化学品 用虹鳟肝S9亚细胞组分测定体外固有清除率试验

5GB/TXXXXX—XXXX化学品用虹鳟肝S9亚细胞组分测定体外固有清除率试验本文件规定了化学品用虹鳟肝S9亚细胞组分测定体外固有清除率试验的试验原理、受试物信息、参比物、试验准备、试验程序、数据处理、质量保证与质量控制和结果报告。本文件适用于化学品体外固有清除率的测定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T21801化学品快速生物降解性呼吸计量法试验GB/T21802化学品快速生物降解性改进的MITI试验（I）GB/T21803化学品快速生物降解性DOC消减试验GB/T21831化学品快速生物降解性密闭瓶法试验GB/T21845化学品水溶解度试验GB/T21852化学品分配系数（正辛醇-水）高效液相色谱法试验GB/T21853化学品分配系数（正辛醇-水）摇瓶法试验GB/T21855化学品与pH有关的水解作用试验GB/T21856化学品快速生物降解性二氧化碳产生试验GB/T21857化学品快速生物降解性改进的OECD筛选试验GB/T22052用液体蒸气压力计测定液体的蒸气压力温度关系和初始分解温度的方法GB/T22228工业用化学品固体及液体的蒸气压在10-1Pa至105Pa范围内的测定静态法GB/T22229工业用化学品固体及液体的蒸气压在10-3Pa至1Pa范围内的测定蒸气压平衡法GB/T27850化学品快速生物降解性通则GB/T27861化学品鱼类急性毒性试验GB/T29763化学品稀有鮈鲫急性毒性试验OECD化学品测试导则No.104蒸气压（Vapourpressure）OECD化学品测试导则No.112水中解离常数（DissociationConstantsinWater）OECD化学品测试导则No.310快速生物降解—密闭瓶二氧化碳法（ReadyBiodegradability-CO2inSealedVessels）OECD化学品测试导则No.316化学品在水中的光转化—直接光解试验（PhototransformationofChemicalsinWater–DirectPhotolysis）3术语、定义、符号和缩略语3.1术语和定义6GB/TXXXXX—XXXX下列术语和定义适用于本文件。3.1.1生物富集系数bioconcentrationfactor；BCF试验吸收阶段的任何时间,试验生物体(或特定组织)内某种受试物浓度与试验介质中该物质浓度的3.1.2一级清除动力学first-orderdepletionkinetics底物分子清除的速率与其浓度成正比的化学反应。3.1.3性腺指数gonadosomaticindex；GSI将性腺重量除以生物体重计算得到受试生物的性腺指数。注：GSI=（100×性腺质量）/生物体重。虹鳟鱼的性成熟度可以通过GSI来判断，GSI＜03.1.4S9亚细胞组分S9sub-cellularfraction来源于器官（通常是肝脏）表面的一部分组织，含有细胞溶质和微粒体。注：在合适的介质中匀浆，通常在9000g条件下离心20min，如果从鱼中提取，离心速度为13000g。3.2符号和缩略语下列符号和缩略语适用于本文件。CLINVITRO,INT：体外固有清除率（invitrointrinsicclearance）CYP：细胞色素P450（cytochromeP450）DTT：DL-二硫苏糖醇（DL-Dithiothreitol，CAS：3483-12-3）EDTA：乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraaceticacid，CAS：60-00-4）EROD：乙氧基异吩噁唑-O-脱乙基酶（ethoxyresorufin-O-deethylase）GC：气相色谱（gaschromatography）GST：谷胱甘肽转移酶（glutathionetransferase）HBSS：Hanks平衡盐溶液（Hanks'BalancedSaltSolution）HEPES：2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]-乙磺酸（4-（2-hydroxyethyl）-1-piperazineethanesulfonicacid，CAS：7365-45-9）HPLC：高效液相色谱（highperformanceliquidchromatography）IVIVEmodel：体外-体内外推模型（Invitrotoinvivoextrapolationmodel）ke：清除速率常数Kow：正辛醇-水分配系数KM：米氏常数LOQ：定量限（limitofquantification）MS-222：3-氨基苯甲酸乙酯甲基磺酸盐（tricainemethanesulfonate，CAS：886-86-2）。