分子印迹技术在中药活性成分提取纯化中的应用进展

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引言分子印迹技术（molecularlyimprintingtechnology，MIT）是一种制备对目标分子具有特异性识别和结合能力的聚合物的技术。由于制备的分子印迹聚合物具有选择性高、物理和化学稳定性好、使用寿命长等优点，被广泛应用于手性分离和底物选择性分离、色谱分离、固相萃取、药物分析、化学或生物传感器以及模拟酶催化、控释药物等方面。中药活性成分结构复杂、类型多样，加上含量低、性质不稳定，导致了中药活性成分分离纯化困难。目前中药活性成分的分离纯化主要依赖于硅胶柱色谱、大孔吸附树脂柱色谱、聚酰胺柱色谱、凝胶柱色谱、高效逆流色谱、制备型高效液相色谱等色谱技术，不仅溶剂消耗量大、环境污染严重，而且效率和收率也较低。分子印迹技术与上述色谱分离技术相比，其具有许多独特的优点：分子选择性强，溶剂消耗量小，模板和分子印迹聚合物（molecularimprintedpolymer，MIP）可以回收再利用，从而降低MIP的生产成本。因此，利用分子印迹技术对中药活性物质进行分离富集越来越被研究者所重视。

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分子印迹技术概述1.1

基本原理首先，模板（即印迹分子）与功能单体通过共价或非共价作用在溶剂中形成复合物后，通过引发剂引发，得到高度交联的聚合物。然后，通过物理或化学（如洗脱、水解等）方法除去模板，聚合物主体上就形成了与模板空间、功能基排列相匹配的具有多重作用位点的孔穴。这种孔穴对模板及与模板结构相似的分子具有特异性结合能力。1.2

分子印迹聚合物（MIP）的制备目前制备分子印迹聚合物的方法根据功能单体与模板的结合方式不同可分为三种。1.2.1

共价键法功能单体与模板以共价键作用形成复合物，结合形式主要有硼酸酯、西佛碱、缩醛（酮）、酯、螯合键作用等。该方法的优点是MIP的识别位点均匀，选择性高；缺点是能印迹的模板分子有限，且由于共价键作用强，因此脱去模板分子也较为困难，在印迹和再识别过程中，模板和功能单体之间的结合和解离速度较慢，难以满足快速分离的要求。1.2.2

非共价键法功能单体与模板以非共价键作用形成复合物，结合形式主要有氢键、静电引力、疏水作用、离子键、金属配位键等。非共价键法的优点是制备过程简单，识别速度快，模板分子易去除，其识别过程更接近天然的分子识别系统；缺点是结合位点不均匀，常导致非特异性结合，易造成峰展宽和拖尾，且由于非共价键作用弱，因此强烈依赖于溶剂的极性，难以在水中制备MIP。但由于其适用性广，目前MIP的制备多数采用这种方式。1.2.3

空间牺牲法空间牺牲法也叫半共价法，将共价键法与非共价键法加以综合，即聚合时功能单体与模板的作用力是共价的，而在识别过程中是非共价的。其优点是功能单体和模板分子的结合和解离速度较快，适于快速识别；缺点是去除模板分子较困难，印迹和再识别时的位点有所不同，使得分子选择性有所降低。1.3

