临床分子生物学检验临床应用

临床分子生物学发展及临床应用从整体水平到分子水平示意图分子水平细胞水平整体水平

生命科学的发展过程：RobertHooke,1665Watson,Crick,1953临床分子生物学检验的定义及其发展

20世纪50年代，WatsonandCrike提出了DNA双螺旋结构，标志着现代分子生物学的兴起，为人类生命现象的本质奠定了基础。分子生物学是生命科学中发展最快并且与其他学科广泛交叉和渗透，已成为主导21世纪生命科学的前沿学科。临床分子生物学检验的定义及其发展目的：研究生命现象本质对象：生物分子的结构与功能技术：基因克隆、基因扩增、基因组测序、基因敲除、印迹杂交、芯片技术、双向电泳等。临床分子生物学检验的定义及其发展分子生物学打破了学科的界线医学分子生物学把医学各学科联系在一起分子生物学分子药理学分子肿瘤学分子遗传学分子免疫学分子流行病学分子病理学分子神经学临床分子生物学检验的定义及其发展临床分子生物学：是利用分子生物学理论与技术从基因组、转录组、蛋白质组、代谢物组等水平研究疾病的发生发展机制、疾病的预测与风险评价、疾病的临床诊断与治疗，以及疾病的预防与控制。临床分子生物学将有力地推动临床医学走向分子医学时代。临床分子生物学检验的定义及其发展以疾病为中心展发生、发诊断、治疗预防、控制高特异性新一代检验诊断技术高灵敏度高通量化高自动化靶标生物分子标志物针对疾病相关生物分子在疾病发生发展、预防干预、治疗过程中的变化趋势、规律、范围临床分子生物学检验高特异性可实现微量标本、微量生物分子的微小变化的快速检验临床分子生物学检验的定义及其发展临床分子生物学检验发展经历的四个阶段：一、1976年，以导致遗传病的基因突变位点为靶标，以液相DNA分子杂交为核心，成功的进行了地中海贫血的产前诊断，开创了临床分子生物学检验的先河。二、1985年，以PCR技术为核心，大量扩增DNA序列，衍生出了很多检测方法（限制性内切酶多态性分析技术、单链构象多态性技术）等；三、以生物芯片为核心的高通量密集型技术。根据芯片上固定的探针不同，可分为基因芯片、蛋白质芯片、组织芯片等。主要用于基因表达谱测定、突变检测、多态性分析、杂交测序等。四、以DNA测序技术为核心技术。DNA测序可以为临床疾病的分子诊断提供最精确的判定依据，现已成为临床分子生物学检验基本技术之一。特别是第三代测序技术-单分子实时测序，速度更快，成本更低，将使个体化医疗成为现实。临床分子生物学检验发展经历的四个阶段：临床分子生物学检验靶标及其应用从广义上来讲，应用到临床的分子标志物包括基因组DNA、各种RNA、蛋白质和各种代谢物，目前，临床分子生物学检验的靶标主要以核酸（DNA或RNA）为主。DNA为靶标个体基因组特征性DNA片段鉴定（病原菌、致病基因疾病相关基因位点）基因拷贝数的测定基因组DNA突变的检验分析基因组DNA中基因表达的各种调控元件（启动子、沉默子、增强子）的检验分析线粒体基因组DNA拷贝数测定与突变的检验分析外周血游离循环DNA的检测RNA为靶标RNA病毒基因组序列测定及其拷贝数测定基因转录产物mRNA水平的检测疾病相关的各种微小RNA（microRNA）的检验分析外周血游离循环RNA的检测蛋白质分子标志物为靶标癌胚抗原CEA、CA系列检测各种血浆蛋白测定病原体感染后抗体谱的检测代谢物为靶标脂肪酸代谢氨基酸代谢有机酸代谢药物代谢基因组DNA靶标是目前临床分子生物学检验最常用的分子靶标临床分子生物学检验靶标及其应用一、病原生物基因组菌种鉴定：PCR-测序和PCR-DNA探针杂交等技术可以快速和准确的用于结核杆菌菌种的鉴定，缩短检测时间。2.确定病毒感染和病毒载量：荧光定量PCR技术是明确感染源，判断病情及传染性，监测临床疗效的客观和有效指标。

一、病原生物基因组3.病毒分析：基因型变异产生不同临床症状和预后，基因变异使病毒产生变异株，导致耐药。4.细菌耐药监测和分子流行病学调查：抗生素大量使用导致菌群失调，机体微生态平衡遭到破坏。用随机扩增多态性DNA技术进行耐药基因分型、同源性分析；指导选择治疗方案。还可用于追踪和控制传染源及可能的传播途径，确定患者反复感染是源于复发还是在感染等。

