萆苓方对糖尿病痛风模型大鼠PGE2、COX-2水平的影响

萆苓方对糖尿病痛风模型大鼠PGE2、COX-2水平的影响摘要目的：探讨萆苓祛痛方（萆苓方）对糖尿病痛风模型大鼠PGE2、COX-2水平的影响。方法：选取健康雄性SD大鼠50只，体重180±20g。适应性喂养1周，随机分为正常组、模型组、萆苓方组、吲哚组、吡格列酮组。正常组予以普通饲料喂养，其余组予高脂饲料喂养。4周后以链脲佐菌素35mg/kg腹腔注射一次诱导糖尿病模型，以血糖≥16.7mmol/l作为糖尿病成模的标准。成模后萆苓方组按10g/kg、吲哚美辛组按5mg/kg、吡格列酮组按15mg/kg给药，正常组、模型组予等量生理盐水。4天后关节腔注射5g/L尿酸钠溶液1次，诱导痛风模型。20天后腹主动脉取血测定血糖、血尿酸、PGE2、COX-2的表达水平。结果：与正常组相比，模型组PGE2、COX-2明显升高（p<0.01）；给药后，萆苓组、吲哚组指标显著降低（p<0.01）。造模后，各组动物体重均低于正常组（p<0.05或p<0.01）；给药后，吡格列酮组与萆苓组体重较模型组增高（p<0.05）。与正常组相比，模型组血糖、血尿酸明显升高（p<0.01），给药后，萆苓组、吲哚美辛组血糖、血尿酸显著降低（p<0.05或p<0.01）。结论：萆苓方可帮助恢复体重,降低血糖、血尿酸水平，明显抑制PGE2、COX-2高表达。关键词萆苓方糖尿病痛风大鼠体重PGE2COX-2EffectofBilingPrescriptiononPGE2andCOX-2LevelsinDiabeticGoutModelRats【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheeffectsofbilingqutongprescription(referredtoasbilingprescription)onthelevelsofPGE2andCOX-2inratswithdiabeticgout.Methods50healthymaleSDratswereselected,withaweightof180+/-20g.After1weekofadaptivefeeding,theywererandomlydividedintonormalgroup,modelgroup,bilingprescriptiongroup,indomethacingroupandpioglitazonegroup.Thenormalgroupwasfedordinaryfeed,whiletherestwerefedhigh-fatfeed.Fourweekslater,streptozotocin35mg/kgwasadministeredintraperitoneallytoinducediabetesmodel,andbloodglucoseof16.7mmol/lwasusedasthestandardfordiabetesmodeling.Aftermoulding,thebilingprescriptiongroupwasgiven10g/kg,indomethacingroup5mg/kgandpioglitazonegroup15mg/kg,whilethenormalgroupandmodelgroupweregivenequalsaline.After4days,thejointcavitywasinjectedwith5g/Lsodiumuricacidsolutiononcetoinducegoutmodel.Bloodoftheabdominalaortawastaken20dayslatertodeterminetheexpressionlevelsofbloodglucose,uricacid,PGE2andCOX-2.ResultsAftermodeling,theweightofeachgroupwaslowerthanthatofthenormalgroup(p<0.05orp<0.01).Aftertheadministration,theweightofpioglitazonegroupandbilingprescriptiongroupwashigherthanthatofthemodelgroup(p<0.05),andtherewasnosignificantchangeinindomethacingroup(p>0.05).Comparedwiththenormalgroup,PGE2andCOX-2inthemodelgroupweresignificantlyincreased(p<0.01).Afteradministration,theindexesofthedruggroupweresignificantlyreduced(p<0.01).Comparedwiththenormalgroup,bloodglucoseanduricacidinthemodelgroupweresignificantlyincreased(p<0.01).Afteradministration,bloodglucoseanduricacidinthezhenlinggroupandindolegroupweresignificantlydecreased(p<0.05orp<0.01).ConclusionBilingprescriptioncanhelptorecoverbodyweight,reducebloodglucoseanduricacidlevel,andsignificantlyinhibitthehighexpressionofPGE2andCOX-2.【Keywords】bilingprescription,diabeticgoutrats,weight,PGE2,COX-2随着人们生活水平的提高和饮食结构的改变，我国糖尿病和痛风的患病率逐年上升，严重影响人们的生活质量。两病的发生与高血脂、高血压、肥胖、遗传等原因息息相关，且两病之间可互相影响，互为危险因素［1］。前列腺素(prosta-glandins,pGs)是花生四烯酸(rachidonicacid)的代谢产物,它是炎症反应的重要介质。pGs能保护胃和十二指肠粘膜,维护肾及血小板功能,但也可诱发人和动物的急性炎症反应,其中前列腺素E2(prostaglandinE2,PGE2)起着更为重要的作用，它能使局部毛细血管扩张，血管通透性增加，组织充血水肿，还有使痛觉过敏和致痛作用［2-6］。环氧化酶(Cyclooxygenase，COX)是花生四烯酸转化为PGE2的关键酶，它包括两个亚型：环氧化酶-1(Cyclooxygenase，COX-1)，环氧化酶-2(Cyclooxygenase，COX-2)。COX-1是结构型酶，具有生理性保护功能，参与合成pGs,以调节外周血管阻力、保护胃粘膜、维持肾脏血流量及调节血小板聚集；COX-2为诱导型酶，存在于单核巨噬细胞、滑膜细胞、软骨细胞、成纤维细胞和内皮细胞等处［6-7］，正常的生理状态下几乎不表达或低表达，一旦受到刺激如组织损伤、炎症、癌基因、生长因子、细胞因子时表达迅速上调，参与多种病理生理过程［8］。本文旨在观察中药萆苓方对糖尿病痛风模型大鼠血清中PGE2、COX-2表达水平的影响，探讨萆苓方治疗糖尿病合并痛风的作用机制。1材料和方法1.1实验动物取清洁级健康SD雄性大鼠50只，体重180±20g，购自于安徽医科大学动物实验中心，许可证号scxk（皖）2017001。大鼠饮食、活动正常，皮毛光泽，反应灵敏。