两性霉素B发酵染菌的原因分析及降低染菌率的措施

摘

要：从两性霉素B的发酵工艺入手，介绍了两性霉素B的发酵工艺流程和设备流程，通过分析可能造成发酵染菌的原因，结合实际情况，确定了发酵染菌的主要原因，并制定了相应的控制措施，改进后的染菌情况大为改观。关键词：两性霉素B；发酵染菌；原因；染菌率；措施

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引言虽然两性霉素B是含37个碳原子组成的大环内酯乳糖七烯类的抗生素，是治疗全身性深度真菌感染的唯一有效药物，但其副作用大、毒性大，而两性霉素B脂质体能有效弥补这一缺陷。作为两性霉素B脂质体的原料来源——两性霉素B，采用生物合成法（微生物发酵法）生产，利用两性霉素B的产生菌，在一定的条件（包括培养基、温度、pH、通气、搅拌等）下使其生长繁殖，并在代谢过程中产生两性霉素B，再用溶媒结晶法将两性霉素B从发酵液中提取出来，加以精制，最后获得两性霉素B成品。两性霉素B的生产工艺（菌种→孢子制备→种子制备→发酵）属于发酵生产工艺。然而，发酵生产工艺要求，除大量繁殖两性霉素B的产生菌外，不允许其他杂菌（即染菌）的生长。染菌不仅消耗培养基中的营养成分，还会分泌某些对产生菌有毒性或者能使两性霉素B失去活性的物质。同时，降低两性霉素B的发酵单位，严重时会导致“倒罐”，即发酵过程中出现了较为严重的染菌现象，意味着发酵失败。因此，防止染菌，降低染菌率是发酵生产中一项长期、重要的工作。本文从多方面入手，分析可能造成两性霉素B发酵染菌的原因，并通过制定相应的措施，降低染菌率。

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发酵生产简介1.1

工艺流程两性霉素B的发酵工艺流程如图1所示。1.2

设备流程两性霉素B的发酵设备流程如图2所示。1.3

关键工艺简述将节状链霉菌（Str.nodosus）培育至生产菌株，需经种子阶段、发酵阶段的通气培养，培养基由葡萄糖等原料作为碳源、酵母粉等原料作为氮源，并添加微量元素，整个培养繁殖过程应保持严格的纯种状态。在整个发酵过程中，需全程进行杂菌试验，以此来判断发酵过程是否染菌。通过观察菌种外观、镜检等手段来判断从一级发酵进入二级发酵（移种）的时机。两性霉素B经过发酵周期后，发酵液经酸化过滤，收集滤饼（两性霉素B菌丝体）。

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染菌事件的调查在两性霉素B发酵生产中发生了染菌事件，通过调查发现，其均为二级发酵间歇染菌，调查结果如表1所示，染菌情况严重，造成发酵效价低，过滤困难，只能作“倒罐”处理。注：（1）J表示正常，无染菌；L表示已染菌；（2）染菌率=染菌批次/总批次×100%。从表1可以看出：12批两性霉素B发酵的染菌率为50%，染菌情况严峻。

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染菌原因分析及要因确认两性霉素B发酵生产中的染菌原因分析及要因确认如表2所示。在两性霉素B发酵生产的染菌事故调查中，经过染菌原因分析及要因确认后，汇总并制成染菌原因鱼刺分析图，如图3所示。

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采取的控制措施根据两性霉素B的染菌原因鱼刺分析图，针对引发染菌的主要原因，制定相应的控制措施，如表3所示。4.1

空气系统中水分过多总空气过滤器的失效多数是由空气系统中水分过多造成，若不能有效除湿，过滤介质极易失效，引起污染。针对这一情况，应落实专人负责空气系统的管理，定期检查，定时消毒，及时放出冷凝水，并对空气在进入总过滤器之前加热升温，使得相对湿度下降，然后进入总空气过滤器除菌，尽可能减少空气系统中的水分。4.2

罐体渗漏对发酵罐进行大范围检修，在罐体内电焊捉漏，检查夹套是否腐蚀穿孔，检查管道和连接部件安装是否合理；对罐壁、电焊缝渗漏处作相应处理，严密堵漏。4.3

罐内设计不合理（1）针对空气分布口偏高，影响发酵液吸收溶氧的情况，应降低空气分布板位置，使分布口高度适宜，使发酵液有效吸收溶氧。（2）针对罐内出料管道口距罐底距离过大，影响发酵罐清洗，从而造成发酵罐染菌的情况，应把原来高度在100mm左右出料的管道口改为基本接近罐底。（3）针对排汽管道细，排汽不流畅，出现死角的情况，应清理旋风器，增加排汽出口，减少排汽死角。4.4

蒸汽供应压力低或不稳定蒸汽供应的压力稳定是保证发酵系统有效灭菌的基础。若蒸汽压力不稳定，就会因为灭菌不彻底造成污染；若蒸汽压力低，就会造成灭菌时间长，进而破坏培养基。一般蒸汽由动力车间供应，因此，应保证足够压力的饱和蒸汽及其稳定性。4.5

灭菌操作不到位（1）为了提高相关操作人员的素质，应对操作人员进行SOP教育培训，并进行考核；（2）强化管理，严格要求员工按照岗位SOP操作，认真控制预热温度、罐温及维持罐内培养基温度，严格控制进料流量，保证灭菌质量；（3）抽查操作人员的工作情况，并与工资、奖金挂钩。4.6

工艺弱点针对消毒时液面高的现象，可提高某培养基使用比例，降低另一培养基使用比例，使消毒液面得以有效控制。

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效果检查与对比在针对两性霉素B的染菌主因，制定并落实了相应的控制措施后，染菌情况大为改观，染菌率直线下降，具体效果如表4所示。图4为改进前后两性霉素B的平均效价对比，图5为改进前后两性霉素B的染菌率对比。注：（1）J表示正常，无染菌；L表示已染菌；（2）染菌率=染菌批次/总批次×100%。从表4可以看出：12批两性霉素B发酵的染菌率为8.33%，染菌问题大有改观。

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结语本文从两性霉素B的发酵工艺入手，介绍了两性霉素B的发酵工艺流程和设备流程，通过分析可能造成发酵染菌的原因，结合实际情况，确定了发酵染菌的主要原因，并制定了相应的控制措施，改进后的染菌情况大为改观。同时，建议采取以下