7GB/TXXXXX—XXXXNADPH：β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸2′-磷酸，还原型四钠盐（nicotinamideadeninedinucleotide2'-phosphate，CAS：2646-71-1）PAPS：腺苷3′-磷酸盐5′-磷酸硫酸盐（adenosine3'-phosphate5'-phosphosulfate，CAS:109434-21-1）pKa：酸解离常数RT-S9：虹鳟鱼肝S9亚细胞组分（rainbowtroutliverS9subcellularfraction）SULT：磺基转移酶（sulfotransferase）UDPGA：尿苷5′-二磷酸葡萄糖醛酸三钠盐（uridine5'-diphosphoglucuronicacid，CAS:63700-19-6）UGT：尿苷5′-二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶（uridine5'-diphospho-glucuronosyltransferase）UVCBs：未知或可变成分、复杂反应产物或生物材料（unknownorvariablecomposition,complexreactionproductsorofbiologicalmaterials）Vmax：受试物浓度达到饱和条件下的最大酶促速率4试验原理4.1制备和使用虹鳟鱼肝S9亚细胞组分较为容易,在冷冻状态(-80℃)下，组分样本可以运送到不同地点，存储至少两年。同一批次的RT-S9可用于在不同时间开展多个试验。RT-S9所含的酶负责催化I期（如CYP）和Ⅱ期（如SULT、UGT、GST）的生物转化。4.2用底物清除法测定受试物的CLINVITRO,INT，孵育体系由RT-S9、磷酸钾缓冲液、酶辅因子和丙甲甘肽组成，作用于I期和Ⅱ期的生物转化，通过添加受试物启动反应。为了在不同的时间点收集样品，将等份的悬浮液转移至终止溶液中从而终止反应。使用经过验证的分析方法测定体系中受试物浓度随着时间下降的变化趋势，计算获得CLINVITRO,INT。使用酶促失活的RT-S9为阴性对照，以区分酶促生物转化和非生物下降。5受试物信息在试验前，应掌握受试物的下列信息：a)水溶性；b)在有机溶剂中的溶解度（如需制备受试物贮备液）；c)正辛醇-水分配系数或关于分配行为的其他信息；d)在试验用水/介质中的稳定性；e)蒸气压；f)关于生物或非生物的降解性信息，如快速生物降解性；g)酸解离常数，用于可能电离的受试物；h)应提供已知准确度、精密度和灵敏度的分析方法，用于定量分析混合培养体系中的受试物浓度，并提供详细的样品制备和储存方法。应明确培养体系中受试物的定量限。6参比物采用适当的参比物作为阳性对照建立相关试验系统并检验其有效性，宜采用芘作为参比物。7试验准备8GB/TXXXXX—XXXX7.1仪器设备a)4℃冰箱；b)-20℃冰箱；c)-80℃冰箱；d)使用分析天平称量试剂、辅因子和受试物；e)pH计；f)旋涡混合器；g)在孵育/终止反应阶段，用于微量离心管或其他试验管的冷冻离心机；h)培养设备，如振荡低温水浴振荡器、具有加热和制冷功能的振荡培养箱、具有震荡功能的热混合器；i)用于配制溶液、试剂的玻璃器皿；j)用于培养的玻璃瓶（如7mL闪烁管）；k)1.5mL微量离心管；l)用于HPLC/GC或其他分析仪器的玻璃样品瓶；m)移液器或滴管。7.2辅因子和化学试剂7.2.1以下应为分析纯或同等级别：a)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸2'-磷酸四钠盐；b)尿苷5′-二磷酸葡萄糖醛酸三钠盐；c)L-还原型谷胱甘肽；d)腺苷3＇-磷酸5′-磷酸硫酸锂盐化合物；e)丙甲甘肽；f)磷酸氢二钾（K2HPO4g)磷酸二氢钾（KH2PO4）。7.2.2分析受试物所用试剂应满足以下要求：a)能溶解受试物的溶剂应为分析纯或同等级别（如甲醇、乙腈和丙酮所用溶剂应与磷酸钾反应体系中使用的水溶介质相混溶；b)终止和萃取溶剂应为分析纯或同等级别（如甲醇、乙腈、二氯甲烷、甲基叔丁基醚）。7.3RT-S97.3.1RT-S9可来自商售，或按照附录A中的示例进行制备。