1.2主要药物与试剂萆苓方（由萆薢、土茯苓、泽泻、黄柏、苍术、怀牛膝、威灵仙、虎杖、薏苡仁、当归、土鳖虫等药物组成，安徽中医药大学第一附属医院药物制剂中心提供）；吲哚美辛片（上海新黄河制药有限公司，药准字号：H31020148，产品批号：01717004）；吡格列酮（江苏德源药业股份有限公司，批准文号:H20110048）；尿酸钠（上海源叶生物科技有限公司，批号：S16N8I46625）；吐温80（上海源叶生物科技有限公司，批号：M19A6K2526）；链脲佐菌素（STZ）（美国Sigma公司，批号：20160805426）；PGE2试剂盒（北京安迪华泰科技有限公司，批号：20180412）；COX-2试剂盒（北京安迪华泰科技有限公司，批号：20180412）。1.3主要仪器血糖监测仪（美国强生公司，型号：稳豪型）；酶标仪（雷杜公司型号：RT-6000）；高速台式冷冻离心机（安徽嘉文仪器装备有限公司，型号：JW3021HR）；漩涡混合器（其林贝尔仪器制造公司型号：GL-88B），移液器（Eppendorf公司型号：0.5-1000ul），排枪（Eppendorf公司型号：50-300ul），电热恒温箱（上海三发公司型号：DNP-9052BS-Ⅲ）。1.4糖尿病模型制作选取健康雄性SD大鼠45只，体重180±20g。适应性喂养1周后，按数字表法随机选出9只作为正常组，予基础饲料喂养，其余作为实验组，给予高脂饲料（蛋白质15%、脂肪20%、碳水化合物50%、胆固醇5%、猪油10%）喂养。4周后造模，造模前禁食不禁水12h，临用前将pH4.5的柠檬酸缓冲液与STZ配制成1%浓度的STZ溶液，模型组及各药物组按35mg/kg单次腹腔注射STZ溶液，正常组按此用量折算出相当量的生理盐水注射一次。72h后尾静脉取血测血糖，以血糖≥16.7mmol/l作为糖尿病成模的标准［9］，造模不成功者追加1/3STZ剂量。观察记录各组大鼠进食、饮水量、体重、精神状态、毛色等。1.5痛风关节模型制作糖尿病模型成功后，大鼠给药4天，第四天除正常组外，每只实验鼠均选右侧踝关节外后方为穿刺点，针口斜面朝前上方与胫骨成45度夹角穿入踝关节腔，以4号针头向关节腔注入0.2ml尿酸钠溶液（取250mg尿酸钠结晶，加入45ml0.9%氯化钠注射液，再加5ml吐温80，加热搅拌，配成5g/L的尿酸钠溶液）一次，以关节囊对侧鼓起为注入标准，诱导痛风模型。正常组注射等量生理盐水。1.6分组及给药将成模的实验组大鼠随机分为模型组、萆苓方组、吲哚美辛组、吡格列酮组，萆苓方组按10g/kg、吲哚美辛组按5mg/kg、吡格列酮组按15mg/kg给药，正常组、模型组予等量生理盐水，每日灌胃1次，连续3周。期间剔除未成模大鼠2只，因感染死亡大鼠3只。1.7观察指标大鼠连续给药3周，末次给药后禁食12小时，处死前称体重，以10%水合氯醛按3.5ml/kg腹腔注射麻醉，立即取腹主动脉血，送至安徽中医药大学第一附属医院生化室测定血糖、血尿酸、PGE2、COX-2。1.8统计方法实验数据采用SPSS21.0软件进行统计学处理，计量资料的数据用表示，两组比较采用t检验进行处理，组间比较采用方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义，并做相关性分析。2结果2.1对大鼠体重的影响表1结果提示：大鼠造模后，模型组、吡格组、萆苓组、吲哚组大鼠体重均低于正常组（P<0.05或P<0.01），治疗后3周，吡格组、萆苓组大鼠体重明显高于模型组（P<0.05），组间比较，萆苓组与吡格组疗效相近（P>0.05），吡格组疗效明显优于吲哚组（P<0.05）。表1对大鼠体重的影响（X±S）组别例数（只）造模前（g）疗后第1周（g）疗后第2周（g）疗后第3周（g）正常组9199.78+14.76209.89+13.36220.44+11.59229.56+10.89模型组9200.44+10.79190.33+12.43##178.11+11.33170.56+9.68吡格组9199.67+12.35196.33+12.29#192.56+13.86189.00+17.21*△萆苓组9200.67+12.47195.44+13.76#190.00+13.97184.44+15.13*吲哚组9201.11+12.34194.44+12.15#185.78+12.29174.22+11.29注：与正常组比较，#P<0.05，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05；与吲哚组比较，△P<0.05。