(高清版)GBT 41799-2022 限制性核酸内切酶杂质检测方法

限制性核酸内切酶杂质检测方法Assaymethodofrestrictionendonucleaseimpurity2022-10-12发布国家标准化管理委员会I l2规范性引用文件 13术语和定义 14原理 15试剂或材料 16仪器设备 27试验步骤 2附录A(规范性)琼脂糖凝胶电泳 4Ⅲ本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由全国工具酶标准化工作组(SAC/SWG11)提出并归口。本文件起草单位：福建南生科技有限公司、通用生物(安徽)股份有限公司、夏禾(深圳)生物技术有限公司、厦门银祥集团有限公司、苏州坤琪生物科技有限公司、厦门中集信检测技术有限公司、上海鹰姿生命科技有限公司、雷谷(厦门)生物医药有限公司、北京化工大学、山东大学、安琪酵母股份有限公司、复旦大学、武汉科技大学、北京中天标科标准化技术研究院有限公司、厦门艾德生物医药科技股份有限公司。限制性核酸内切酶是一类识别双链DNA中特定核苷酸序列的DNA水解酶，以内切方式水解DNA,产生5'-PO₃和3'-OH末端。限制性核酸内切酶的作用底物是脱氧核糖核酸(DNA),其他核酸内切酶或核酸外切酶的污染会导致底物的降解或消失，降低其他核酸内切酶或核酸外切酶的污染是限制性核酸内切酶最重要的质量保证。制定限制性核酸内切酶杂质检测方法国家标准，用以推动该类工具酶的产业化，对于限制性核酸内切酶的生产和使用具有重要的意义。1限制性核酸内切酶杂质检测方法本文件描述了限制性核酸内切酶中污染其他核酸内切酶或核酸外切酶等杂质的检测方法。本文件适用于限制性核酸内切酶杂质的检测。2规范性引用文件本文件没有规范性引用文件。3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。以内切方式水解DNA,产生5'-PO₃和3'-OH末端，识别双链DNA中特定核苷酸序列的DNA水解酶。影响核酸底物存在的其他核酸内切酶和核酸外切酶。带，它们的大小及核苷酸顺序均为已知。样品中无其他核酸内切酶污染，酶解产物在电泳板上形成的谱带与酶解时间过长、用酶过多无关。由于BamHI切开DNA双链产生一对黏性末端，其各有5个碱基失去互补碱基形成突出单链，其易受核酸外切酶作用丢失若干个碱基乃至形成平末端；如果将此DNA连接后再用BamHI酶切，结果是无法切开。如果该位点是在外显子区或编码区，即意味其对应的氨基酸序列发生变化，乃至某些生物性状发生改变。例如质粒pBR322所含BamHI识别位点是在其抗四环素基因上，如果使用被核酸外切酶污染的样品BamHI过量长时程切割pBR322,然后再连接闭环后重新转化受体菌，该菌在含四环素培养基上无法生长，而没有这样酶切的pBR322转化菌能够生长。又如质粒pUC19所含BamHI位点居于编码LacZ的α互补肽上，若发生前述状况，就会导致该肽链的氨基酸序列变化，最终在含IPTG和X-gal的LB培养基上由原本是蓝斑变成白斑。如果白斑数目占到总菌斑数的10%以上，就判定该样品已有核酸外切酶污染。5试剂或材料25.2φX174噬菌体脱氧核糖核酸(φX174DNA)。5.3琼脂糖。5.4共价闭合环状质粒pUC19DNA(cccpUC19DNA)。5.5T4噬菌体DNA连接酶(T4DNA连接酶)。5.6LB培养液。5.7三氯甲烷-异戊醇(24:1,体积比):24mL三氯甲烷、1mL异戊醇。5.8大肠杆菌DH。(感受态):通过处理使大肠杆菌DH。细胞的通透性变大，便于外源基因或载体进入感受态细胞。