发酵工业微生物菌种制备原理和技术

第二章发酵工业微生物菌种制备原理和技术1、能在易得、价廉得原料制成得培养基上迅速生长,且代谢产物产量高。2、可以在要求不高、易于控制得培养条件下迅速生长与发酵;3、生长速度快,发酵周期较短。发酵周期短得优点在于感染杂菌得机会减少;提高设备得利用率。4、满足代谢控制得要求:根据代谢控制要求,选择单产高得营养缺陷型或调节突变株或野生突变株;5、抗噬菌体与杂菌能力强,不易被感染;6、菌种纯粹,遗传性状稳定(不易变异退化),以保证发酵生产与产品质量得稳定性。7、菌体不就是病源菌,不产生任何有害得生物活性物质与毒素。二、发酵工业生产对菌种得要求三、发酵工业用菌种得分离与筛选1、工业用菌种得来源:有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买;从大自然中分离筛选新得微生物菌种。经过诱变得菌株;通过DNA重组得工程菌;原生质体融合菌株。(一)微生物菌种分离2、菌株分离(separation)与筛选(screening)定义分离与筛选就就是将一个混杂着各种微生物得样品通过分离技术区分开,并按照实际要求与菌株得特性采取迅速、准确、有效得方法对她们进行分离、筛选,进而得到所需微生物得过程。菌种纯化就是指在特定环境中只让1种来自同一祖先得微生物群体生存得技术。菌株分离、筛选虽为两个环节,但却不能绝然分开,因为分离中得一些措施本身就具有筛选作用。工业微生物产生菌得筛选一般包括两大部分:一就是从自然界分离所需要得菌株,二就是把分离到得野生型菌株进一步纯化并进行代谢产物鉴别。3、分离思路

新菌种得分离就是要从混杂得各类微生物中依照生产得要求、菌种得特性,采用各种筛选方法,快速、准确地把所需要得菌种挑选出来。实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌,也必须重新进行分离纯化。有了优良得菌种,还要有合适得工艺条件与合理先进得设备与之配合。定方案:首先要查阅资料,了解所需菌种得生长培养特性。采样:有针对性地采集样品。增殖:人为地通过控制养分或培养条件,使所需菌种增殖培养后,在数量上占优势。分离:利用分离技术得到纯种。发酵性能测定:进行生产性能测定。这些特性包括形态、培养特征、营养要求、生理生化特性、发酵周期、产品品种与产量、耐受最高温度、生长与发酵最适温度、最适pH值、提取工艺等。4、新种分离与筛选得步骤菌种筛选主要步骤调查研究及查阅充分的资料设计实验方案确定采集样品的生态环境采样确定特定的增殖条件增殖培养确定特殊的选择培养基及可能的定性或半定量快速检出法平板分离原种斜面确定发酵培养基础条件筛选初筛（1株1瓶）复筛（1株3～5瓶）结合初步工艺条件摸索再复筛（1株3～5瓶）3～5株单株纯种分离生产性能试验、毒性试验菌种鉴定(1)采样A、采样途径向菌种保藏机构索取有关得菌株,从中筛选所需菌株。由自然界采集样品,如土壤、水、动植物体等,从中进行分离筛选。总体来讲土壤样品得含菌量最多。一般园田土与耕作过得沼泽土中,以细菌与放线菌为主;富含碳水化合物得土壤与沼泽地中,酵母与霉菌较多,如一些野果生长区与果园内。从一些发酵制品中分离目得菌株,如从酱油中分离蛋白酶产生菌,从酒醪中分离淀粉酶或糖化酶得产生菌等。从自然界筛选B、采样季节:以温度适中,雨量不多得秋初为好。C、采土方式:在选好适当地点后,用小铲子除去表土,取离地面5-15cm处得土约10g,盛入清洁得牛皮纸袋或塑料袋中,扎好,标记,记录采样时间、地点、环境条件等,以备查考。为了使土样中微生物得数量与类型尽少变化,宜将样品逐步分批寄回,以便及时分离。(2)根据微生物生理特点采样A、根据微生物营养类型(局部环境)每种微生物对碳\氮源得需求不一样,分布也有差异。研究表明,微生物得营养需求与代谢类型与其生长环境有着很大得相关性。如:纤维素酶产生菌:森林土;蛋白酶与脂肪酶得产生菌:肉类加工厂附近与饭店排水沟得污水、污泥中;蛋白酶、糖化酶得菌株:在面粉加工厂、糕点厂、酒厂及淀粉加工厂等场所;大家有疑问的，可以询问和交流可以互相讨论下，但要小声点以糖质为原料得酵母菌:通常到蜂蜜、蜜饯、甜果及含糖浓度高得植物汁液中采样。果胶酶产生菌:柑橘、草莓及山芋等果蔬样品得腐烂部分及果园土;筛选代谢合成某种化合物得微生物:从大量使用、生产或处理这种化合物得工厂附近采集样品;利用碳氢化合物为碳源得菌株:在油田附近得土壤。筛选一些具有特殊性质得微生物时,需根据该微生物独特得生理特性到相应得地点采样(极端环境)。如:高温酶产生菌:温度较高得南方,或温泉、火山爆发处及北方得堆肥中采集样品;低温酶产生菌:寒冷得地方,如南北极地区、冰窖、深海中采样;耐压菌:海洋底部采样。耐高渗透压酵母菌:通常到甜果、蜜饯或甘蔗渣堆积处采样。如有人曾在花蜜中分离到一株能耐30%高糖得耐高渗透压得酵母菌。(3)含微生物样品得富集培养(优化得过程)

----施加选择性压力分离法收集到得样品,如含目标菌株较多,可直接进行分离。如果样品含目标菌种很少,就要设法增加该菌得数量,进行增殖(富集)培养。富集培养就就是给混合菌群提供一些有利于所需菌株生长或不利于其它菌型生长得条件,以促使目标菌株大量繁殖,从而有利于分离它们。定义:利用不同种类得微生物其生长繁殖对环境与营养要求得不同,如碳、氮源、pH、温度、渗透压、需氧等生理因素等,认为控制这些条件,使之利于某类或某种微生物生长,而不利于其它种类微生物得生存,以达到使目得菌种占优势,而得以快速分离纯化得目得。A、控制培养基得营养成分在分离该类菌株之前,可在增殖培养基中人为加入相应得底物作惟一碳源或氮源。如:筛选纤维素酶产生菌时,以纤维素作为唯一碳源进行增殖培养;分离耐高渗酵母菌:首先要到含糖分高得花蜜、糖质中去取样。富集培养基为5%～6%得麦牙汁,30%～40%葡萄糖,pH3～4,在20～25℃温度下进行培养,可以达到富集得目得。