2.2对大鼠血糖、血尿酸的影响表2结果提示：与正常组相比，模型组、各药物组大鼠血糖明显升高（P<0.01），与模型组相比，治疗后萆苓组、吡格组大鼠血糖明显降低（P<0.05或P<0.01），组间比较，萆苓组、吡格组疗效优于吲哚组（P<0.05）；与正常组相比，模型组血尿酸明显升高（P<0.01），与模型组比较，萆苓组、吲哚组大鼠血尿酸明显降低（P<0.01），组间比较，萆苓组、吲哚组疗效相近（P>0.05），且明显优于吡格组（P<0.01）。表2对大鼠血糖、血尿酸的影响（X±S）组别例数（只）疗前血糖（mmol/l）疗后血糖（mmol/l）血尿酸（umol/l）正常组95.72+0.975.76+0.8073.00+7.31模型组918.13+2.27##17.55+3.14144.25+25.35##吡格组916.45+3.72##12.71+2.18**△138.25+15.82萆苓组916.06+2.19##14.00+2.32*△92.86+17.25**△△吲哚组917.46+2.06##15.19+1.2890.88+22.04**△△注：与正常组比较，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01；组间比较，△P<0.05，△△P<0.01。2.3对大鼠PGE2、COX-2的影响表3结果提示：与正常组相比,模型组COX-2、PGE2的含量明显升高（P＜0.01），与模型组相比，各药物组COX-2、PGE2的含量明显降低（P＜0.01），组间比较，吲哚组与萆苓组COX-2、PGE2疗效相近（P＞0.05），优于吡格组（P<0.01）。表3对大鼠PGE2、COX-2的影响（X±S）组别例数（只）COX-2(ng/L)PGE2(ng/L)正常组959.86±4.6281.34±2.48模型组9145.72±12.35##324.16±20.10##萆苓组986.82±3.55**△145.69±10.33**△吡格组9107.18±10.93**199.86±16.12**吲哚组982.86±3.39**△142.09±14.69**△注：与正常组比较##P＜0.01；与模型组比较**P＜0.01；与吡格组比较，△P<0.052.4相关分析相关分析显示，高血糖与高血尿酸具有相关关系，相关系数r=0.346，（p<0.05）；高血糖与COX-2有显著相关性，相关系数r=0.634，（p<0.01）；高血糖与PGE2有显著相关性，相关系数r=0.652，（p<0.01）；高尿酸与COX-2的具有相关性，相关系数r=0.732，（p<0.01）；高尿酸与PGE2相关性，r=0.750，（p<0.01）；COX-2与PGE2具有显著相关性，r=0.945，（p<0.01）。3讨论有研究表明，糖尿病和痛风有共同的发病基础，血尿酸增高可加重糖尿病患者的代谢紊乱［10］，痛风合并糖尿病患者的血尿酸水平也比单纯痛风患者更高［11］。因此，能够同时改善高血糖与高血尿酸水平的药物，对于提高疗效，改善患者依从性，具有重要意义。本实验正是探讨了中药萆苓方对于血糖、血尿酸及PGE2、COX-2的影响。前列腺素E2（PGE2）是一种重要的炎症介质，当细胞膜上磷磷脂酶A2(phoshPolipaseA2)受到致炎因子等某种因素的刺激时,释放花生四烯酸，在环氧化酶的作用下产生，其大量生成可引起并加重一系列炎症反应，促使局部毛细血管扩张，血管通透性增加，组织充血水肿，加重疼痛［2-6］，还可导致胰岛β细胞的功能障碍［12］，影响胰岛素的分泌。本次实验显示，模型组PGE2的含量明显升高（P＜0.01），药物治疗后，萆苓组PGE2的含量明显降低（P＜0.01）。