基因工程复习资料

第一章绪论1.基因工程的定义：在体外对不同生物的遗传物质(基因)进行剪切、重组、连接，然后插入到载体分子中(细菌质粒、病毒或噬菌体DNA),转入微生物、植物或动物细胞内进行无(1)目的基因的获取：从复杂的生物基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出(2)重组体的制备：将目的基因的DNA片断插入到能自我复制并带有选择性标记(抗菌素抗性)的载体分子上。(3)重组体的转化：将重组体(载体)转入适当的受体细胞中。(4)克隆鉴定：挑选转化成功的细胞克隆(含有目的基因)。(5)目的基因表达：使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物。(1)基因工程在农业生产中的应用：提高植物的光合作用率；提高豆科植物的固氮效率；(2)基因工程在工业中的应用：1)纤维素的开发利用：克隆各种参与纤维素降解的酶的基因，导入酿酒酵母，就可能利用2)酿酒工业：用外源基因改造酿酒酵母，产生优质的啤酒。或用酿酒酵母生产蛋白质等。(4)基因工程在环境保护中的作用：1)检测水污染：用重组细菌或转基因鱼等检测水污染(5)基因工程商业化的发展第二章基因工程主要技术原理1.质粒和基因组DNA的提取方法与纯化步骤，主要试剂2)破膜：溶液IⅡ(0.2NNaOH1.0%SDS)3)中和：溶液Ⅲ(3M醋酸钠pH4.8)4)离心5)转移：将上清转移到一个新的离心管中7)沉淀：用0.6倍体积的异戊醇或2倍体积的乙醇(可以加入1/10体积的3M醋酸铵辅助沉淀)细胞裂解(10%SDS和蛋白酶K。SDS是阴离子型去垢剂(detergent),可以使细胞膜崩解。)—>沉淀DNA(0.6倍体积的异丙醇或2倍乙醇(可以加入1/10体积的3M醋酸氨辅助沉淀))松散后直接使用。)—>细胞裂解(0.5%SDS和0.1mg/ml蛋白酶K。50℃温育。)—>(用2倍体积的无水乙醇或0.6倍体积的异丙醇。(加入1/10体积的3M醋酸氨可以辅助沉组织粉碎(用液氮冷冻后研磨成细粉末。)—>细胞裂解(用2%CTAB/2-ME(十六烷基三甲基溴化铵2巯基乙醇)或1%SDS和蛋白酶K。65℃温育。)—>沉淀DNA(用0.6倍体积的异丙醇(-20℃)。(可以加入1/10体积的3M醋酸氨辅助沉淀))处有特异的紫外吸收峰,对于纯DNA:OD260/OD280=1.8,若低于1.8说明有蛋白质杂质(2)琼脂糖凝胶电泳估计溴化乙锭(EB)能插入DNA分子中。与已核酸分子中的磷酸基团是离子化的，所以，DNA和RNA实际上呈多聚阴离子状态聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体(Acrylamide)和交联剂N²,N²甲叉双丙烯酰胺(N²,N²-菌落/噬菌斑原位杂交：直接将菌落(噬菌斑)原位转移到固组织/细胞原位杂交：用标记的已知核酸序列为探针，使其与细PCR技术的基本原理：类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的④靶基因的特异性与保守性。·引物内部不能有大于3bp的反向·ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤对策：重新准备模板；更换酶并避免反复冻原因：引物设计不合适；靶序列或扩增产物的交叉污染火温度过低，及PCR循环次数过多有关；酶的质和量，酶量过多有时也会出现非特异性扩增对策：重新设计引物，降低引物量；适当提高退火温度，减少循环次数；减低酶量或调换减少循环次数。RT-PCR:RT-PCR是将RNA的反转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术。