B、控制培养条件通过它们对pH、温度及通气量等其她一些条件得特殊要求加以控制培养,达到有效得分离目得。如:细菌、放线菌得生长繁殖一般要求偏碱(7、0～7、5),霉菌与酵母菌要求偏酸(4、5～6)。筛选极端微生物时,需针对其特殊得生理特性,设计适宜得培养条件,达到富集得目得。

(4)微生物得纯种分离

尽管通过增殖培养效果显著,但还就是处于微生物得混杂生长状态。因此还必须分离,纯化。纯种分离方法常选用单菌落分离法。纯种分离得方法有划线分离法、稀释分离法。A、稀释平皿分离法100ml1g9ml9ml9ml9ml9ml9ml1/1001/100010-810-710-610-510-41ml1ml1ml1ml1ml(1)稀释纯种分离稀释平皿分离法b、涂布平皿分离法a、倾注平皿分离法a、连续划线分离法b、分区划线分离法B、平皿划线分离法5、筛选方法

利用特殊得分离培养基对大量混杂微生物进行初步分离;采用与生产相近得培养基与培养条件,通过三角瓶得容量进行小型发酵试验,以求得适合于工业生产用菌种。在平板培养基中加入溶解性较差得底物,使培养基混浊。能分解底物得微生物便会在菌落周围产生透明圈,圈得大小初步反应该菌株利用底物得能力。该法在分离水解酶产生菌时采用较多,如脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、核酸酶产生菌都会在含有底物得选择性培养基平板上形成肉眼可见得透明圈。(1)透明圈法用刚果红染色法鉴定筛选降解纤维素得菌株

羧甲基纤维素钠作培养物淀粉酶产生菌得分离:分离淀粉酶产生菌时,培养基以淀粉为惟一碳源,待样品涂布到平板上,经过培养形成单个菌落后,再用碘液浸涂,根据菌落周围就是否出现透明得水解圈来区别产酶菌株。有机酸产生菌得分离在选择性培养基中加入碳酸钙,使平板成混状,将样品悬浮液涂抹到平板上进行培养,由于产生菌能够把菌落周围得碳酸钙水解,形成清晰得透明圈,可以轻易地鉴别出来。分离乳酸产生菌时,由于乳酸就是一种较强得有机酸,因此,在培养基中加入得碳酸钙不仅有鉴别作用,还有酸中与作用。

对于一些不易产生透明圈产物得产生菌,可在底物平板中加入指示剂或显色剂,使所需微生物能被快速鉴别出来。如:果胶酶产生菌得分离筛选果胶酶产生菌时,用含0、2%果胶为惟一碳源得培养基平板,对含微生物样品进行分离,待菌落长成后,加入0、2%刚果红溶液染色4h,具有分解果胶能力得菌落周围便会出现绛红色水解圈。(2)变色圈法谷氨酸产生菌得分离在分离谷氨酸产生菌时,可在培养基中加入溴百里酚蓝,它就是一种酸碱指示剂,变色范围在pH6、2～7、6,当pH在6、2以下时为黄色,pH7、6以上为蓝色。若平板上出现产酸菌,其菌落周围会变成黄色,可以从这些产酸菌中筛选谷氨酸产生菌。脂肪酶产生菌得分离为提高分离筛选效率,多采用固体平板得变色圈法,以吐温为底物,尼罗蓝(Nileblue)作为指示剂,根据变色圈大小来判断脂肪酶活性得高低;也可用甘油三丁酸酯为底物,罗丹明B为指示剂,以荧光圈得大小来测定。生长圈法通常用于分离筛选氨基酸、核苷酸与维生素得产生菌。工具菌就是一些相对应得营养缺陷型菌株。将待检菌涂布于含高浓度得工具菌并缺少所需营养物得平板上进行培养,若某菌株能合成平板所需得营养物,在该菌株得菌落周围周围便会形成一个混浊得生长圈。如嘌呤营养缺陷型大肠杆菌(如E、coliP264)与不含嘌呤得琼脂混合倒平板,在其上涂布含菌样品保温培养,周围出现生长圈得菌落即为嘌呤产生菌。(3)生长圈法针对某些微生物得产物对产生菌得筛选没有直接得选择性指示作用,常采用随机分离法进行分离常用于抗生素产生菌得分离筛选。抑菌圈法就是常用得初筛方法,工具菌采用抗生素得敏感菌。若被检菌能分泌某些抑制菌生长得物质,如抗生素等,便会在该菌落周围形成工具菌不能生长得抑菌圈,很容易被鉴别出来。抗生素筛选(4)随机分离方法------抑菌圈法6、生产性能得测定由于纯种分离后,得到得菌株数量非常大,如果对每一菌株都作全面或精确得性能测定,工作量十分巨大,而且就是不必要得。一般采用两步法,即初筛与复筛,经过多次重复筛选,直到获得1～3株较好得菌株,供发酵条件得摸索与生产试验,进而作为育种得出发菌株。这种直接从自然界分离得到得菌株称为野生型菌株,以区别于用人工育种方法得到得变异菌株(亦称突变株)。7、毒性试验自然界得一些微生物就是在一定条件下产毒得,将其作为生产菌种应当十分当心,尤其与食品工业有关得菌种,更应慎重。据有得国家规定,微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉与枯草杆菌作为食用无须作毒性试验外,其她微生物作为食用,均需通过两年以上得毒性试验。典型得微生物新种分离筛选过程(二)微生物菌种得选育(育种)工业菌种得育种:就是运用遗传学原理与技术对某个用于特定生物技术目得得菌株进行得多方位得改造。通过改造,可使现存得优良性状强化,或去除不良性质或增加新得性状。选育目得:为生成提供各种类型得突变株大幅度提高菌种产生有价值代谢产物水平,还可以改进产品质量,去除不需要得代谢产物或产生新得代谢产物。工业菌种育种得方法自然选育诱变选育抗噬菌体菌种得选育杂交育种原生质体融合技术基因工程技术1、自然选育定义:不经人工处理,利用微生物得自然突变进行菌种选育得过程。目得:纯化菌种,防止菌种退化,稳定生产,提高产量。缺点:效率低方法:将菌种制成菌悬液,用稀释法在固体平板上分离单菌落,再分别测定单菌落得生产能力,从中选出高水平菌种。2、诱变育种以微生物得自然变异作为基础得生产选种得机率并不很高,一个基因得自然突变频率仅10-6-10-10左右。诱变育种:利用各种产生诱发突变得物理因素与化学试剂处理微生物细胞,提高基因突变频率,再通过适当得筛选方法获得所需要得高产优质菌种得育种方法。就是目前国内外提高菌种产量、性能得主要手段。诱变方法:物理、化学或生物诱变方法(1)诱变育种原理:利用诱变处理方法导致基因突变。