7.3.2应测定每批次RT-S9的蛋白浓度（见附录B），同时应评估每批次RT-S9酶催化Ⅰ期和Ⅱ期的生物转化能力，酶活力的测定方法见附录B。在试验开始时或RT-S9首次使用前，应利用上述特征分析或者已知参比物来检验新批次RT-S9的有效活性。保存期间，应随时监测RT-S9的活性。7.3.3试验应包含酶促失活（如加热失活）的阴性对照组，通过阴性对照区分酶活性转化和非生物性下降（缘于孵育瓶吸附、挥发以及非生物降解）。酶加热失活的操作方法见附录C。8试验程序8.1试验条件8.1.1首先开展预试验，确定底物浓度、蛋白质浓度和孵育时间等参数，建立的孵育条件应满足准确9GB/TXXXXX—XXXX测定肝固有体外清除率和建立一级清除动力学的要求（见附录D）。8.1.2足量的取样点有助于构建高质量的浓度对数转换回归方程，至少设置6个采样点。8.1.3包括7个时间点的单瓶法测试示例见图E.1，该方法宜用于浓度易分析的受试物（如无挥发性、不吸附在容器壁上、在培养系统中可迅速分布其结果变异性较小，且操作简单。对于挥发性、疏水性强的受试物，宜采用多瓶法（见图E.2）。8.1.4每个试验应至少包括两次完整的试验操作以确定CLINVITRO,INT，如果每次操作能满足以下条件，则两次操作可在不同日期也可在同一天进行：a)单独配制新的贮备液和试验溶液；b)使用单独解冻的RT-S9，RT-S9可源于同一批次。如果2次操作中活性RT-S9的回归分析具有显著性差异（如对斜率开展t-检验，p＜0.05应进行第3次操作，以获得2次有效结果。8.1.5在每次操作中，一瓶活性RT-S9和一瓶酶促失活的RT-S9需添加受试物，另一瓶活性RT-S9添加参比物。在不同的时间点采样（如2min、10min、20min、30min、60min、90min、120min）。有时需要增加试验瓶数量（如每瓶3个平行）以保证精确分析受试物浓度。对于酶促失活的对照组，可根据预试验结果减少采样次数（见附录E）。8.2受试物、缓冲液、辅因子和终止溶液的配制8.2.1试验溶液用磷酸钾缓冲液（见附录F）或提前测试过的溶剂配制受试物贮备液。常见溶剂如丙酮、乙腈和甲醇。若贮备液不是新鲜配制，应在试验前评估受试物贮备液的稳定性。在试验当天，根据预试验结果，用磷酸钾缓冲液（见附录F）或有机溶剂稀释受试物贮备液制备所需浓度的试验溶液。如使用有机溶剂，其在混合孵育体系中的含量应尽可能低，不应超过1%，以免抑制酶活性。丙甲甘肽溶液中已含有一定量有机溶剂，可在一定程度上影响反应体系中有机溶剂的终浓度（如0.25%）。通常受试物试验浓度应比分析方法的LOQ高约10倍，能产生预试验中确定的一级动力学即可。缓冲溶液、辅因子和丙甲甘肽的配制见附录F。贮备液可提前配制，如试验开始前1天，但稀释溶液应在试验当天配制。8.2.2终止溶液终止溶液包括甲醇、乙腈、二氯甲烷、甲基叔丁醚等有机溶剂，可能还包含内标。通常可预先添加终止溶液到1.5mL微量离心管中并保存于冰上，如添加400μL终止溶液，再加入100μL样品终止反应。对于挥发性溶剂（如二氯甲烷，甲基叔丁醚应将管盖盖紧并冷藏，或在取样时间点之前直接添加溶剂。对于与塑料相互作用的溶剂，应采用玻璃管。8.3RT-S9稀释液和混合孵育体系8.3.1解冻一定体积的活性RT-S9和酶促失活的RT-S9，用磷酸钾缓冲液（见附录F）稀释。如果混合孵育体系中蛋白终浓度为1mg/mL，则可稀释至10×蛋白浓度（如10mg/mL），计算方法见附录F。活性RT-S9应在冰水浴中解冻。宜额外增加25%~30%体积的活性/酶促失活的RT-S9，以提供适度过量的生物材料。例如，如果活性和非活性RT-S9各需300μLRT-S9稀释液，可分别制备400μL。8.3.2如图E.1中所示的单瓶法，使用2个装有活性RT-S9的小瓶和1个装有酶促失活RT-S9的小瓶，同时考虑设置的取样时间点数。过量的活性RT-S9不应重新冷冻后用次使用，但可用于制备非活性RT-S9，过量的非活性RT-S9可以重新冷冻备用。8.3.3添加400μL磷酸钾缓冲液（pH7.8，见附录F）到3个孵育瓶中，再将活性或酶促失活的RT-S9稀释液各100μL加入相应瓶中，加入100μL丙甲甘肽工作溶液（250μg/mL）到每个孵育瓶中，并GB/TXXXXX—XXXX将孵育瓶置于冰上预孵育15min。8.3.4如附件F所述制备辅因子混合液，主要包含NADPH、UDPGA、GSH和PAPS，将其充分混合并置于冰上，尽可能缩短放置时间。将400μL辅因子混合液加入到每个预培养瓶中（置于冰上）。将每个小瓶轻轻旋转直至充分混合，混合液成分见图F.1。