中全部表达的mRNA,通过PCR扩增的方法，转换成cDNA双链，再利用变性聚丙烯酰胺凝8.RACE原理及应用9.Sanger双脱氧链终止链。该酶能够用2‘,3’-双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)作底物并将其聚合到新生寡核苷酸链DNA有少至1个碱基的差异时，其Tm值的改变影响到杂交时的荧光信号值，从而可11.酵母双杂交系统原理、应用单独的AD也不能激活UAS的下游基因，它们之间只有通过某种方式结合在一应用：1)已知蛋白之间相互作用的检测：2)蛋白质的功能域研究：通过对其中某一个蛋白质作缺失或定点突变，再用此系统第三章基因工程的酶学基础限制性核酸内切酶cDNA合成多聚核苷酸激酶5′磷酸化、探针标记2.核酸内切限制酶种类使用时的注意事项I型限制性内切酶切割位点：在距离特异性识别位点约1000-1500bp处随即切开一条单链。Ⅱ型限制性内切酶识别位点序列：未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序列(多数是回文序列),与DNA来源切割位点：就是识别位点处。切开双链DNA,形成粘性末端(stickyend)或平(齐)末端 (bluntend)。粘性末端分为5’端凸出(如EcoRI切点)和3’端凸出(如PstI切点)。并且识别顺序往往超过6个碱基对。)Ⅲ型限制性内切酶噬菌体所感染，而其自身的DNA由于被一种特殊的酶所修饰(甲基化)而得以保护，这种a.取少量酶(方法or稀释)b.最后加酶、尽快操作c.减少反应体积d.反应时间的延长e.分装(对于多个反应)大多数为37℃;一部分为50-65℃少数25-30℃;高温作用酶于37℃时活性多数10-50%EDTA终10mM;加热(37℃酶65℃20min,otherwise80℃20min)6.星活性、引起星活性的因素改变的特殊性称星活性。(非特异性切割)①高浓度甘油(>5%)②酶过量(>100U/μg)③低离子强度(<25mM)PMSO(二甲基亚砜)、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺(dimethylacetamide)、二甲基甲酰胺⑥用其它二价阳离子代替Mg2+①大肠杆菌连接酶：粘性末端，平末端(效率低)③需要能量：动物或噬菌体中是ATP,大肠杆菌中是NAD+。3~10倍，增加插入片段与载体的接触机会，减少载体自我连接的现象。平末端DNA分子的连接反应中，最适1～2个单位。粘性末端DNA片断之间的连接，酶浓度0.1个单位。8.粘性末端DNA片段的连接、平末端DNA片段的连接方法；粘性末端DNA片段的连接：待连接的两个DNA片段的末端如果是用同一种平末端DNA片段的连接：待连接的两个DNA片段的末端如果是用同一种限制性核酸内切酶具平末端的DNA片段之间连接反应的操作过程基本上同具粘性末端DNA片段之间连接的操作过程，但是一般只用T4DNA连接酶，且需要加大酶用量。·加大连接酶用量(10倍大于粘性末端的连接)加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会加入10%PEG8000,促进大分子之间的有效作用大肠杆菌DNA聚合酶I:性质①条单链多肽(109kDa)性质：⑩NA聚合酶1的酶解片段性质①来源：T4噬菌体感染的大肠杆菌细胞114kD(降解单链更快)用途账模板的引物延伸高了3倍。用途：合成cDNA:以oligodT为引物(在74°C复制DNA,在95°C的半衰期为40分钟。