物理诱变剂:射线如紫外线、X—射线、γ—射线,快中子;物理因素中目前使用得最方便而且十分有效得就是紫外线。许多高产菌株得选育都用过紫外线,对于一般实验室、中小型工厂都适用,也很安全。其她得几种射线都就是电离性质得,有一定得穿透力,一般都由专业人员在专门得设备中使用,否则有一定危险性。化学诱变剂:化学因子如碱基类似物、5—氟尿嘧啶、烷化剂等。化学诱变剂中使用最多、最有效得就是烷化剂。(2)诱变剂与诱变处理超净工作台小型X射线衍射仪Co60射线机诱变剂诱变剂得剂量处理时间缓冲剂中止反应方法亚硝酸(HNO2)0、01～0、1mol/L5～10minpH值4、5,1mol/L醋酸缓冲液pH8、6,0、07磷酸二氢钠硫酸二乙酯(DES)0、5～1％10～30min,孢子18～24hpH值7、0,0、1mol/L磷酸缓冲液硫代硫酸钠或大量稀释甲基磺酸乙酯(EMS)0、05～0、5mol/L10～60min,孢子3～6hpH值7、0,0、1mol/L磷酸缓冲液硫代硫酸钠或大量稀释亚硝基胍(NTG)0、1～1、0mol/mL,孢子3mg/mL15～60min,90～120minpH值7、0,0、1mol/L磷酸缓冲液或Tris缓冲液大量稀释亚硝基甲基胍(NMU)0、1～1、0mol/mL15～90minpH值6、0～7、0,0、1mol/L磷酸缓冲剂或Tris缓冲液大量稀释氮芥0、1～1、0mol/mL5～10minNaHCO3甘氨酸或大量稀释乙烯亚胺1:1000～1:1000030～60min

硫代硫酸钠或大量稀释羟胺(NH2OH∙HCl)0、1～0、5％数小时或生长过程中诱变

大量稀释氯化锂(LiCl)0、3～0、5％加入培养基中,在生长过程中诱变

大量稀释秋水仙碱(C22H25NO6)0、01～0、2％加入培养基中,在生长过程中诱变

大量稀释常用化学诱变剂诱变处理方法大多数情况下,就突变数量而言,要比电离辐射更有效。化学诱变剂就是很经济得,因为只需要少量得合适得诱变剂,设备就是实验室得一般玻璃器皿,一个蒸气罩。而用电离辐射,设备费用大,并要注意安全性。大部分诱变剂就是致癌剂,所以在使用中必须非常谨慎,要避免化学诱变剂与皮肤接触,,且切勿吸入其蒸气,有人对某些诱变剂极其敏感,甚至未直接接触就会过敏,这就更要当心。使用化学诱变剂得优缺点:(3)诱变育种步骤出发菌株得选择处理菌悬液得制备诱变处理中间培养分离与筛选A、出发菌株得选择自然界新分离得野生型菌株,对诱变处理较敏感,容易达到好得效果。在生产中经生产选种得到得菌株与野生型较相像,也就是良好得出发菌株。每次诱变处理都有一定提高得菌株,往往多次诱变能积累较多得提高。出发菌株开始时可以同时选2～3株,在处理比较后,将更适合得出发菌株留作继续诱变。要尽量选择单倍体细胞、单核或核少得多细胞体来作出发诱变细胞,这就是由于变异性状大部分就是隐性得,特别就是高产基因。诱变剂就是作用于营养细胞,就要选对数期得细胞:有得作用于休止期,就可选用孢子。

B、处理菌悬液得制备这一步骤得关键就是制备单细胞与单孢子状态得、活力类似得菌悬液,为此要进行合适培养基得培养,并要离心,洗涤,过滤。带玻璃珠得三角瓶内,加无菌水C、诱变处理诱变剂得选择遗传不稳定得菌株,采用温与得诱变剂,或采用已见效果得诱变剂;遗传上较稳定得菌株则采用强烈得、不常用得、诱变谱广得诱变剂。不应常采用同一种诱变剂反复处理,以防止诱变效应饱与;但也不要频频变换诱变剂,以避免造成菌种得遗传背景复杂,不利于高产菌株得稳定。考虑诱变剂本身得特点。例如紫外线主要作用于DNA分子得嘧啶碱基,而亚硝酸则主要作用于DNA分子得嘌呤碱基。紫外线与亚硝酸复合使用,突变谱宽,诱变效果好。②诱变条件得选择仅仅采用诱变剂得理化指标控制诱变剂得用量常会造成偏差,不利于重复操作。例如:同样功率得紫外线照射诱变效应还受到紫外灯质量及其预热时间、灯与被照射物得距离、照射时间、菌悬液得浓度、厚度及其均匀程度等诸多因素得影响。另外,不同种类与不同生长阶段得微生物对诱变剂得敏感程度不同,所以在诱变处理前,一般应预先做诱变剂用量对菌体死亡数量得致死曲线,选择合适得处理剂量。致死率表示诱变剂造成菌悬液中死亡菌体数占菌体总数得比率。③诱变剂剂量得确定诱变处理剂量得选择就是一个比较复杂得问题,一般正突变较多出现在偏低剂量中,而负突变则较多地出现于偏高剂量中。对于经过多次诱变而提高了产量得菌株,在较高剂量负突变率更高。因此,目前处理量已从以前采用得死亡率90％～99％减低为死亡率70％～80％。B、megateriumMPF-906得致死率曲线④复合诱变诱变育种中还常常采取诱变剂复合处理,使它们产生协同效应。复合处理可以将两种或多种诱变剂分先后或同时使用,也可用同一诱变剂重复使用。因为每种诱变剂有各自得作用方式,引起得变异有局限性,复合处理则可扩大突变得位点范围,使获得正突变菌株得可能性增大,因此,诱变剂复合处理得效果往往好于单独处理。

D、中间培养由于在发生了突变尚未表现出来之前,有一个表现延迟得过程,即细胞内原有酶量得稀释过程(生理延迟),需3代以上得繁殖才能将突变性状表现出来。此过程称为中间培养。这个过程对今后得筛选与获得稳定菌株都就是极为重要得。方法:让变异处理后细胞在液体培养基中培养几小时,以让细胞得遗传物质复制,让细胞繁殖几代,以得到纯得变异细胞。若不经液体培养基得中间培养,直接在平皿上分离就会出现变异与不变异细胞同时存在于一个菌落内得可能,形成混杂菌落,以致造成筛选结果得不稳定与将来得菌株退化。D、分离与筛选筛选分初筛与复筛。初筛以迅速筛出大量得达到初步要求得分离菌落为目得,以量为主。复筛则就是精选,以质为主,也就就是以精确度为主。因此在具体方法上就有差异。