功能单体的选择由于所制备的分子印迹聚合物主要通过基体内与模板分子相匹配的三维孔穴进行识别，而该孔穴主要由功能单体与模板分子聚合再脱去模板分子而形成。因此，选择合适的功能单体及功能单体与模板分子的比例，对于成功制备对模板分子具有特异性识别能力的分子印迹聚合物至关重要。比如：当模板分子中含有氨基、脂肪醇、脂肪胺等基团时，可选择甲基丙烯酸、酰胺类和吡啶类功能单体；当模板分子中含有羧酸或氨基、酰胺基时，可选择丙烯酰胺（AM）作为功能单体。目前，选择功能单体较为成熟和可行的方法有紫外光谱法、荧光光谱法、氢核磁共振波谱法以及计算机模拟计算法。其中，紫外光谱法由于仪器设备价格低廉、简单方便、灵敏度较高、易于推广等优势获得了较大的认可。利用紫外光谱法选择制备了大叶茜草素分子印迹聚合物的功能单体及其比例，最终选择甲基丙烯酸为功能单体，功能单体与模板分子比例为4:1。提出了一种简单的分子印迹方法：仅利用N,O-双异丁烯酰乙醇胺（NOBE）作为功能单体制得的印迹聚合物比使用混合功能单体（比如NOBE和甲基丙烯酸）制得的印迹聚合物具有更高的选择性。

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分子印迹技术在中药活性成分分离纯化中的应用2.1

生物碱生物碱是一种来源于生物中含氮的有机化合物，植物中存在的生物碱大多有明显的生理活性。2.1.1

分离奎宁采用多孔醋酸纤维膜为支撑体，制备了奎宁分子印迹复合膜，奎宁在该复合膜上的结合量达到20.6μmol/g，奎宁/辛可宁的分离因子为5.6。以二硫代四乙基秋兰姆（TED）为链转移试剂，采用活性/可控自由基聚合并结合沉淀聚合法制备均匀球形的奎宁分子印迹聚合物，该印迹微球对模板分子具有良好的特异识别性能，与传统沉淀聚合法相比，其聚合物粒径增大，分子结合选择性提高。2.1.2

分离长春碱采用均匀设计法，以对模板分子长春碱（VLB）的吸附率为评价指标，考察了功能单体甲基丙烯酸（MAA）的用量、交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA）的用量以及致孔剂（溶剂）等因素。在实验最优条件下制得长春碱分子印迹聚合物，对长春碱的吸附率为88.2%。2.1.3

分离盐酸黄连素以硅胶为牺牲载体，甲基丙烯酸（MAA）为功能单体制备了盐酸黄连素印迹聚合物微球，并对其吸附等温线进行了Scatchard分析，发现分子印迹聚合物具有两类不同亲和能力的吸附位点，其高亲和位点的平衡离解常数为2.350×10-5

mol/L，最大吸附量为17.410μmol/g。2.1.4

检测吗啡基于MWCNT/Titania/Nafion复合膜将联吡啶钌固定在电极表面，得到固相发光电极，然后再修饰一层选择性印迹膜，从而制备了一种测定吗啡的新型ECL-MIP传感器，该传感器对溶液中的吗啡分子具有很高的检测灵敏度，线性范围达1.0×10-9～1.0×10-6

mol/L，检测限可达2.0×10-10

mol/L，并且具有良好的稳定性及再生能力，有望成为一种灵敏快速、选择性高、再生性好的吗啡分析新方法。2.2

黄酮黄酮是目前应用分子印迹技术分离纯化最多的天然活性物质。2.2.1

检测芦丁在金电极表面滴涂石墨烯（GR），通过电沉积技术沉积纳米金（Au）构成石墨烯-纳米金修饰电极（Au-GR/GE），并以芦丁为模板分子，邻氨基酚为功能单体，通过电聚合反应在Au-GR/GE表面合成一种对芦丁具有特异性识别能力的分子印迹传感器膜。在最佳实验条件下，其对芦丁浓度的定量测定线性范围为6.30×10-7～1.70×10-4