表明萆苓方可通过降低PGE2的水平，减轻炎症反应，缓解糖尿病痛风的临床症状，降低血糖、血尿酸水平。环氧化酶-2(Cyclooxygenase，COX-2)是环氧化酶的一个亚型，在正常状态下几乎不表达，一旦受到刺激如外伤、炎症后迅速合成，增加血管通透性，产生炎性因子，诱导巨噬细胞趋化，激活基质金属蛋白酶，活化白细胞和血小板，且能降低人体对胰岛素的敏感性。另一方面，COX-2作为PGE2的限速酶，与PGE2有交互作用，它催化花生四烯酸转化为PGE2，诱导炎性反应，抑制胰岛β细胞的功能。本次实验表明，模型组COX-2的表达明显升高（P＜0.01），给药后，萆苓组COX-2的含量明显降低（P＜0.01）。说明萆苓方可通过抑制COX-2的高表达，缓解炎症反应，改善胰岛功能，达到降糖降尿酸的作用。此可能是萆苓方降糖降尿酸的机制之一。实验中我们采用链脲佐菌素诱导糖尿病模型，成模后各实验组大鼠较正常组大鼠出现明显多饮、多食、多尿症状，且体重明显低于正常组（P<0.05或P<0.01）。药物治疗后3周，吡格组、萆苓组大鼠“三多”症状改善，体重明显高于模型组（P<0.05）。说明萆苓方可明显改善糖尿病的临床症状。对血糖的影响与我们以往的报道一致，萆苓方有良好降糖降尿酸作用。可一箭双雕，多靶点发挥降糖降尿酸抗炎作用。相关分析显示，高血糖与高血尿酸具有相关关系，表明二者之间相互影响，互为危险因素。与COX-2、PGE2有显著相关性，证实高血糖、高血尿酸均与炎症因子有关，COX-2及PGE2参与其中，互为因果，加重了对机体的损害。糖尿病属中医“消渴”范畴，痛风属中医“痹病”、“白虎历节”范畴，其发病多与感受外邪、饮食不节、遗传等因素有关，其病机为本虚标实，本虚乃脾肾亏虚，脏腑功能衰弱，标实为湿瘀毒互结，阻滞气血经络。萆苓方正是以清热利湿，泻浊解毒，活血止痛立法。方中土茯苓、泽泻、萆薢、薏苡仁利湿泻浊；威灵仙祛风湿，通经络；黄柏、苍术清热燥湿解毒；当归、虎杖、土鳖虫活血止痛；怀牛膝补肝肾，强筋骨，利关节。现代医学研究发现，萆薢主要成分为萆薢皂苷A有降低血尿酸的作用，和牛膝总皂苷合用可明显降低PGE2的水平，通过抑制炎性细胞因子的合成达到较强的抗炎作用［13］。土茯苓能够抑制细胞免疫反应，影响T淋巴细胞释放淋巴因子以后的炎症过程，还具有利尿和镇痛作用［14］。虎杖含有虎杖苷、藜芦醇、大黄素等成分，可降低血清中PGE2的水平，抑制促炎因子转录以及蛋白质的合成作用［15］。薏苡仁、茯苓、泽泻有利尿、降血糖、调节免疫之功能［16-17］。威灵仙总皂苷可通过抑制T淋巴细胞过度增殖、抑制细胞因子和PGE2发挥抗关节炎作用［18］。黄柏、当归、苍术可通过对氧自由基以及炎症部位的PGE2的清除达到抗炎镇痛作用［19］。土鳖虫有一定程度的血管内皮细胞保护作用，对糖尿病周围神经病变有干预作用［20］。综上所述，本方通过降低COX-2、PGE2的高表达，消除炎症反应，保护胰岛功能，发挥良好的调节血糖、血尿酸、改善糖尿病痛风症状的作用。参考文献［1］于健.糖尿病合并痛风患者胰岛素抵抗的临床研究[J].华西医大学报，2002，33(3）:486-487.［2］丁皓.前列腺素与炎症[J].中国病理生理杂志，1987,3（1）：47-51.［3］任公平，那辉，佟雷，等.辣椒素通过下调COX-2和mpges-1抑制IL-1β诱导的NCI-H460细胞PGE2含量的实验研究[J].西安交通大学学报(医学版),2016,37(2):283-306.［4］刘莹露,吴薇,徐天舒.胆宁片对胆色素结石型豚鼠胆汁CRP、血清PGE2及血清胰岛素敏感性的影响[J].西部中医药,2017,30(11):18-21.［5］寇毅英，李永芳，杨梅，等.十五味乳鹏散对尿酸钠致大鼠急性痛风性膝关节炎COX-2，PGE2水平的影响[J].中国实验方剂学杂志,2016,22(1):117-120.［6］张娟,汪志军,胡亚楠，等.环氧化酶——药物开发的新靶点[J].药学进展,2002,26(5):