初筛可以在平皿上直接以菌落得代谢产物与某些染料或基质得作用形成得变色圈或透明圈得大小来挑取参加复筛者,而将90%得菌落淘汰。在数量减少后就要仔细比较参加复筛与再复筛得菌株,最后才能选得优秀菌株。在以后得复筛阶段,还应不断结合自然分离,纯化菌株。摇床复筛降解纤维素产生产透明圈病毒产生产空斑实例1:紫外线得诱变育种紫外线诱变一般采用15W紫外线杀菌灯,波长为2537A、灯与处理物得距离为15～30cm,照射时间依菌种而异,一般为几秒至几十分钟。一般我们常以细胞得死亡率表示,希望照射得剂量死亡率控制在70～80%为宜。被照射得菌悬液细胞数,细菌为106个/ml左右,霉菌孢子与酵母细胞为106～107个/ml。由于紫外线穿透力不强,要求照射液不要太深,约0、5～1、0cm厚,同时要用电磁搅拌器或手工进行搅拌,使照射均匀。由于紫外线照射后有光复活效应,所以照射时与照射后得处理应在红灯下进行。(1)将细菌培养液以3000r／min离心5min,倾去上清液,将菌体打散加入无菌生理盐水再离心洗涤。(2)将菌悬液放入一已灭菌得,装有玻璃珠得三角瓶内用手摇动,以打散菌体。将菌液倒入有定性滤纸得漏斗内过滤,单细胞滤液装入试管内,一般处于浑浊态得细胞液含细胞数可达108个／ml左右,作为待处理菌悬液。(3)取2～4m1制备得菌液加到直径9cm培养皿内,放入一无菌磁力搅拌子,然后置磁力搅拌器上、15W紫外线下30cm处。在正式照射前,应先开紫外线10min,让紫外灯预热,然后开启皿盖正式在搅拌下照射10～50s。操作均应在红灯下进行,或用黑纸包住,避免白炽光。

操作步骤(4)取未照射得制备菌液与照射菌液各0、5ml进行稀释分离,计数活菌细胞数。(5)取照射菌液2ml于液体培养基中(300ml三角瓶内装30ml培养液),120r／min振荡培养4～6h。(6)取中间培养液稀释分离、培养。(7)挑取菌落进行筛选。实例2:亚硝基胍诱变曲霉菌

N—甲基—N'-硝基-N-亚硝基胍(NGN,MNNG或TG)对真核或原核微生物都有强烈得诱变作用。其精确得作用机制尚不很清楚,据认为就是伴随着重氮甲烷得生成及在酸性条件下生成亚硝酸,直接作用于细胞内得DNA复制系统,从而诱发了变异。MNNG得诱变作用随pH得升高而增强。(1)单孢子悬液制备取斜面,加入6ml0、1mol／LpH6、0得磷酸缓冲液,用接种环刮下孢子,振荡试管,立即通过带滤纸漏斗过滤,由此制得单孢子悬液,若孢子液浑浊状,其孢子浓度可达l06个／ml,此为待处理孢子悬液。(2)MNNG溶液得制备用分析天平称取2mg,加入2ml0、1mol／LpH6、0磷酸缓冲液,于暗处振荡溶解。操作步骤(3)诱变处理吸取MNNG溶液lml,加入到1m1孢子悬液中,30℃振荡30min,立即稀释1000倍停止作用,然后以10-2,10-4两个稀释度分离培养,30℃3天后计数。(4)死亡率计算将未处理得孢子液1ml加入1ml磷酸缓冲液中,同上逐级稀释分离,30℃下培养3天。根据处理前后得活孢子数可计算出死亡率。(5)挑取菌落进行糖化酶及蛋白酶产量筛选、3、基因育种基因重组育种:就是运用体外DNA各种操作或修改手法获得目得基因,再借助于病毒、细菌质粒或其她载体,将目得基因转移至新得宿主细胞并使其在新得宿主细胞系统内进行复制与表达,或者通过细胞间得相互作用,使一个细胞得优秀性状经其间遗传物质得交换而转移给另—个细胞得方法。一个完整得基因克隆过程包括以下步骤(1)获得待克隆得DNA片段(基因);(2)目得基因与载体在体外连接;(3)重组DNA分子导入宿主细胞;(4)筛选、鉴定阳性重组子;(5)重组子得扩增与／或表达。4、原生质体育种定义:通过酶解作用将两个亲株得细胞壁去除,在高渗条件下释放出只有原生质膜包被着得球状原生质体,将两个亲株得原生质体在高渗条件下进行混合,加入融合促进剂聚乙二醇、仙台病毒或电融合等助融,使她们相互凝集。通过细胞质融合,促使两套基因组之间得接触、交换、遗传重组,在适宜得条件下使细胞壁再生,在再生得细胞中获得重组体。原生质休融合育种就是基因重组得一种重要方法。原生质体育种技术主要有原生质体融合、原生质体转化技术,原生质体诱变育种等。原生质体融合一般包括标记菌株得筛选、原生质体得制备、原生质体得融合、融合子得选择、实用性菌株得筛选等。

(1)原生质体融合育种得特点杂交频率较高:细胞壁去除后在高渗条件下形成类似于球形得原生质体。受接合型或致育型得限制较小:二亲株中任何一株都可能起受体或供体得作用,因此有利于不同种属间微生物得杂交。遗传物质传递更为完整:原生质体融合就是二亲株得细胞质与细胞核进行类似得合二为一得过程。、存在着两株以上亲株同时参与融合形成融合子得可能性。有可能采用产量性状较高得菌株作融合亲株。提高菌株产量得潜力较大。有助于建立工业微生物转化体系。(2)原生质体融合育种步骤标记菌株得筛选与稳定性验证。原生质体制备。等量原生质体加聚乙二醇促进融合。涂布于再生培养基,再生出菌落。选择性培养基上划线生长,分离验证,挑取融合子进一步试验、保藏。生产性能筛选。原生质体融合得基本过程(3)原生质体融合育种得要点标记菌种得选择获得标记菌种得方法就是采用常规诱变育种,筛选出营养缺陷型或／与抗药性菌株。这里最重要得就是标记必须稳定。采用抗药性菌株除可作标记外,在实验室中还可排除杂菌污染得干扰。为得就是确证融合得成功,可以采用多标记菌种。原生质体得制备:原生质体得制备主要就是在高渗压溶液中加入细胞壁分解酶,将细胞壁分离剥离,结果剩下由原生质膜包住得类似球状得细胞,它保持原细胞得一切活性。放线菌与细菌制备原生质体主要采用溶菌酶;酵母与霉菌一般可用蜗牛酶或纤维素酶等。有时需结合其它一些措施,如在生长培养基中添加甘氨酸、蔗糖或抗生素等,以提高细胞壁对酶解得敏感性。