mol/L，检出限为2.10×10-7

mol/L。2.2.2

分离儿茶素以γ-氨丙基三乙氧基硅烷修饰的硅胶为载体、表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）为模板分子、甲基丙烯酸为功能单体，制备了EGCG-硅胶表面分子印迹聚合物（SMIP），以pH值为6的去离子水为溶剂，发现在25℃下SMIP对EGCG的吸附效果最佳，其吸附符合Langmuir等温吸附模型，吸附动力学符合假一级和假二级吸附速率方程。在此基础上采用分子印迹-固相萃取分离EGCG及其结构类似物，结果显示：MIPs对EGCG的选择性系数分别是其结构相似物EGC、C、EC、GCG和ECG的13、26、12、9和11倍，可用于分离富集实际样品中的EGCG。以EGCG为模板分子、α-甲基丙烯酸为功能单体，在光冷引发条件下合成EGCG分子印迹聚合物，利用该聚合物制成分子印迹-固相萃取柱，用于固相萃取茶叶提取物茶多酚，EGCG的回收率达69.3%，且该分子印迹柱具有较好的稳定性和耐用性能，使用20次后其选择性识别能力仍未降低。以儿茶素EC为模板、甲基丙烯酸（MAA）为功能单体，采用紫外聚合方法合成分子印迹聚合物（EC-MIPs），并制备了分子印迹聚合物填充固相萃取柱（EC-MIPs-SPE），配合电喷雾质谱法检测茶叶中多种儿茶素含量，结果表明：经过EC-MIPs-SPE法预富集，可以去除94.2%的咖啡因和全部茶碱的干扰，同时可得到4个主要儿茶素信号，其相对强度分别为：EC12.1%、EGC8.2%、ECG35.4%、EGCG45.7%，该法可用于茶叶中微量儿茶素的分离鉴定。2.2.3

分离槲皮素在2009年制备了槲皮素-Zn（Ⅱ）金属配位分子印迹聚合物，对槲皮素-Zn（Ⅱ）的配合物表现出明显的吸附选择性，而对槲皮素结构类似物芦丁和柚皮素的吸附选择性较差。2011年，他们再以槲皮素-铜（Ⅱ）配合物为模板分子、n-甲基丙烯酸为功能单体，在强极性溶剂甲醇中合成槲皮素-铜（Ⅱ）金属配位分子印迹聚合物，对槲皮素-铜（Ⅱ）配合物的最大结合量达到61.09μmol/g，同时该印迹聚合物具有优良的洗脱与再生性能。2012年，他们又分别采用低温光引发和高温热引发聚合制备槲皮素-钴（Ⅱ）金属配位印迹聚合物，考察了不同引发方式对聚合物的结构、微观形貌及结合性能的影响。结果表明：低温光引发的金属配位分子印迹聚合物具有良好的吸附选择性。2013年，他们以电子束为辐照射线源，采用辐射聚合法成功制备了槲皮素-Ni（Ⅱ）金属配位分子印迹聚合物，通过紫外光谱法验证了槲皮素、Ni（Ⅱ）及功能单体甲基丙烯酸三者发生了金属配位印迹作用。采用可逆加成-断裂链转移（RAFT）活性/可控自由基聚合法，制备了槲皮素印迹聚合物。与传统自由基聚合法相比，采用RAFT自由基聚合法得到的聚合物吸附效率更高。将合成的槲皮素印迹聚合物应用于维药祖卡木颗粒成分分析，得到了较好的分离富集效果。以聚偏氟乙烯微孔滤膜为支撑膜，制备了以槲皮素配合物为模板的锌离子配位分子印迹聚合物膜，该复合膜能够根据底物分子体积大小以及其官能团选择性识别印迹分子，对槲皮素具有很高的选择性。在碳纳米管（CNT）独特的结构和力学性能作用下，以吡咯为功能单体、槲皮素为模板分子，采用电聚合方法制备了槲皮素的分子印迹聚合物膜修饰电极（PPy/CNT/GCEMIP），该修饰电极能显著提高槲皮素的氧化峰电流，降低氧化峰电位，并可在与其结构相似的桑色素等黄酮类物质的存在下，实现对槲皮素的选择性测定。以重氮甲烷为修饰剂，对合成的槲皮素分子印迹聚合物（MIP）的结合点进行了选择性修饰。结果表明：选择性修饰能明显提高MIP的识别能力与吸附速度，以柚皮素为竞争分子，分离因子可从修饰前的1.60提高到修饰后的3.06，吸附平衡时间从修饰前的100min减少至修饰后的60min。2.2.4

