植物组织培养

实验7-8植物组织培养

（planttissueculture）

一、实验目的明确植物组织培养概念，掌握植物组织培养的基本原理与技术。组织培养：在无菌条件下，将离体的植物器官、组织、细胞以及原生质体，在人工控制的环境里培养成完整植株的过程。

二、实验内容和原理实验内容：1、利用母液配制培养基——防沉淀、防失活、合适pH、高压灭菌。2、选取无菌外植体接种。在无菌条件下，将灭过菌的材料，经适当切割，转移到培养基上。3、控制条件下培养，观察成苗全过程。实验原理：植物组织培养的理论基础－－植物细胞全能性（totipotency）。植物的每个细胞都包含着该物种的全部遗传信息，从而具备发育成完整植株的遗传能力。在适宜条件下，任何一个细胞都可以发育成一个新个体。（1）外植体（explant）

：用于离体培养的各种植物材料。（2）脱分化（dedifferentiation）：在组织培养中，外植体周围细胞可进行细胞分裂，这种原已分化的细胞在一定的条件下，失去原有的形态和机能，重新恢复细胞分裂能力。（3）愈伤组织（callus）：在组织培养中，外植体的脱分化，分裂形成的没有分化的无组织的细胞团。（3）再分化（redifferentiation）：愈伤组织在适当的培养条件下（继代培养），再度分化形成另一种或几种类型的细胞过程。

初代培养（primaryculture）：指在组织培养过程中，最初建立的外植体无菌培养阶段。由于首批外植体来源复杂，携带较多细菌，要对培养条件进行适应，因此，初代培养一般比较困难。继代培养（subculture）：在组织培养过程中，当外植体被接种一段时间后，将已经形成愈伤组织或已经分化根、茎、叶、花等的培养物重新切割，转接到其它培养基上以进一步扩大培养的过程称为继代培养。愈伤组织2.广泛应用（１）快繁脱毒马铃薯、草莓、贝母、百合、芋头、甘蔗。

（２）植物天然药物工厂化生产麦角菌、灵芝、猴头菇等真菌进行工业化生产，高等植物组织培养在工业化中的应用也正在研究。红豆杉

（3）植物转基因研究愈伤组织是很好的转基因材料。转基因抗性鉴定叶片涂抹200mg/L草丁膦共培养诱导丛生芽筛选丛生芽茎诱导茎诱导生根转基因苗幼苗GUS染色转基因对照三、主要仪器设备：无菌（光照）培养室、超净工作台，高压灭菌锅、pH计等。四、操作方法与实验步骤：（一）培养剂配制

培养基种类:MS培养基、B5培养基、White培养基、N6培养基等等。母液配制（实验书表）大量元素——N、P、K、Ca、Mg、S

微量元素——Fe、I、B、Mn、Zn、Mo、Cu、Co

有机物——肌醇、烟酸、盐酸吡哆醇、盐酸硫胺素、甘氨酸植物激素——NAA、6-BA（生长调节剂）蔗糖——碳源营养，

渗透调节

信号物质MS+NAA0.1mg/L+6-BA1.0mg/L每个大实验台上的8名同学共配500ml。1、先在搪瓷量杯中加入约350ml蒸馏水，依次加入下列组份并搅拌溶解：大量元素(10×)50mlCaCl2(100×)5ml微量元素(100×)5ml铁盐(100×)5ml肌醇(100×)5ml烟酸0.5mg/ml0.5ml盐酸吡哆醇(0.5mg/ml)0.5ml盐酸硫胺素(0.1mg/ml)0.5ml甘氨酸(2.0mg/ml)0.5mlNAA(0.1mg/ml)0.5ml6-BA(1.0mg/ml)0.5ml

蔗糖15.0g2、定容到500ml。3、测pH并调到5.8。4、加琼脂3.5g，加热熔化(煮沸2次)，补充蒸馏水至500ml刻度液面。5、分装到试管。每人共分装2管，每管培养基液面高度2-3cm。拧盖密封。以大实验台号+实验时间段进行批次标记。6、高压蒸汽灭菌。121℃15-20min。本灭菌锅从进到出2h。7、冷却凝固，4－10℃下贮存，为下次备用。（二）接种（下周实验）1.选择花椰菜细枝梗，先用流水冲洗表面污物，接着用75%的酒精浸泡30s，用无菌镊子转移到小瓶无菌水中，再在10%的次氯酸钠溶液中浸泡10min（两种消毒剂都必须及时加盖密封，以免挥发影响浓度，中间需摇晃数次），然后取出用无菌水冲洗3-4遍（置于无菌水中备用）。把制好的培养基，放在超净工作台上，以便取用。2.点燃酒精灯。棉球擦拭双手及台面。3.将镊子和解剖刀插入电子杀菌器中20s以上，取出镊子，待刀冷却后，夹取一张无菌滤纸置于酒精灯前方。用镊子取出灭菌过的花椰菜细枝梗，置滤纸中间，用镊子夹住，将花椰菜细枝梗（外植体）切割成0.5-1cm的小段，取2～3块接种于培养基上（操作时尽量靠近酒精灯火焰），及时拧好管盖。4.接种完毕，作好标记，清理台面。五、实验数据记录和处理：观察愈伤组织生长和分化，拍摄动态照片。六、实验结果与分析：分析培养过程愈伤组织生长和分化情况