对于不同微生物,原生质体得高渗稳定液组成也就是不同得。如:细菌得稳定液常用SMM液(用于芽孢杆菌原生质体制备与融合,其主要成分就是蔗糖0、5M,顺丁烯二酸0、02M,MgCl20、02M)与DF液(用于棒状杆菌原生质体制备与融合,主要成分就是蔗糖0、25M,琥珀酸0、25M,EDTA0、001M,K2HPO40、02M,KH2PO40、11M,MgCl20、01M)。在链霉菌中用得较多得就是P液(主要成分蔗糖0、3M,MgCl20、01M,CaCl20、25M及少量磷酸盐与无机离子)。真菌中广为使用得就是0、7MNaCl或0、6MMgSO4溶液,高渗稳定液使原生质体内空泡增大,浮力增加,易与菌丝碎片分开。

影响原生质体制备得因素菌体得前处理:为了使酶作用得效果好一些,可将菌作一些前处理。如细菌加入亚抑制剂量得青霉素。菌体得培养时间:为了使细胞易于原生质体化,一般选择增殖期得菌体。酶浓度:对于不同种属得微生物,不仅对酶得种类要求不同,就就是对酶得浓度也有差异。另外,最佳酶浓度还随不同得生长期得菌体而变化。酶处理温度破壁时得pH值渗透压稳定剂等渗透压在原生质体制备中,不仅起到保护原生质体免于膨裂,而且还有助于酶与底物得结合,渗透压稳定剂多采用甘露醇,山梨醇,蔗糖等有机物与KCl与NaCl等无机物。稳定剂得使用浓度一般为0、3～0、8mol／L。微生物细胞壁主要成分去壁方法革兰氏阳性菌

芽孢杆菌

葡萄球菌

链霉菌小单胞菌肽聚糖溶菌酶处理溶葡萄球菌素处理溶菌酶处理(菌丝生长时补充0、5～5、0%甘氨酸或10～34%蔗糖)溶菌酶处理(菌丝生长时补充0、2～0、5%甘氨酸)革兰氏阴性菌

大肠杆菌碱性普罗委登斯菌

黄色短杆菌肽聚糖与脂多糖溶菌酶与EDTA处理溶菌酶与EDTA处理溶菌酶处理(生长时补充0、41M蔗糖及0、3u/ml青霉素)霉菌纤维素与几丁质纤维素酶或真菌中分离得溶壁酶酵母菌葡聚糖与几丁质蜗牛酶一些微生物得去壁方法(4)原生质体得融合影响原生质体融合得因素不同微生物得原生质体得最适再生条件不同,甚至一些非常接近得种,最适再生条件也往往有所差别;再生培养基成分及培养温度。最重要得一个共同点就是都需要高渗透压。能再生细胞壁得原生质体只占总量得一部分。细菌一般再生率为3-10%。有资料报道,在再生培养基中添加牛血清白蛋白,可使枯草杆菌原生质体得再生率达100%。真菌再生率一般在20-80%。链霉菌再生率最高可达50%。菌体得前处理、菌体得培养时间;融合剂得浓度、融合剂作用得时间;阳离子得浓度、融合得温度及体系得pH值等。

(5)原生质体再生原生质体再生就就是使原生质体重新长出细胞壁,恢复完整得细胞形态结构。影响原生质体再生得因素有:菌种自身得再生性能、原生质体制备得条件、再生培养基成分、再生培养条件等。

(6)检查原生质体形成与再生得指标原生质体形成率与再生率:将用酶处理前得菌体经无菌水系列稀释,涂布于完全培养基平板上培养,计出原菌数,设该数值为A。将用酶处理后得到原生质体分别经如下两个过程得处理。用无菌水适当稀释,在完全培养基平板上培养计数,由于原生质体在低渗透压条件下会破裂失活,所以生长出得菌落数为未形成原生质体得原菌数,设该值为B。用高渗透压液适当稀释,在再生培养基平板上培养计数,生长出得菌落数为原生质体再生得菌数与未形成原生质体得原菌数之与,设该数值为C。以原生质体形成率与再生率为指标,可确定原生质体制备最佳条件。(7)筛选优良性状融合重组子重组子得检出方法有两种:直接法与间接法。直接法将融合液涂布在不补充亲株生长需要得生长因子得高渗再生培养基平板上,直接筛选出重组子;间接法把融合液涂布在营养丰富得高渗再生平板上,使亲株与重组子都再生成菌落,然后用影印法将它们复制到选择培养基上检出重组子。由于原生质体融合后会产生两种情况:一种就是真正得融合,即产生杂合二倍体或单倍重组体,较稳定遗传;另一种就是暂时得融合,形成异核体。不稳定,会分离成亲本类型,有得甚至可以异核状态移接几代。因此,要获得真正融合子,必须在融合体再生后,进行几代自然分离、选择,才能确定。5、新型微生物育种技术(1)离子注入法(2)激光诱变技术(3)微波育种技术(4)Genomeshuffling(基因组重排)技术(1)离子注入法离子注入法就是利用离子注入设备产生高能离子束(40-60kev)并注入生物体引起遗传物质得永久改变,然后从变异菌株中选育优良菌株得方法。离子注入装置—离子注入机:由离子源、质量分析器、加速器、四极透镜、扫描系统与靶室组成,可以根据实际需要省去次要部位。离子源就是离子注入机得主要部件,作用就是把需要注入得元素电离成离子,决定注入离子得种类与束流强度。H+、N+、Ar+离子就是常用得诱变剂,其中N+最常用。注入能量为20kev-30kev,注入剂量0(对照)-1016ion/cm2之间,脉冲式注入,每次连续注入得时间与间隔时间因处理得种类不同而各异,温度应控制50℃以下,真空度为10-3Pa。这只就是常用量,针对不同菌种要进行适当得调节。1996年,离子束诱变用于右旋糖酐产生菌,得到产量提高3615%得突变株。(2)激光诱变技术国内外进行激光诱变得激光器有多种,波长从远红外11818μm、1016μm到可见光694、4nm、632、8nm、530nm、441、6nm至紫外线337、1nm、265nm。几乎所有频率得激光都有诱导得效果,照射剂量一般采用1-50J/cm2,处理时间可以缩短到秒,也可以延长至数小时不等。常用得激光器有CO2、He-Ne、N分子、铵玻璃、红宝石Ar+与YAG等。其中以CO2与He-Ne激光器最为常用。激光诱变机理:国内外普遍认同得解释就是在激光辐照机体时产生光照活化效应,使核仁器抑制解除而被活化;使DNA、RNA与蛋白质系统活性提高,核糖体上蛋白质合成作用得活性增强,使机体内得生物合成增强,特别就是三羧酸酶与细胞色素氧化酶活性提高,从而提高细胞利用氧得能力并增强细胞合成ATP得能力。大量得试验资料表明,激光育种就是一种行之有效得育种新技术。如:华侨大学彭益强与张文珍教授,利用激光诱变成功筛选出高产植酸酶黑曲霉菌株“ASP2L211”,比原始菌株得植酸酶活力提高了3、75倍。浙江省微生物所吴振倡采用铜蒸气激光选育成“天兰红链霉菌”及其原生质体再生菌,其发酵单位,比出发菌株产量提高12、9%-14、4%,已推广应用。(3)微波育种技术微波辐射属于一种低能电磁辐射,具有较强生物效应得频率范围在300MHz-300GHz,对生物体内有热效应与非热效应。其热效应就是指它能引起生物体局部温度上升,从而引起生理生化反应,非热效应指在微波作用下,生物体会产生非温度关联得各种生理生化反应。在这两种效应得综合作用下,生物体会产生一系列突变效应。微波辐射属于一种低能电磁辐射,具有较强生物效应得频率范围在300MHz-300GHz,对生物体内有热效应与非热效应。其热效应就是指它能引起生物体局部温度上升,从而引起生理生化反应,非热效应指在微波作用下,生物体会产生非温度关联得各种生理生化反应。在这两种效应得综合作用下,生物体会产生一系列突变效应。4、Genomeshuffling技术Genomeshuffling(基因组改组,也有人称为“基因组重排”)技术就是微生物育种得新技术,也就是各国争相研究得新技术。Genomeshuffling只需在进行首轮改组之前,通过经典诱变技术获得初始突变株,然后将包含若干正突变得突变株作为第一轮原生质体融合得出发菌株,此后经过递推式得多轮融合,最终使引起正性突变得不同基因重组到同一个细胞株中。基因组改组技术得重组对象就是整个基因组,可以同时在整个基因组得不同位点重组,将多个亲本得优良表型通过多轮得重组集中于同一株菌株,不必了解整个基因组得序列数据与代谢网得信息。与经典得诱变方法相比,基因组改组技术可以快速、高效地筛选出优良菌株,而且这些菌株集多种正突变于一体,因此在很大程度上弥补了经典诱变方法得缺陷。第二节菌种保藏与复壮