TaqDNA聚合酶在镁离子存在的条件下①需要3'-OH用于：在3'末端添加同聚物，形成粘性末端，用于DNA连接·如果ATP的γ磷酸带有2p标记，就会被转移到DNA的5'端。(1)细菌性碱性磷酸酶Bacterialalkalinephosphatase,(2)小牛肠碱性磷酸酶Calfintestinalalkaline包括单链DNA外切酶,双链核酸外切酶(1)核酸外切酶Ⅲ:在DNA双链的末端产生出单链区域(1)定位RNA(2)用mRNA测定基因中的(3)降解限制酶切形成的单链突出端(4)切掉双链核酸中的单链区C.绿豆核酸酶切口平移标记，在dsDNA上随机产生切口；在闭环DNA上引入单切口以使分子截短(在亚硫酸氧盐介导的诱变前);建立随机克隆，以便安插在M13phage上测序分析；蛋白：DNA复合物(DNA酶足迹法);除去RNA样品中的DNA(RNase-free)于体外转录(合成)与外源DNA同源的RNA,·从而用作杂交探针，体外翻译系统中的mR第四章基因克隆的载体2.理想载体至少必备的条件①能在宿主细胞中自主复制②容易进入宿主细胞③容易插入外来核酸片段④容易从宿主细胞中分离纯化，便于重组操作⑤具有合适的筛选标记⑥具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性(可转移性)(1)自主复制性：携带有自己的复制起始区(ori)它能独立于宿主细胞的染色体DNA而(2)生物不相容性(Incompatibility):有时不同的质粒可同时共存在于一个细菌内，但同群质粒(不同的，但亲缘性高)不能共存于同一细胞，这种现象称为质粒的不相容性。(3)可转移性部分质粒含有tra基因，指令宿主细胞产生菌毛，合成细胞表面物质，促(4)稳定性质粒在宿主细胞中保持着一定的拷贝数。(5)寄生性质粒只能在宿主的细胞内复制(6)表现型不同的质粒有不同的表型，如对抗生素的抗性等(7)可扩增性(8)携带特殊的遗传标记野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使6.质粒类型(1)按转移性分接合型质粒能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞(接合作用),如F、(2)按复制机理分：严紧控制型质粒，松弛控制型质粒。严紧型质粒的复制受到宿主细胞蛋白质合成的严格控制，复制随细菌染色体的复制同步进(3)按功能分：F质粒、R质粒、Col(colicin)质粒(可产生大肠杆菌素)、Ent质粒(可产生肠毒素)。(1)加入合适的选择标记基因，通常是抗生素基因。(2)增加或减少合适的酶切位点，便于重组。(3)缩短长度，切去不必要的片段，增加装载量。(4)改变复制子，由严紧变为松弛型，以增加拷贝数。内含一个(Ori)、一个抗氨苄青霉素(A蓝白斑筛选的原理：受体菌lacz突变：缺失α肽。载体lacz'的α互补：质粒载体上的lacz'编码α肽，与这个缺失突变的β-半乳糖苷酶“互补”,使它能形成4聚体，又能分解Xgal,8.单链DNA噬菌体的特点9.M13系列载体的优点(1)有MCS,便于克隆不同的酶切片段(4)克隆能力大(5)可以克隆双链DNA分子中的每一条链。子代M13噬菌体中包含的是单连+DNA。(1)MCS的中部已经被切开，各有一个3'端突出的T。(3)克隆的PCR产物能被两侧的EcoRI切下来回收。(4)含有G418抗性，可在真核生物中表达。(1)λ噬菌体是大肠杆菌的温和型噬菌体(3)λ-DNA为线状双链DNA分子，全长48502个核苷酸，两端各有一个12核苷酸的互补(4)λ-DNA上至少有61个基因，左边是外壳蛋白的基因，右边是负责裂解宿主细胞、DNA(1)插入型载体：插入位点位于载体合成活性阻遏物区域(cl基因)内。