注：因PAPS易迅速降解，应在预孵育期间配制辅因子混合液，并且紧随着8.3.5将孵育瓶置于振荡水浴或培养箱中，在11℃±1℃下轻摇，预孵育10min。8.4启动反应和终止反应8.4.1将受试物溶液（通常为5μL，取决于受试物贮备液的浓度）直接加入每瓶孵育混合体系（通常为1mL）中以启动反应。将孵育瓶旋转以使受试物均匀分散并松散地盖上盖子。8.4.2在指定时间点取样，将孵育瓶从水浴或培养箱中取出，轻轻旋转或摇动，用移液器取出等分试样（如100μL）并直接转移至相应的含有预冷终止液的1.5mL微型离心管中（置于冰上）。宜将移液器在终止液中上下吸取三次，以确保样品的全部转移。8.4.3将微量离心管置于冰上，直至收集到所有时间点的样品。若使用与水混溶的溶剂作为终止溶液，离心前将样品冷藏过夜将有助于促进蛋白质的完全沉淀。如果使用挥发性溶剂如二氯甲烷和甲基叔丁醚，样品应经过提取，宜在停止反应后立即提取。应通过开展预试验来确定终止反应后蛋白质是否完全沉淀。8.4.4取样完成后（针对挥发性溶剂，应在每个采样点后对微量离心管进行混匀（如1500r/min~2000r/min，涡旋3min），离心（如20000g，4℃条件下离心5min）。如果预试验表明受试物回收率较差，可延长涡旋时间（如10min）。某些受试物需冷藏过夜，以确保最大限度地提取。将上层清液转移至HPLC/GC样品瓶中，在-20℃±1℃条件下保存至分析。8.5浓度分析使用经验证的分析方法测定样品中受试物的浓度。由于试验质量主要取决于化学分析的准确性、精密度和灵敏度，因此应提前验证受试物分析方法的准确性、精密度和重现性，及其在混合孵育体系中的回收率（80%~120%）。9数据处理以经log10转换的底物浓度对时间作图，应呈现对数线性下降（R2＞0.85）。如果曲线图上显示明显的离群值，可使用统计上有效的离群检验去除虚假数据点，并记录去除理由。有时可在试验开始或结束时观察到非线性现象，可能与受试物降解或酶活性丧失/抑制有关。清除速率应在曲线的线性范围内确定，至少包括6个数据点。如果在失活RT-S9的阴性对照中观察到受试物发生非生物损失，即使优化试验条件该损失仍无法避免（即非生物下降＞20%），可从活性RT-S9试验组测得的消耗速率中扣除该损失速率，以得到校正的体外固有清除率，但此时应验证非生物损失过程遵循一级动力学。一级清除速率常数，ke（h-1），由-2.3乘以对数-线性曲线的斜率计算得到。用ke除以反应体系中RT-S9蛋白浓度即可得到CLINVITRO,INT。CLINVITRO,INT= 式中：CLINVITRO,INT——体外固有清除率，单位为mL/h/mg蛋白；CRT-S9——培养体系中RT-S9蛋白浓度，单位为mg/mL；GB/TXXXXX—XXXXke——一级清除速率常数，为-2.3乘以对数下降曲线的斜率。10质量保证与质量控制如满足以下条件，试验结果有效：a)应对每批次RT-S9进行评估，应满足附录B中所述的催化I期和Ⅱ期代谢酶生物转化能力的要求；b)应确定每批次RT-S9蛋白浓度(见附录B)，并且应在预试验中提前确定测试底物（受试物）和蛋白浓度，以符合一级动力学要求。混合孵育体系的蛋白浓度可在0.25mg/mL~2mg/mL范围内，常用浓度为1mg/mL。c)在培养期间，阴性对照组（酶促失活RT-S9）中受试物母体无显著损失（如＜活性RT-S9试验组中测得降低量的20%），且无明显增加（如＞20%）。d)至少通过6个时间点确定CLINVITRO,INT，计算回归方程和斜率,R2值应≥0.85。对于代谢较慢的受试物(如斜率较小)，R2可能＜0.85，此时应仔细考虑在进行试验与不进行试验的情况下，所得斜率与0是否存在显著性差异。e)应至少进行两次独立的试验操作，如果RT-S9活性组的2次回归计算结果有显著性差异（如斜率t检验的p＜0.05），则应进行第3次试验以获得2次可靠的结果。11结果报告试验报告应包括以下内容：a)受试物：——单组分物质：物理性状、水溶解性及相关的物理化学性质；化学标识，如IUPAC名称或CAS名称、CAS号、SMILES码或InChI码、结构式、纯度等信息，在适当情况下还应提供杂质的化学鉴别信息（必要时包括有机碳含量）；——多组分物质、不明复杂物质（UVCBs组分未知或者可变的物质、复杂反应产物或者生物材料）和混合物：尽可能提供各组分的化学鉴别信息（如上）、含量和相关的物理-化学特性；——受试物的定量分析方法。b)RT-S9：——如源于购买，应提供以下内容：商业来源；虹鳟鱼供应商；虹鳟鱼种系；驯养环境温度；虹鳟鱼体重；肝脏重量；性腺指数（用以确定性成熟程度）。——如源于制备，见表A.2中模板。——特征描述（见附录B）。