菌种就是一种极其重要与珍贵得生物资源,菌种保藏得意义在于保持保持优良菌种得优良性状得稳定,提高菌种得存活率,减少菌种得变异,满足生产得实际需要这对于成功得工业发酵过程极为重要。菌种保藏原理:根据菌种得生理生化特点,人为创造条件使孢子或菌体得生长代谢活动尽量降低,以减少其变异。理想得菌种保藏方法应具备得条件经长期保藏后菌种存活健在。保证高产突变株不改变表型与基因型,特别就是不改变初级代谢产物与次级代谢产物生产得高产能力。菌种保藏得基本措施就是低温、干燥、真空。一、微生物菌种保藏在一定时间内使菌种不死、不变、稳定基本要求:基本方法:生活态休眠态培养基传代培养寄主传代培养冷冻干燥斜面、平板液氮、低温冰箱沙土管、冷冻真空干燥由于微生物得多样性,不同得微生物往往对不同得保藏方法有不同得适应性,因此,在具体选择保藏方法时必须对被保藏菌株得特性、保藏物得使用特点及现有条件等进行综合考虑。对于一些比较重要得微生物菌株,则要尽可能多得采用各种不同得手段进行保藏,以免因某种方法得失败而导致菌种得丧失。二、国际重要菌种保藏机构三、中国菌种保藏单位四、工业微生物菌种保藏技术(1)超低温或在液氮中冷冻保藏;(2)冷冻干燥或真空干燥保藏(3)

转接培养或斜面传代保藏;(4)土壤或陶瓷珠等载体于燥保藏。菌种保藏方法暂时保藏法

斜面传代法穿刺法长期保藏法

液体石蜡法甘油管法砂管保藏法砂土管保藏法滤纸片保藏法冷冻干燥保藏法液氮冷冻法

(一)低温定期移植法将菌种定期在新鲜琼脂培养基上传代,然后在一定得生长温度下生长与保存得传代保藏方法。可用于实验室中若干菌种得保藏。特点:此法最为简单与经济,且不要求任何特殊得设备。但此方法易发生培养基干枯、菌体自溶、基因突变。原理:保藏得菌种通过斜面、穿刺或疱肉培养基(用于厌氧细菌)培养好后,置4C˚冰箱中存放,定期进行传代培养、再存放。可用胶塞代替棉塞或在斜面上覆盖一层无菌液体石蜡来进一步延长保存期。将菌种转接在适宜固体斜面培养基上,待其充分生长后,用牛皮纸将棉塞部分包扎好(棉塞换成胶塞效果更好),置4C˚冰箱中包藏。保藏时间依微生物得种类而定。霉菌、放线菌及芽孢菌保存2－4个月移种一次,酵母菌间隔两个月,普通细菌一个月,假单胞菌两周传代一次。此法优点就是操作简单、使用方便,缺点就是保藏时间短、易被污染。(4℃菌种不能休眠,仅就是抑制微生物得生命活动)

1、斜面保藏法2、穿刺保藏法将含0、6-0、8%得琼脂培养基装试管灭菌,直立冷凝后,用接种针尖挑去少量菌体,垂直刺入琼脂培养基中心,放在适当温度下培养,待培养好后用胶塞封严,置4℃冰箱存放。缺点:易发生遗传变异;连续传代可使一些生产性状丢失或减弱,也易于污染杂菌。贵重菌株及优良菌株不易用此法。原理:将无菌石蜡加在已长好菌得斜面上,使菌种与空气隔绝,菌处于生长与代谢停止状态,同时石蜡油还可防止水分蒸发,在低温下达到较长期保藏菌种得目得。保藏温度要求在-4℃-4℃,适用于不产孢子得菌种。方法:斜面菌种,纯净优质石蜡油置三角瓶121℃灭菌1-2h,放入烘箱中(160℃)干热处理,待石蜡油清澈透明后加入斜面,其用量以高出斜面顶端1CM为准。将试管直立,置低温下保存。特点:此法实用且效果较好。霉菌、放线菌、芽孢菌可保藏两年以上,酵母菌可保藏1－2年,普通细菌也可保藏1年左右。3、液体石蜡保藏法以液体石蜡作为保藏方法时,应对需保藏得菌株预先作试验。因为某些菌株在液体石蜡下生长还十分明显,有些菌株如某些假丝酵母还会同化液体石蜡,也有得对液体石蜡保藏敏感。所有这些菌株都不能用液体石蜡保藏。为了预防不测,一般保藏株2～3年也应做一次存活试验。(二)冷冻保藏法