插入型载体长·用于体外包装的蛋白质可直接从感染了λ噬污染后，均不能被包装成有感染力的噬菌体颗粒，这也是基于安12.粘粒即cos质粒的生物学性质45kb(最少不能低于30kb)。酵母系统的选择标记；大肠杆菌的复制子；大肠杆菌的选择标记；YAC载体的装载量为细菌人造染色体通常是在大肠杆菌性因子F质粒的基础上构建的，包括大肠杆菌的复制子，14.动物病毒载体(反转录病毒、腺病毒)特点(1)属于正链RNA病毒，显著的特点是具有2倍体基因组。(2)病毒RNA经反转录产生双链DNA分子，可整合到染色体DNA上成为原病毒，随染色(1)可将DNA插入宿主基因组的随机位点上。(2)侵染范围广、感染率高，几乎大100%。(4)包装的外源DNA可达10Kb。·共同特点是都带有倒置的末端重复序列(ITR),在病毒的复制过程中起非常重要的作用(1)比较安全，无致病、致癌、致畸作用。(2)宿主范围广，不仅能感染有分裂能力的细胞，也能感染不能分裂的细胞(如神经细胞(3)可以在呼吸道和肠道中繁殖，可以通过口服或喷雾的方式感染。(4)载体中的插入片断可达7.5kb(有包装容量限制)。(5)腺病毒容易制备、纯化。(6)基因组结构和功能了解得清楚。基因打靶载体中含有抗G418的基因，胸腺激酶基因(tk1&tk2),TK能把9-鸟嘌呤转化成有毒的化合物，从而杀死宿主细胞。在载体整第五章目的基因的克隆与基因文库的构建将目的基因的一条链分成若干40-50碱基的片断，另一条设计成与之交错互补的根据目的基因的全序列，分别合成40-50碱基长的单链DNA片段，拼接模块数大幅度减少，(1)目的基因的直接克隆(2)通过RT-PCR进行cDNA的克隆适合扩增真核生物基因(原核生物不易得到mRNA,也不含有polyA尾)。(3)制备DNA探针，进行分子检测等。mRNA差异显示PCR:(2)5'端的随即引物：10个核苷酸，扩增第二链。(3)随机引物与锚定引物成对扩增实验结果：在测序胶上，每组扩出50-100条长度为100-500bp的带。240组则能分出20000多条带!(4)随机-锚定引物PCR的产物电泳比较①物理切割法：超声波(300bp)或机械搅拌(8kb)。(2)载体与基因组DNA大片段的连接(3)将重组子导入到相应的宿主细胞保存和扩增。cDNA文库：利用某种生物的总mRNA合成cDNA,再将这些cDNA与载体原理：利用mRNA都含有一段polyA尾巴，将mRNA从总RNA(rRNA、tRNA等)中分D.去掉发卡结构：用核酸酶S1可以切掉发卡结构。(5)导入细菌细胞中进行保存和扩增。第六章基因的重组与转移(2)齐平末端的连接①同聚加尾法形成“粘性末端”②与T载体直接连接：用TaqDNA聚合酶(1)转化(transformation):以质粒为载体，将携带外源(3)转导(transduction):以噬菌体作为媒介讲一个细胞(供体)的遗传物质传递给另一个细胞(受体)的过程。根癌农杆菌中存在Ti质粒，将外源基因插入Ti质粒后构建的重组Ti质粒转化土壤农杆菌，有10%的细胞能吸收DNA沉淀。脂质体有商业试剂盒(如LifeTechnologies)直接把外源DNA注射到宿主细胞核里，使其整合第七章重组子的筛选和鉴定(4)放射性抗体测定法、免疫沉淀测定法等免2.抗药性标记插入失火选择法、β-半乳糖苷酶显色反应选择法以及根据插入序列的表型特(1)四环素抗性插入失活(环丝氨酸杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌)(2)氨苄青霉素抗性插入失活液选择。(挑选蓝色克隆)β-半乳糖苷酶使Xgal分解成蓝色产物。插入外源根据插入序列的表型特征选择：利用插入的外源基因的表达产物特性进原理：(1)弥补缺陷(2)增加新性状3.