c)试验条件：——受试物和参比物的浓度；——受试物和参比物溶液配制方法【名称、助溶剂浓度（如有）】；GB/TXXXXX—XXXX——试剂的配制及组成；——混合孵育体系的配制及组成；——孵育温度；——混合孵育体系的蛋白含量；——试验方法：孵育方法（单瓶或多瓶）；——平行数量（如果每次操作多于1个平行）；——独立试验操作的次数；——取样时间点；——预试验的描述。d)分析方法：——完整描述所使用的受试物浓度分析的过程，以及分析方法的检出限、定量限、变异系数和回收率，标准溶液和内标的配制方法等。e)统计方法：——用于排除异常采样点和/或试验操作的描述和统计方法。f)结果：——预试验结果；——单瓶法的数据，每个独立试验操作（包括各浓度试验组、阳性对照组、阴性对照组）的采样时间点；——生成的代谢产物（如有），包括代谢产物和代谢途径的鉴别；——每个操作中，分别计算受试物和参比物的活性和非活性RT-S9的CLINVITRO,INT；——无显著性差异的各试验操作的平均值和标准偏差，以及平均CLINVITRO,INT的t检验结果；——被排除的采样点或试验操作；——试验中的异常情况，对本文件的所有偏离及相关信息。GB/TXXXXX—XXXXA（资料性）虹鳟鱼肝S9亚细胞组分制备方法A.1虹鳟鱼的相关要求a)RT-S9应从性腺发育不成熟的虹鳟鱼中获取。已有研究表明，性发育不成熟的虹鳟鱼的代谢能力与其性别无关，因此收集RT-S9时无需考虑鱼的性别。b)如鱼来源于购买，应在使用前在实验室至少驯养两周。鱼类在驯养期内不应接受疾病治疗，如有可能，应完全避免由供应商进行任何疾病治疗。不应采用已有临床症状的鱼。c)虹鳟鱼的养殖温度通常为10℃~15℃,实验室驯养时应接近这一温度并维持在±2℃变化范围内。应采取较低的饲养密度，以确保最佳的生长条件和动物福利。d)定期测定水质参数并记录下来，包括：pH值、总碱度(mg/LCaCO3)、溶解氧(mg/L，转换为饱和度百分比)和氨氮(mg/L)(见表A.2)。e)记录鱼的驯养条件，包括：光周期、饲养方式、饲料类型、水温、驯养密度（如kg鱼/L）和每缸鱼数量（尾/缸见表A.2）。应报告上述具体信息，以便在后续应用（如BCF预测模型）中使用特定参数。A.2制备过程a)宜使用新鲜肝脏组织制备S9,冷冻和解冻鱼的肝脏组织会降低CYP酶活性。b)通常从多条（3至6条）鱼中收集RT-S9，这有利于减少单尾鱼的影响，更好地代表一个种群。c)人道处死鱼后,用不含Ca2+/Mg2+的清洗缓冲液（见表A.1）经肝门静脉插管灌注，清除肝脏血d)切除鱼肝脏，用匀浆缓冲液（见表A.1）进行匀浆后，在4℃下离心（13000g~15000g）20min。e)将离心后的上清液等量分装转移至微量离心管或冷冻管中，并置于-80℃±1℃中保存。A.3设备和材料A.3.1仪器a)用于麻醉鱼的容器；b)电子天平（1g~2000gc)镊子，锋利的外科手术剪刀，单刃刀片；d)冷冻离心机（如可用于50mL离心管）；e)锥形离心管（如50mL）；f)23-G×3/4安全翼式输液器（蝴蝶导管）；g)30mL一次性塑料注射器；h)蠕动泵；GB/TXXXXX—XXXXj)6cm预冷玻璃培养皿；k)玻璃烧杯；l)30mLWheatonPotter-Elvehjem组织研磨器和特氟龙研磨棒；m)多速台式钻床；n)吸管；o)吸管帽；p)血清移液管辅助器；q)血清移液管；r)1.8mL工作容积低温储存管；s)微量离心管。A.3.2化学试剂a)3-氨基苯甲酸乙酯甲基磺酸盐；b)碳酸氢钠（NaHCO3c)无Ca2+、Mg2+Hanks平衡盐溶液；d)4-(2-羟乙基)1-哌嗪乙烷磺酸；e)1mol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl）缓冲液，pH7.8；f)1mol/L氯化钾（KCl）；g)0.5mol/L乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA-Na2)缓冲液；h)100mmol/L二硫代苏糖醇；i)蛋白酶抑制剂混合物（可选）；j)蔗糖；k)1mol/L氢氧化钠（NaOH）；l)1mol/L氢氧化钾（KOH）；m)RT-S9蛋白含量测定试剂盒。A.4化学试剂和溶液的配制A.4.1麻醉剂的配制配制MS-222溶液（CAS：886-86-2,150mg/L）：所用的水应与驯养鱼的水一致。如:配制8L，向水中加入1.2gMS-222，搅拌至溶解。使用预先确定的NaHCO3量维持水的pH值,针对低碱度的水，NaHCO3所需的用量大约是MS-222的3倍。