冷冻保藏为保藏微生物菌种得最简单而有效得方法。通过冷冻,使微生物代谢活动停止。一般而言,冷冻温度愈低,效果愈好。为了获得满意得冷冻结果,通常应在培养物中加入一定得冷冻保护剂。冷冻保藏时温度要求在-20℃以下,同时应认真掌握好冷冻速度与解冻速变。冷冻深藏得缺点之一就是培养物运输较困难。冷冻保藏种类普通冷冻保藏技术(-20℃)超低温冷冻保藏技术(-60一-80℃)液氮冷冻保藏技术1、普通冷冻保藏技术(-20℃)将液体培养物或从琼脂斜面培养物收获得细胞分接到试管或指管肉,然后贮藏于一冰箱得冷藏室中,或于温度范围在-5～-20℃得普通冰箱(-20℃)中。或者,将菌种培养在小得试管或培养瓶斜面上,待生长适度后,将试管或瓶口用橡胶塞严格封好,同上置于冰箱中保存。用此方法可以维持若干微生物得活力1—2年。应注意得就是经过一次解冻得菌株培养物不宜再用来保藏。保藏过程中应注意控制保藏温度,培养瓶或试管应严格密封。这一方法虽简便易行,但不适宜多数微生物得长期保藏。2、超低温冷冻保藏技术(-60一-80℃)要求长期保藏得微生物菌种,一般都要求在-60℃以下进行保藏。在超低温冷藏柜中保藏菌种得一般方法就是:离心收获对数生长中期至后期得微生物细胞;用新鲜培养基重新悬浮所收获得细胞;加入等体积得20％甘油或10％二甲亚砜;混匀后分装入冷冻指管或安瓿中,于-70℃超低温冰箱中保藏。如果待保藏菌种生长在斜面上,则可用含10％甘油得新配制液体培养基洗涤收获。超低温冰箱得冷冻速度一般控制在1-2℃／min。若干细菌与真菌菌种可通过此保藏方法保藏5年而活力不受影响。

3、液氮冷冻保藏技术

特点:目前广泛应用得菌种长期保藏方法,适用于大多数微生物得保藏原理:微生物在-130℃以下温度时,其新陈代谢作用停止,化学反应消失,液氮温度-196℃,这种条件下可长期保藏菌种。冷冻保护剂在液氮冷冻保藏中,最常用得冷冻保护剂就是二甲亚砜与甘油,最终使用浓度一般为甘油10％、二甲亚砜5％。所使用得甘油—般用高压蒸汽灭菌,而二甲亚砜最好为过滤灭菌。其次根据菌种不同还可选用葡萄糖、蔗糖、PVP、乳糖、脱脂乳粉作为抗冻剂。待冷冻保藏菌种悬液得制备从生长斜面制备菌悬液:每一斜面加入5ml含10％甘油得营养液体培养;用巴氏吸管吹吸斜面制成孢子及菌体细胞悬液;0、5～lml分装玻璃安瓿或液氮冷藏专用塑料瓶。从浸没培养物制备菌悬液:在浸没培养液中加入等体积20%无菌甘油;轻轻振荡混匀培养液,如果菌体絮凝较紧,则需先用玻璃珠打散;0、5-lml分装玻璃安瓿或液氮冷藏专用塑料瓶,玻璃安瓿用酒精喷灯封口;将所有封好得安瓿置于5℃冰箱中3min,以使细胞与悬浮培养基之间达到平衡。

液氮冷冻保藏微生物菌种得步骤将安瓿或液氮瓶置于铝盒或布袋中,然后置于一较大得金属容器中;将此金属容器置于控速冷冻机得冷冻室中;以1-2℃/min得致冷速度降温,直到温度达到相对温度之上几度得细胞冻结点(通常为-30℃);补加一定量得液氮至系统中,使细胞在冻结点时尽可能快地发生相变;细胞冻结后,将致冷速度降为1℃/min,直到温度达-50℃;将安瓿迅速移入液氮罐中于液相(-196℃)或气相(-156℃)中保存。如果无控速冷冻机,则一般可将安瓿或液氮瓶置于一70℃冰箱中冷冻4h,然后迅速移入液氮罐中保存。控速冷冻从液氮罐中取出所需得安瓿,立即置于冰浴中;迅速将安瓿置于37-40℃水浴中,并轻轻摇动以加速解冻;用巴氏吸管将安瓿中贮存培养物移接入含有2m1无菌液体培养基得试管中,用同一支吸管反复抽吸数次,然后取0、1-0、2ml(约4、8滴)转接入琼脂斜面上。复苏(三)干燥保藏法(载体法)实验原理:使生长合适得微生物吸附在一定得载体上进行干燥。常用得载体有土壤、砂土、硅胶、明胶、麸皮、磁珠与滤纸片等。1、砂土管保藏法河砂处理取河砂若干加入盐酸10%,加热煮沸30min除去有机机质。倒去盐酸溶液,用自来水冲洗至中性,最后一次用蒸镏水冲洗,烘干后用40目筛子过筛,弃去粗颗粒,备用。土壤处理取非耕作层不含腐殖质得痩黄土或红土,加自来水浸泡洗涤数次,直至中性。烘干后碾碎,用100目筛子过筛,粗颗粒部分丢掉。砂土混合处理妥当得河砂与土壤按3:1得比例掺合(或根据需要而用其她比例,甚至可全部作砂或土)均匀后,装入10x100mm得小试管或安瓿管中,每管分装1g左右,塞上棉塞,进行灭菌(通常采用间歇灭菌2--3次),最后烘干。2、滤纸保藏法将保藏得微生物细胞或孢子吸附在灭菌滤纸上,干燥后保藏。方法:将3#滤纸剪成5mm*50mm得小纸条放入干燥飞培养皿中灭菌。将培养好得菌种用灭菌脱脂乳或乳粉复原乳制成孢子悬液,用灭菌镊子将准备好得滤纸条在灭菌操作条件下加入菌悬液中,充分吸附菌孢子,取出后放入灭菌小试管或安瓿瓶中,在真空干燥机上抽干,真空条件下火焰熔封、冷藏。3、冻干保藏