二、基因突变1.致病基因的分子缺陷单基因致病基因的检测是诊断遗传性疾病最可靠的实验手段。采用DNA印记技术、PCR技术、突变检测技术、基因表达产物量分析技术等可以确定疾病的分子缺陷，明确诊断。致病基因结构发生了改变，影响了编码产物量和质的改变，如血红蛋白病、血友病、Duchenne肌营养不良等。二、基因突变2.线粒体基因突变线粒体基因突变检测（PCR、点突变检测）对诊断线粒体遗传病有重要价值。如糖尿病的研究。3.肿瘤相关基因研究基因结构的改变、癌基因激活和抑癌基因失活机制、信号传导通路中相关分子的变化，对我们了解肿瘤的发生机制、浸润转移与基因改变的关系，寻找肿瘤治疗靶点提供了突破口。

三、基因多态性基因多态性用于：1.基因定位和遗传病相关性分析通过分析遗传标志的多态性，可将致病基因定位于染色体的特定区域，推测遗传标志与疾病的关联程度。2.疾病诊断和遗传咨询遗传性疾病除了对患者基因缺陷分析以外，还要对其家系成员有无疾病病风险进行评估。当孕妇为携带者时要做产前诊断。3.多基因病的研究主要是检测相关基因的多态性，有助于了解疾病发生机制、疾病分类、靶器官损伤情况、指导个体用药和评估病情预后。4.器官移植配型和个体识别主要是器官移植前HLA配型，犯罪嫌疑人识别、亲子鉴定等。四、循环游离核酸包括游离DNA和游离RNA，与生理和病理状态下的细胞代谢密切相关。其水平检测在产前诊断、肿瘤早期诊断和病程监测等方面意义重大。如血浆中microRNA可作为潜在分子标志物.1.循环游离核酸与肿瘤在肿瘤患者检测microRNA、K-ras、P53、APC等癌基因和抑癌基因的突变，对肿瘤的治疗和病程都可进行监测，可作为潜在的早期诊断和预后判断的分子标志物。四、循环游离核酸2.游离核酸与产前诊断孕妇外周血中的游离DNA是无创性产前诊断较佳的分子标志物孕后5周即可检测到。可用于胎儿性别鉴定、单基因遗传病等的检测，胎儿游离RNA检测，可对胎儿染色体畸变进行产前诊断。3.循环micoRNA与肿瘤诊断micoRNA与肿瘤的发生、发展有着极为密切的关系，micoRNA在肿瘤的异常表达，具有组织特异性，在血液中稳定性很高，可能是血液中理想的肿标，并在恶性肿瘤中得到证实。第三节临床分子生物学检验发展与应用临床分子生物学技术靶标：生物分子主线：基因结构、表达变化功能改变主要技术：分子杂交、PCR、DNA测序、芯片、双向电泳、色谱-质谱、生物信息学靶标变化：以基因突变检测遗传性代谢病以病原微生物基因组及其拷贝数检测感染性疾病以疾病全基因组关联性分析SNPs检测疾病风险分析及耐药性。应用范围日益广泛第三节临床分子生物学检验发展与应用检验领域的改变：从单一的病因检验诊断到疾病的风险评估、病因分析、疗效评价、预后评估等综合检验诊断。检验方法的改变：定性到定量、低通量到高通量、手工到自动化，从而实现灵敏度、特异性的提高，实现快速早期检验诊断。质量控制体系也从无到有，从室内质控到室间质评来保证检测结果的真实、可靠、准确、有效。所以临床分子生物学检验对感染性疾病、遗传性疾病、肿瘤等诊断与治疗发挥着愈来愈重要的作用。第三节临床分子生物学检验发展与应用感染性疾病(包括血液筛查)遗传病检测(包括染色体病检测)肿瘤学(包括肿瘤个体化治疗)药物基因组学(个体化用药)预测医学一、临床分子生物学检验与感染性疾病诊断与治疗严重影响人类健康的病原生物结核杆菌肝炎病毒人类免疫缺陷病毒SARS病毒禽流感、原虫以上病原生物基因和基因组的研究成为消灭病原生物、控制人类感染性疾的重要内容，耐药机制的研究在控制耐药性和医院获得性感染也很重要。一、临床分子生物学检验与感染性疾病诊断与治疗以前病原体的检测主要依靠病原学及免疫学方法检测，但是方法受到灵敏度和特异性的限制，使得感染性疾病的诊断受到影响。但随着生物学技术的应用，不仅可以对微生物感染做出确诊，还可以对感染性病原体进行分型和耐药性监测，在人类感染性疾病的临床诊断、流行病学调查、微生物分类分型研究中显示出它独特强大的功能。示例：HPV分型与相关疾病风险预测预测受检者的患病风险度，决定其筛查间隔：6、11型不会引起宫颈癌，高危型16、18等会最终导致宫颈癌对HPV阳性病人进行随访监控，控制病情发展，避免过度治疗宫颈病变病人手术前后随访提供依据24示例：HBV分子分型与耐药性检测HBVP区测序：预测拉米夫定、恩替卡韦、阿德福韦和替比夫定等药物的耐药情况HBVC区测序：预测HBV感染慢性化和肝细胞损伤加重25二、遗传性疾病的临床分子生物学检验遗传性疾病的分类：Mendelian遗传病、多因素遗传病、染色体异常遗传病(如21-三体)遗传性疾病中的四种基本应用：遗传病基因携带者筛查、遗传易感性筛查、产前诊断、新生儿筛查相关检测技术：荧光原位杂交（FISH）、单核苷酸多态性（SNP）分析，PCR-测序、比较基因组杂交（CGH）、基因拷贝数多态（CNV）等26示例：出生缺陷无创性产前筛查母体外周血胎儿有核红细胞(FNRBCs)母体血清/血浆胎儿特异性DNA甲基化标志物胎儿DNA的阳性标记物克服遗传学水平检测胎儿DNA的局限性27示例：遗传性耳聋健康人群筛查：评估耳聋基因携带者的生育风险高危人群孕检：预测聋胎生育风险，早期产前诊断新生儿筛查：早期发现易感基因携带情况(如：氨基糖甙类药物易感基因携带者)28三、肿瘤的临床分子生物学检验肿瘤是细胞基因组和他的微环境持续相互作用的结果，肿瘤相关基因包括癌基因和抑癌基因。癌基因具有潜在诱导细胞恶性转化的特征。肿瘤细胞基因组会出现缺失、重排、甲基化、扩增和插入.后基因组时代有许多方法分析肿瘤，最流行的是依赖于基因组学和蛋白组学的生物技术肿瘤的临床分子诊断主要集中在两个领域肿瘤分子诊断与分子分型肿瘤个体化治疗29