凝胶电泳检测法和R-环检测法等物理检测法5.放射性抗体测定法、免疫沉淀测定法等免疫化学法菌落形成沉淀圈。对于不能分泌到菌体外的蛋白质可先进行原位溶菌处理(溶菌酶、原噬菌第八章外源基因表达系统用于基因扩增或高效表达的受体细胞(recA-)启动子序列：大肠杆菌的所有启动子中都有基因工程常用的原核启动子(最佳启动子必须具备的条件):●必须是一种强启动子能使外源基因的蛋白产量达到细胞总蛋白的10%-30%以上。S-D序列：核糖体结合位点(RBS),mRNA上与核糖体16sRNA结合是序列。影响外源基因衰减子:衰减发生处的一种内部终止子序列。衰减子是位于细菌操纵子上游的一段核苷酸序列。原核生物中通过翻译前导肽而实现控制DNA的转录的调控方式称衰减作4.包涵体表达、分泌型表达、融合型表达等原核表达各自优包涵体的水难溶性及其密度远大于其它细胞碎片和细胞成分，菌重组异源蛋白在大肠杆菌细胞内的稳定性主要取决于包涵体形才能回收得到具有正确空间构象(因而具有生物活性)的目标蛋白，因此包涵体变复性操作(2)然而，这也是一个技术难题，尤其当目标蛋白分子中的Cys残基数目较高时，体外复10倍。·目的蛋白易于分离利用受体蛋白成熟的抗体、配·目的蛋白溶解性好由于受体蛋白·目的蛋白需要回收融合蛋白(1)优化表达载体的设计：在构建表达载体时对决定转录起始的启动子序列和决定mRNA(2)提高稀有密码子tRAN的表达作用。多数密码子具有简并性，而不同基因使用同义密(3)提高外源基因mRNA的稳定性。尽可能减少核酸外切酶可能对mRNA的降解或改变外源基因mRNA的结构，使之不易被降解。(4)提高外源基因表达产物的稳定性。降低水解酶对外源基因表达产物的降解。(5)优化发酵过程。在工艺方面和生物学方面进行优化。Yep:以2μ质粒上的复制元件为复制子的质粒称为Yep·YCp质粒具有较高的有丝分裂稳定性，但拷贝数只有1-5个含有酵母菌染色体DNA同源序列的YIp质粒的构建为Yip。革兰氏阴性土壤杆菌农杆根瘤菌(A.tumefaciens)感染所致，其致瘤特性是由该菌细胞内整个质粒160-240kbtmr的编码产物负责：合成植物分裂素外源基因能高效表达病毒基因组和重组分子常发生重排和缺失现象9.营养缺陷型的哺乳动物受体细胞筛选原理含有胸腺嘧啶核苷激酶(TK)编码基因缺陷的受体细胞(tk-)不能在含有次氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培养基上(HAT培养基)生长，载体上的标记基因tk能与之遗中国仓鼠卵巢细胞(CHO),其优势有·COS细胞的特点：长素与分裂素之比高，则根部发育；生长素这项技术有一定的局限性，即大多数单子叶农作物(如谷类作物)很难从原生质再生出完整基因治疗(1)基因置换：指将特定的目的基因导入特定细胞，通过定位重组，以导入的正常基因置(2)基因添加：通过导入外源基因使靶细胞表达其本身不表达的基因。(3)基因干预：采用特定的方式抑制某个基因的表达，或者通过破坏某个基因的结构而使(4)自杀基因治疗：将“自杀”基因导入宿主细胞中，这种基因编码的酶能使无毒性的药(5)基因免疫治疗：通过将抗癌免疫增强细胞因子或MHC基因导入肿瘤组织，以增强肿瘤(6)耐药基因治疗：耐药基因治疗是在肿瘤治疗时，为提高机体耐受化疗药物的能力，把3.基因治疗的途径①exvivo途径：这是指将含外源基因的载体在体外导入人体自身或异体细胞(或异种细胞),经体外细胞扩增后，输回人体。exvivo基因转移途径比较经典、安全，而且效果较易控制，但是步骤多、技术复杂、难度大，不容易推广；②invivo途径：这是将外源基因装配于特定的真核细胞表达载体，直接导入体内。这种载体可以是病毒型或非病毒性，甚至是裸DNA。invivo基因转移