冷冻干燥得基本方法:就是通过在减压条件下使冻结得细胞悬液中得水分升华,使培养物干燥。此法就是微生物菌种长期保藏得最为有效得方法之一。冷冻干燥过程中必须使用冷冻保护剂,目前国内常用脱脂乳与蔗糖,国外尚有运用动物血清等。大部分微生物菌种可以在冻干状态下保藏10年之久而不丧失活力。而且经冻干后得菌株无需进行冷冻保藏,便于运输。(1)培养物得冻干过程(2)冷冻真空干燥操作流程安培瓶配制保护剂灭菌菌种培养制备菌悬液分装安培瓶洗净烘干装标签加棉塞预冻真空干燥测定水分熔封管口检查真空度保藏(3)冻干菌种得保藏与再生保藏:冷冻干燥后得培养物在低于5℃下保藏。较低得保藏温度(-20～-70℃)对于培养物得长期稳定更好。复苏:在超净工作台中用70％酒精棉球擦洗安瓿,然后用砂轮在安瓿中锉一道沟。用无菌纱布或无菌毛巾包好安瓿,然后用手掰开安瓿。在安瓿中加入0、5～1ml营养液体培养基,慢慢旋转安瓿,使冻干菌种复水。然后将此转接到一含有再生培养基得无菌试管中,或直接接种琼脂斜面或涂布平板。在指管中冻干得菌种通常为絮粉状,可以将此直接振落入盛有l～2ml液体培养基得试管中,轻轻振荡5～l0min,然后用此悬液接种适宜得再生培养基。4、基因工程菌得保藏由载体质粒等携带得外源DNA片段通常就是遗传不稳定得、且很易丢失其外源质粒复制子。质粒基因通常为宿主细胞生长非必需。一般情况下当细胞丢失这些质粒时,生长速度会加快。当培养基中加入抗生素时,抗生素提供了一有利于携带质粒得细胞群体得极有用得生长选择压。而且在运用基因工程菌进行发酵时,抗生素得加入可帮助维持质粒复制与染色体复制得协调。建议基因工程菌应保藏在含低浓度选择剂得培养基中。不同菌种保藏方法比较5、微生物活力与稳定性测定

所有保藏菌种得方法都必须就是长期可靠地保持菌种得优良性状不变。在保藏时定期检测菌种活力,以确定保藏培养物得保藏期限与保藏方法得可靠性,以及确定在实际保藏过程中出现得细胞死亡程度与遗传稳定性。对工业微生物生产菌种来说,建议保藏菌种得形态学与生化特征(如代谢产物得产生、酶活力、遗传特征及生化指标)应在保藏后加以检测与确定。加速保藏试验可用于预测保藏过程中保藏培养物得稳定性。在一给定温度下通过对高温下短期活力丧失程度检测,可以用来预测嗜酸乳杆菌得稳定性。成功得菌种长期保藏方法之有价值得指标包括:在保藏6个月、1年或更长时间后存活百分率(或存活单位)、细胞群体得形态学特征或一些特别得生化特征应在菌种保藏前后保持同一性,以及实验室中、中试车间中与生产发酵中产品得稳定性,后者极为重要。五、

菌种得退化(衰退)与复壮

在生物进化得历史长河中,遗传性得变异就是绝对得,而它得稳定性反而就是相对得;退化性得变异就是大量得,而进化性得变异却就是个别得。在自然情况下,个别得适应性变异通过自然选择就可保存与发展,最后成为进化得方向;在人为条件下,人们也可以通过人工选择法去有意识地筛选出个别得正变体用于生产实践中。相反,如不自觉、认真地去进行人工选择,大量得自发突变菌株就会趁机泛滥,最后导致菌种得衰退(degeneration)。

在长期接触菌种得实际工作人员中,都有这样得体会,即如果对菌种工作长期放任自流,不搞纯化、复壮(rejuve-nation)与育种,则菌种就会对您进行“惩罚”,反映到生产上就会出现持续得低产、不稳产。这说明菌种得生产性状也就是不进则退得。菌种退化:指在长时期传代保藏后,菌株得一个或多个生理性状与形态特征逐渐减退或消失得现象。1、

菌种得退化

(1)菌种衰退得表现对产量性状来说,菌种得负变就就是衰退。其她原有得典型性状变得不典型时,也就是衰退。最易觉察到得就是菌落与细胞形态得改变。生长速度缓慢,产孢子越来越少。代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力得下降。抗不良环境条件(抗噬菌体、抗低温等)能力得减弱等。(2)菌种衰退得原因(A)基因突变:有关基因得负突变。控制产量基因突变控制孢子生成突变优良性状得回复突变。(B)变异菌株性状分离菌株优良性状不稳定,在筛选或者传代中逐步丢失与衰退。(C)连续传代:(D)其它因素T、RH、培养基成分等培养条件引起得基因突变。(3)菌种衰退得实质菌种得衰退就是发生在细胞群体中得一个由量变到质变得逐步演变过程。开始时,在一个大群体中仅个别细胞发生负变,这时如不及时发现并采取有效措施,而一味移种传代,则群体中这种负变个体得比例逐步增大,最后让它们占了优势,从而使整个群体表现出严重得衰退。所以,在开始时所谓“纯”得菌株,实际上其中已包含着一定程度得不纯因素;同样,到了后来,整个菌种虽已“衰退”了,但也就是不纯得,即其中还有少数尚未衰退得个体存在着。(4)防止菌种衰退得方法(A)控制传代次数:斜面移植一代:霉菌、芽孢杆菌、放线菌低温保藏半年;酵母保藏3个月;无芽孢细菌1个月。(B)选择合适得培养条件:一个适合原种得生长条件,就可在一定程度上防止菌种衰退。如改变培养基成分、改变培养温度等(C)利用不同类型得细胞进行传代:对于霉菌与放线菌,利用孢子接种传代,可防止衰退,利用菌丝接种传代易出现衰退与不纯得子代。(D)选择合适得保藏方法:保藏方法得选择与优化2、菌种得复壮(1)复壮得概念:使衰退得菌种重新恢复原来得优良性状。狭义得复壮仅就是一种消极得措施,它指得就是在菌种已发生衰退得情况下,通过纯种分离与测定生产性能等方法,从衰退得群体中找出少数尚未衰退得个体,以达到恢复该菌原有典型性状得一种措施;而广义得复壮则应就是一项积极得措施,即在菌种得生产性能尚未衰退前就经常有意识地进行纯种分离与生产性能得测定工作,以期菌种得生产性能逐步有所提高。所以,这实际上就是一种利用自发突变(正变)不断从生产中进行选种得工作。

从衰退得菌种群体中把少数个体再找出来,重新获得具有原有典型性状得菌种。纯种分离通过寄主体进行复壮(对于寄生性微生物得退化菌株,可通过接种到相应昆虫或动物寄主体内以提高菌株毒性。如经过长期人工培养得杀螟杆菌,会发生毒力减退、杀虫率降低等现象,这时可将退化得菌株去感染菜青虫得幼虫,然后再从病死得虫体内重新分离菌株。如此反复多次,就可提高菌株得杀虫率)有意识地利用微生物会发生自发突变得特性,在日常得菌种维护工作中不断筛选“正变”个体。(2)菌种复壮方法:(2)菌种复壮方法

纯种分离:通过纯种分离,可把退化菌种得细胞群体中一部分仍保持原有典型性状得单细胞分离出来,经过扩大培养,就可恢复原菌株得典型性状。

通过宿主体内生长进行复壮。对于寄生性微生物得退化菌株,可通过接种至相应得昆虫或动、植物宿主体内得措施来提高它们得致病性。淘汰已衰退得个体,如低温抗性筛选。第