三、肿瘤的临床分子生物学检验

应用肿瘤分子标记来检测肿瘤细胞出现的缺失、重排、甲基化、扩增和插入，从而对肿瘤早期诊断、分子分型、预后和治疗方法的选择提供指示，并可获得肿瘤易感性30肿瘤转移预测肿瘤分子分型肿瘤预后判断示例：肿瘤转移预测31示例：肿瘤分子分型32示例：肿瘤预后判断33

四、临床分子生物学检验与个体化医学

个体化医学是现代医学的核心目标，包含个体化诊断和个体化治疗两个部分，个体化诊断是个体化治疗的基础，个体化治疗是个体化诊断的目的。如细胞色素P450酶系基因多态性的检测，可指导个体用药剂量；线粒体点突变可指导氨基糖苷类药物的应用，HER2（人表皮生长因子受体）的检测可指导抗肿瘤药物赫赛丁的临床应用。四、临床分子生物学检验与个体化医学肿瘤治疗药物在不同种族人群或个体间存在显著的敏感性和不良反应的差异肿瘤个体化治疗临床分子诊断的两个基本应用领域靶向治疗：EGFR类单抗药物(西妥昔、易瑞莎)传统化疗：依利替康、5-氟脲嘧啶、铂类药物35肿瘤个体化治疗——靶向治疗靶向治疗是在细胞分子水平上，针对已经明确的致癌位点(如：肿瘤细胞的一个蛋白分子或基因片段)来设计相应的治疗药物，药物进入体内会特异地选择致癌位点来相结合发生作用，使肿瘤细胞特异性死亡，而不会波及肿瘤周围的正常组织细胞通过实时定量、基因测序、FISH等技术检测肿瘤患者基因突变及拷贝数变异(CNV)，根据检测结果使用对应的靶向生物药物治疗：单克隆抗体和小分子化合物等36示例：KRAS基因突变检测KRAS基因突变可以使MAKP途径持续性激活，最终导致EGFR单抗类药物(爱必妥)的治疗无效(如：结直肠癌、胃癌、头颈部癌及肺癌等)KRAS基因痕量突变检测技术——在扩增体系使用了抑制野生型KRAS基因扩增的探针，从而使反应体系只能选择性扩增突变型KRAS基因，达到高灵敏度(0.01%)检测KRAS基因痕