A.4.2缓冲液的配制A.4.2.1按照表A.1配制清洗缓冲液和匀浆缓冲液，配制量应大约满足15条鱼的灌注。A.4.2.2配制清洗缓冲液时，将EDTA（终浓度2.3mmol/L）和HEPES（终浓度10mmol/L）加入到HBSS平衡盐溶液（含4.2mmol/L即0.35g/LNaHCO3，不含Ca2+和Mg2+)中。例如配制1L清洗缓冲溶液，应将4.6mL0.5mol/LEDTA和10mL1mol/LHEPES加入到985.4mLHBSS中，用1MNaOH将清洗缓冲液pH调节至7.8，并于4℃下贮存。缓冲液应当月配制，如发现明显污染（如出现漂浮颗粒或浑浊）应弃除。A.4.2.3配制匀浆缓冲液时，50mL1mol/LTris-HCl与950mL超纯水混合，取800mL50mmol/LTris-HCl与150mL1mol/LKCl，4mL0.5mol/LEDTA，10mL100mmol/LDTT和85.55g蔗糖于1L容量瓶中混合，用1mol/LKOH溶液调节pH至7.8，用50mmol/LTris-HCl溶液定容至刻度。匀浆缓GB/TXXXXX—XXXX冲液于4℃条件下贮存。缓冲液应当月配制，如发现明显污染（如漂浮颗粒或浑浊）应丢弃。如果使用了蛋白酶抑制剂，最后一步应该添加蛋白酶抑制剂。表A.1清洗缓冲液和匀浆缓冲液所需的试剂及浓度—a蛋白酶抑制剂可加入匀浆缓冲液中。A.5虹鳟鱼的准备和解剖a)在处死鱼之前应对鱼进行24h禁食。b)由于RT-S9蛋白质在室温下会快速降解，应尽量使用预冷的缓冲液、仪器和玻璃器皿进行相关试验操作。c)将鱼捕获后置于一个装有8L麻醉剂（MS-222）的水缸或水桶中。鱼应完全浸没在麻醉剂中至少1min，当鱼鳃盖停止运动,并完全失去平衡和肌肉张力，且对刺激无反应（通过用力挤压鱼尾底部来判断）时，表明鱼已完全麻醉。随后，对鱼的头部进行猛烈打击，以人道主义的方式将鱼处死。d)称量并记录鱼的体重。e)鱼腹部朝上，采用以下方式进行解剖(见图A.1)：f)用解剖刀从鱼的肛门到咽峡部形成一个中间切口，注意解剖刀不应插入太深；g)从中间切口的末端近鱼尾处延伸至背部表面一半位置处横切一个小口；h)同样从中间切口末端近鳃盖处开一个类似的横切小口。i)切除翻开的皮瓣组织，暴露体腔，肝脏是暗红色的。找到肝门静脉的腹侧分支（从肠到肝门小心清除遮挡的结缔组织（见图A.2）。j)在安全翼式输液器（23-G×3/4-in）插入肝门静脉之前，可以选择先在静脉下方用丝质缝合线（4/0）松散地进行缠绕，输液器连接一个30mL注射器，里面装有预冷的清洗缓冲液（见表A.1）。插入后用4/0缝合丝线紧紧地缠绕固定住注射器的针头，以防止清洗缓冲液从插入部位泄漏。切断从肝脏通往心脏的肝静脉，以便进行组织引流。A.6肝脏灌注GB/TXXXXX—XXXXa)用20mL~30mL预冷的清洗缓冲液对肝脏进行灌注（约10mL/min~15mL/min），直到肝脏的颜色变为白色为止（清除肝脏中的血液，如图A.3）。灌注时对肝脏进行轻轻地按压有助于血液流动，尤其是血流集中的部位。清除血液是为了确保RT-S9中不含血源代谢酶，如血浆蛋白酶。b)清除血液之后，将肝脏切除放置在冰冷的培养皿中，注意不要切破胆囊（一个薄壁囊，通常包含暗绿色或棕色的胆汁）。用剪刀剪断胆囊和肝脏的连接部分，小心移除胆囊。手持一个30mL注射器用5mL~10mL预冷的清洗缓冲液对肝脏进行冲洗，由于胆囊汁会污染肝脏RT-S9且使其代谢酶失活或变性，故通过冲洗步骤以避免肝脏与少量胆汁的接触。一旦肝脏接触了大量胆汁，应停止后续处理。c)用纸巾将肝脏表面多余液体去除之后，对肝脏称重，精确到0.01g。记录下肝脏的重量（见表A.2）。将肝脏置于一个250mL烧杯中，里面装有150mL预冷的匀浆缓冲液，保持冰冷环境直至同一批次的鱼全部完成肝脏收集。d)将性腺（卵巢或睾丸）整体取出并称重，精确到0.01g。供试动物的性腺指数（GSI）等于性腺重量除以动物体重。记录下性腺重量和GSI（见表A.2）。性腺（睾丸或卵巢）表现为沿着肾腹侧腹膜腔纵向延伸的两种组织。可通过测量GSI判断虹鳟鱼的性成熟。一般，雄鱼GSI＜0.05,雌鱼GSI＜0.5则认为性不成熟，也可通过组织学判断鱼的性成熟。e)上述操作应快速进行，从捕鱼开始至将肝脏置于匀浆缓冲液中单尾鱼总时长不超过15min。A.7RT-S9的制备a)对肝脏进行取样和称重后，按如下方式进行：用剪刀或单边刀片将肝脏切成小片0.5cm2）。b)将切碎的肝脏组织连同匀浆液一起转移至Potter-Elvehjem组织研磨器（预冷并保持在冰上用额外等量（与肝脏重量相同）的匀浆缓冲液冲洗烧杯，将冲洗液全部倒入研磨器中。