分离木犀草素以木犀草素为模板分子、丙烯酰胺为功能单体、EGDMA为交联剂，合成了木犀草素印迹聚合物，并将该印迹聚合物用于固相萃取，分离提取了花生壳中的木犀草素，得到的木犀草素纯度高出硅胶柱分离近20个百分点，达到96.2%，且MIPs-SPE柱经过洗脱再生后可以反复使用多次。2.2.5

分离黄芩苷以介孔分子筛MCM-41为基质、黄芩苷（BA）为模板分子，采用热聚合法合成黄芩苷的表面分子印迹聚合物，并对其形态和结构进行表征，表明合成的黄芩苷表面分子印迹聚合物仍然保留了MCM-41的介孔结构，并且对黄芩苷具有良好的吸附能力。2.2.6

分离葛根素以葛根素为模板分子、丙烯酰胺或甲基丙烯酸为功能单体，合成了葛根素印迹聚合物，并使用量子化学的方法对模板分子与功能单体的结合构象进行了计算机模拟，然后将合成的分子印迹聚合物填充于固相萃取柱中，用于葛根提取液中葛根素的分离纯化。结果表明：该分子印迹聚合物对葛根素具有高度的选择性。2.3

甾体目前对甾体的研究主要集中在人参皂苷。由于其相对分子质量与极性较大，选择的致孔剂极性亦较大，易影响聚合物制备过程中模板分子与功能单体之间氢键的形成，从而导致MIP制备难度较大。分别采用沉淀聚合法和表面印迹法制备了Rg1分子印迹聚合物，发现表面印迹法制备的聚合物吸附性要明显高于沉淀聚合法制备的聚合物，其最大表观吸附量分别是46.80mg/g、27.74mg/g。以人参皂苷Re作为模板分子、甲基丙烯酸为功能单体，原位热引发聚合制备了人参皂苷Re分子印迹整体柱，表现出对Re的特异性吸附性能，分离因子为1.769，吸附遵循反Langmuir型等温线模型，饱和吸附量为0.247mg/g。2.4

萜类2.4.1

分离青蒿素以青蒿素为模板分子、丙烯酰胺为功能单体，制得分子印迹聚合物。Scatchard模型分析表明，该分子印迹聚合物在识别青蒿素分子的过程中存在两类不同的结合位点：高亲和力结合位点和低亲和力结合位点的离解常数分别为1.87mmol/L、48.5mmol/L，最大表观结合常数分别为27.99

μmol/g、334.4μmol/g。2.4.2

分离芍药苷采用溶胶-凝胶法合成了以芍药苷为模板分子的分子印迹聚合物，并将印迹层接枝到二氧化硅微珠的表面，填充至玻璃层析柱中，利用该分子印迹聚合物从4g桂枝茯苓胶囊甲醇溶液中制得芍药苷及其结构类似物197mg，芍药苷纯度达89.3%。2.5

香豆素对载体膜种类、引发剂与交联剂用量以及载体膜在预聚合溶液中的浸泡时间进行优化，最终确定聚偏氟乙烯（PDVF）为载体膜、甲基丙烯酸（MAA）为功能单体、乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA）为交联剂，固定模板、单体及交联剂的加入量比为1:4:8，在乙腈中用AIBN引发聚合反应，制备了一种对香豆素具有良好吸附作用的分子印迹复合膜，其吸附容量达0.151

8mmol/g，印迹因子是2.09；并探讨了在浓度差驱动下膜的传质机制是溶解-扩散机理，且从桂枝甲醇粗提液中提取分离香豆素的回收率达到了89.6%。

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结语2016年，中药大健康产业规模已突破万亿元，战略性地位日益凸显，而中药发展所面临的质量和资源方面的困境，也亟待突破。因此，寻找高效率、低