5.9LB平板(含X-gal、IPTG、氨苄青霉素):胰蛋白胨10g、酵母抽提物5g、氯化钠10g、琼脂粉15g,加入纯化水至1L,用1mol/LNaOH调节pH至7.0,121℃高压灭菌20min,待冷却至50℃~6仪器设备7试验步骤7.1其他核酸内切酶检测7.1.1长时程过量酶切反应取4只1.5mLEP管，管1#、管2#、管3#、管4#;管1#和管2#各加入1μgλDNA,管3#和管4#各加入1μgφX174DNA;每管加入5μL10×反应缓冲液，管1#、管2#、管3#加入10U(1μL)BamHI,管4#不加BamHI,均加入纯化水至50μL,混匀，37℃酶切，1h后取出管1#,置冰箱待电泳检测；10h后取出管2#、管3#、管4#,置冰箱待电泳检测。在1%～1.5%琼脂糖凝胶、电泳电压为5V/cm～10V/cm的条件下，当溴酚蓝线到达凝胶板2/3的位置时停止电泳，取出凝胶板置于紫外透光分析仪观察和拍照。按附录A的方法进行电泳检测。在电泳板上，肉眼观察。若管1#和管2#的谱带一致，管3#和管4#的谱带一致，则判定样品中不含其他核酸内切酶；若管1#和管2#的谱带不一致或(和)管3#和管4#的谱带不一致，则判定样品中含其他核酸内切酶。7.2核酸外切酶检测7.2.1长时程过量酶切取5μg高纯度cccpUC19DNA置于一只1.5mLEP管里，加入10μL10×BamHI缓冲液，5μLBamHI(50U～100U),加入纯化水至总体积100μL;混匀后置于37℃水浴槽，1h后取出40μL,其中20μL(管1#)待电泳检测，另20μL(管2#)待连接及蓝白斑计数；所剩60μL继续酶切达10h以上，再将其均分为三管，分别标记管3#、管4#、管5#。37.2.2.1取出管1#和管3#,加入载样缓冲液，准备电泳检测。7.2.2.2在1.5%琼脂糖，电泳电压5V/cm～10V/cm的条件下，当溴酚蓝线到达凝胶板2/3位置时停止电泳，取出凝胶板置于紫外透光分析仪观察和拍照。按附录A的方法进行电泳检测。取出管2#、管4#、管5#,各加入20μL三氯甲烷-异戊醇先脱去杂蛋白，再沉淀出DNA,并真空干燥样品。每管加入2μL10×T₄DNA连接酶缓冲液，2UT₄DNA连接酶，加入纯化水至总体积20μL,混匀后置于15℃水浴槽水浴8h。7.2.3.3.1将感受态菌液加入含连接处理过的DNA的EP管内，轻混，置于4℃冰浴槽水浴0.5h以上。7.2.3.3.2将上述三只EP管移到42℃水浴中热击2min,迅即取出再置于4℃冰浴槽水浴0.5h以上。7.2.3.3.3向上述三只EP管各加入1mLLB培养液，轻混，置于37℃水浴槽水浴1h。7.2.3.3.4将15块固态LB板，分别标上管2#、管4#、管5#,每号均有5块板；在超净工作台铺板，每板加入上述菌液200μL;待板上菌液停止流动时，翻转平板，置于37℃恒温培养箱8h以上。7.2.3.3.5计算每块板蓝白斑数量，再算出每号管对应的每个处理的蓝白斑总数及百分比。7.2.4.1在电泳板上，管1#和管3#的谱带没有明显差异，说明长时程过量酶处理对DNA没有造成额外的切割。7.2.4.2管2#、管4#、管5#的白斑总数与其蓝斑总数相比。若比值小于1/9,则判定样品不含外切核酸酶；若比值大于或等于1/9,则判定样品含有核酸外切酶。4(规范性)琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳，是以琼脂糖为介质，对不同大小的DNA实现分离的一种电泳方法。琼脂糖是一种多糖，具有亲水性，但是不带电荷。当在碱性条件下时，DNA带负电，在电流作用下，可以琼脂糖凝胶为介质，由负极向正极移动，不同DNA分子片段的大小和性状不同，在凝胶中的泳动速率也不同，导致电泳后的DNA分子通过染料嵌合和紫外线照射而显示出在凝胶电泳中不同的位置。A.2试剂或材料A.2.1琼脂糖。A.2.3溴化乙锭(EB)。A.3仪器设备A.4实验步骤A.4.2根据欲分离DNA片段大小用1×TAE缓冲液配制适宜浓度的琼脂糖溶液，应准确称量琼脂糖干粉加到盛有定好量的1×TAE缓冲液的三角烧瓶中摇匀，置于微波炉加热至琼脂糖完全熔化。A.4.3将琼脂糖凝胶液稍微冷却后加入溴化乙锭，终浓度为0.5μg/mL,轻轻旋转烧瓶充分