使用特氟龙研磨棒（通常间隙为0.1mm~0.15mm）将组织匀浆，该研杵连接在低速（如500r/min）的台式钻床上。操作时使研杵缓慢到达研磨器底部（每次冲程10s~15s重复4~5次。其他的均质方式可能导致蛋白质变性，需避免采用。c)将肝脏匀浆灌入一个50mL圆底离心管（预冷并保持在冰上）中。假定鱼体重范围400g~600g，取样数量为4~5条，原始肝脏匀浆的预期体积约为50mL~70mL。d)肝脏匀浆在13000g,4℃条件下，离心20min。将离心管轻轻地从离心机中取出。上清液表面可能形成的一层黄色脂质层，这与所采集肝脏的脂肪含量有关，用吸管将黄色脂质层吸出并弃除。将剩余的上清液（即混合的RT-S9）倒入或用血清吸管吸出转入150mL预冷的烧杯中，转移时注意不要倒出底部的肝脏组织。离心管底部的沉淀颗粒组织相对较硬且呈棕色，其表面可能形成一层浅色物质。e)合并的RT-S9用玻棒或者其他类似的混匀，将等份（如0.5mL）的溶液转移至已标记的1.8mL的预冷储存管或微型离心管中，用液氮快速冷冻或者其他等同条件中。注意：RT-S9应一直放置在冰上。推荐大小的4~5条鱼将会产生出35mL~45mLRT-S9,假设将这些分成0.5mL等份储存，需要70~90个预先标记好的已预冷的储存管。储存管在加入样品前应提前置于-20℃冰箱中进行预冷，使用前预冷不超过24h。f)将含有RT-S9的储存管收集起来并转移至液氮或-80℃±1℃冰箱中储存，可贮存至少2年。g)记录一次取样中获得的RT-S9总体积。该值用于计算每克肝脏组织中RT-S9蛋白浓度。A.8RT-S9蛋白质含量的测定GB/TXXXXX—XXXX取3个RT-S9样品管放在冰水浴中解冻（如用微型离心管支架置于盛有冰水的烧杯中一旦冰晶体融化就加入冰块。测定同源均一的RT-S9样品中蛋白含量，可使用标准测定方法如考马斯亮蓝法（Bradfordassay）或商品化的蛋白含量测定试剂盒，遵照相关说明书进行操作（如96孔平底板和微孔板读取器，生物分析仪，比色皿和分光光度计或其他仪器和方法，可以准确地测定蛋白浓度）。对RT-S9可适当稀释，以使测定值落在标准曲线的线性范围内，以避免蛋白质含量测定结果偏低或偏高。给定批次RT-S9的蛋白含量为所测样品的平均值。表A.2鱼类信息、驯养条件和观察记录）：水温(℃):）：水的流速（L/min）：）：1234GB/TXXXXX—XXXX图A.1鱼安乐死后需要通过切口暴露的鱼内部器官图A.2输液器插入鱼的肝门静脉清除肝脏中的血液GB/TXXXXX—XXXX注：图中鱼已达到性成熟，仅用于展示说明，应使用性未成熟的图A.3成功清除血液后变白的肝脏外观GB/TXXXXX—XXXX（资料性）虹鳟鱼肝亚细胞组分的表征评估每批次RT-S9催化I期和Ⅱ期的生物转化能力，这些表征测定可在新制备或解冻的RT-S9上进行。表B.1中列出催化I期和Ⅱ期生物转化活性测定的建议，简要描述了常用的方法和底物，测定的结果应包括在测试报告中可使用已知的受试物评估RT-S9的活性。通常，将RT-S9稀释至试验所需的蛋白浓度，将结果转换化为蛋白含量。如果已知受试物可能的生物转化途径，则可预先评估该途径，前提是有标准化的测定方法。可使用测定的方法如评估30分钟时的酶活性或测定动力学活性。如果将结果与其他实验室进行比较，则应考虑确定的条件如底物浓度、蛋白浓度、孵育时间、评价终点或采样时间点。表B.1常用于表征RT-S9酶活性测定的底物酶阶段Ⅰ7-乙氧基试卤灵O-脱烷基化7-甲氧基异酚噁唑O-脱烷基7-羟基吩噁嗪酮二戊醚O-脱阶段ⅡGB/TXXXXX—XXXX（资料性）酶促失活的虹鳟鱼肝S9亚细胞组分的制备宜提前制备大量酶促失活的RT-S9，并将其等分试样（如0.5mL），冷冻保存。以酶促失活的RT-S9为底物清除测定的阴性对照材料。通常，将RT-S9置于一个加盖的小瓶中并于100℃沸水中加热灭活，如果加热灭活获得的材料中存在过度凝集的样品，可使用手持式均质器处理所得的酶促失活材料，以方便吸取。对照。相关的仪器a)加热板；b)烧杯（水浴）；c)用于在水浴中煮沸RT-S9的带盖容器；d)手持式组织匀浆器（如15mL可选e）1.5mL微量离心管。材料：已知蛋白浓度的RT-S9。记录悬浮液的体积，并将悬浮液转移至受热安全的容器中（优选玻璃）。烧杯加水后置于加热板上加热至沸腾，将带有RT-S9悬浮液的加盖容器放入沸水浴中，使悬浮液缓慢沸腾15min。待RT-S9冷却后，将其转移至量筒，用100mmol/L磷酸钾缓冲液调节体积以维持所需的浓度。如果观察到过量凝集，将其转移至手持式均质器，均化样品直至溶液均匀（可选）。