ★2.5%酸性茚三酮显色液称取2.5g茚三酮，加入60ml冰乙酸和40ml6.0mol/L磷酸。贮于棕色瓶，4℃下2~实际配置时，需称10g，配制400ml（其中冰乙酸240ml，磷酸160ml6mol/L磷酸液（40.8ml85%磷酸定容至100ml）实际配制时81.6ml定容至200ml（68ml85%磷酸定容至1升，为1