在用于测试之前，用100mmol/L磷酸钾缓冲液稀释RT-S9至所需浓度（如10mg/mL）。将酶促失活的RT-S9等分试样（如0.5mL）转移至1.5mL微量离心管中，并在-20℃±1℃下储存直至使用。GB/TXXXXX—XXXX（资料性）建立初步试验的反应条件初步试验的主要目标是确定获得一级清除动力学的反应条件，建立取样时间表以获取受试物清除情况（与阴性对照有显著性差异），同时确定在终点时受试物在体系中保留的浓度即可定量的浓度。用于初步实验的RT-S9需已知I期和Ⅱ期酶活性结果（见附录B）。建立具有已知准确度、精密度和灵敏度的适当分析方法，用于测定试验介质中受试物浓度，提供受试物制备和储存的详细资料，应获得试验介质中受试物的LOQ。为获得受试物清除速率以用于体外-体内外推模型中，通常希望在测定过程中实现清除20%~90%的受试物为佳，为达到此目标涉及的变量包括：蛋白浓度、起始受试物浓度和总孵育时间。除了上述条件，为实现精确测定底物的清除还需考虑以下因素：分析方法的灵敏度，选择内标物，选择能够溶解受试物，引入体系和终止反应的溶剂，采用阳性对照（参比物）和阴性对照（附录C）。底物清除试验包括初步试验，通常设置蛋白浓度范围为0.25mg/mL~2mg/mL，最常用浓度为1mg/mL。受试物的起始浓度是由获得一级动力学的需要以及分析方法的灵敏度共同决定的，应考虑到可能需要测定的浓度远低于起始浓度值的情况（如在随后的时间点）。分析方法的灵敏度应能准确测定所有时间点的受试物浓度或受试物初始浓度的10%。理论表明，一级动力学可能随着起始浓度降低至米氏常数（michaels–menten，KM）以下而增加（KM是指当反应速率达到1/2Vmax的底物浓度，Vmax指体系中底物达到最大饱和浓度时的反应速率）。实际上，由于受试物分析方法的局限性，不可能总能达到这些浓度，实践表明起始浓度低至微摩尔/纳摩尔范围（如≤1.0μmol/L）时通常产生令人满意的结果，因此选择最低合理的受试物浓度进行清除实验即可。为了选择合适的起始受试物浓度，可对三种浓度进行评价：a)1.0μmol/L或基于已有信息的其他浓度（如有）；b)假设实现50%受试物清除，可被定量的最低浓度。可使用决策树对受试物的起始浓度作最终选择。GB/TGB/TXXXXX—XXXX图D.1选择清除试验起始受物浓度初步试验一般在有限的时间点（如6min、30min和60min）进行。在正式试验中，通常首选获得最快速清除速率的受试物起始浓度，若几个测试受试物浓度产生相似的清除率，较高的浓度是首选，因为降低了对分析方法检出限的要求。根据需要，取样时间方案可能＜10min，最长可达2h，对于生物转化较慢的受试物，最长可达4h，通常包含6个或更多的取样时间点。不能期望获得的一级清除速率常数与蛋白浓度或测试受试物浓度成正比。不建议将蛋白浓度提高至2mg/mL以上，以免酶饱和。如果受试物的起始浓度使负责清除的酶活性达到饱和，可预期偏离一级动力学。对于呈现经典米氏动力学的反应路径，这种饱和将导致零级清除，零级动力学的出现表明需降低受试物起始浓度。此外，对数转换的数据可能产生一个双指数动力学模式，包含着一个“快”的初始阶段和紧随的一个“慢”的结束阶段，该模式由产物抑制引起，其中包括产物形成后的酶活性、辅因子的限制，酶饱和等，尝试降低受试物起始浓度和蛋白浓度以解决该问题。GB/TXXXXX—XXXX（资料性）试验方法的建立E.1单瓶法推荐使用单瓶法测定容易分析的受试物(如无挥发性、不粘附在容器壁上、在孵育体系中能迅速分布)。它通常产生最少的变量结果，执行最简单。包含1mL悬浮液体系的单瓶中进行孵育试验，根据规定的时间点从单瓶中取样品（如100μL）至装有终止溶液的微量离心管中。至少需6个时间点确定CLINVITRO,INT，因此,试验设置需包括≥6个时间点（如2min、10min、20min、30min、60min、90min、120min）。图E.1单瓶法的运行GB/TXXXXX—XXXXE.2多瓶法该方法设计为独立小瓶中孵育，宜用于挥发性或疏水性强的受试物。可使用密闭GC瓶测定挥发性受试物，如添加200μLRT-S9孵育混合物至GC瓶，预孵育后盖上带隔垫的盖子，使用注射器分别加入受试物和终止溶液，或添加受试物后直接盖紧小瓶，待反应后添加终止溶液前打开小瓶。赫施曼瓶(Hirschmannglass)可用于测定疏水性强的受试物。每个独立小瓶至少包含2次独立运行用于测定CLINVITRO,INT,每个独立运行在不同天或者当天运行，为每次运行提供如下内容：a)每次独立运行时新鲜配制的受试物试验溶液；b)采用独立解冻的RT-S9，每次运行时，根据预先确定的瓶数准备活化的RT