组培苗培养与管理（植物组织培养课件）

组培苗培养与管理组培苗的培养组培苗驯化与移栽【知识点】组培易发问题的原因与调控措施组培苗培养条件，组培苗的特点，组培苗驯化方法【技能点】能解决组培易发问题，培养健壮组培苗会进行组培苗移栽养护素质要求：培养学生无菌意识、创新意识、团队合作意识和生态环保意识；具有任务执行力，规范操作、注意安全；科学严谨、实事求是的工作态度。组培苗的培养一、组培苗培养1、培养程序1）初代培养指在组培过程中，最初建立的外植体无菌培养阶段，即无菌接种完成后，外植体在适宜的光、温、气等条件下被诱导成无菌短枝（或称茎梢）、不定芽（丛生芽）、胚状体或原球茎的过程。也称为诱导培养。

由于外植体来源复杂，又携带较多的杂菌，初代培养一般是比较困难的，是植物组培成功的关键技术之一。2）继代培养将初代培养诱导产生的愈伤组织、芽、苗、胚状体或原球茎等重新分割，接种到新配制的培养基上，进一步增殖扩繁的培养过程称为继代培养，也称增殖培养。

通过初代培养多获得的不定芽、无菌短枝、胚状体或原球茎等无菌材料被称为中间繁殖体。中间繁殖体可以按几何系数扩繁。例如：2株苗为基础，每棵苗的繁殖系数为3（即一株苗剪成3段接种，培养一段时间后每段又形成3株苗），那么经过10代繁殖，将生成多少株苗？2×310=1180963）壮苗与生根壮苗培养生根培养：NAA和IBA是最常用于诱导生根的生长素，使用浓度一般为0.1-10.0mg/L。2、组培苗培养条件1）温度：培养室内的温度通常是控制在25±2℃。2）光照：植物所需的光照强度为1000-5000lx，培养室每日光照10-16h。3）湿度：容器内的湿度常可保持在100%，培养室的相对湿度一般应保持在70%--80%之间。4）通气：在固体培养中，不要把培养物全部埋入培养基内，以避免氧气不足。

培养室要适当通风换气，改善室内的通气状况，每次通风后要进行一次消毒，避免引起培养物污染。1.试管苗培养条件。2.培养程序。小结啊？？二、组培污染的原因及防治组培常见问题1、培养基污染来源与防治（1）培养基污染可能的来源培养容器操作器械接种室的环境操作者本人培养室的环境外植体培养基本身污染的病原分为细菌和真菌两大类（2）细菌污染原因分析材料带菌培养基灭菌不彻底操作人员的不慎使用了未经充分灭菌的工具（镊子、培养皿等）手接触材料或器皿边缘，使微生物落入材料或器皿防治：1、接种前，洗手，用70%酒精棉球擦拭双手；戴口罩，不说话，防止呼吸时呼出的细菌所引起；每接一瓶材料后用酒精擦手指。防治：2、提高外植体灭菌技术，选取带菌少的材料，微生物少的季节和时间。3、每个培养周期不宜过长。4、培养瓶容器的封口类型。防治：5、接种用的工具每接一瓶至少要灼烧灭菌一次。6、凡是污染材料，均要高压蒸汽灭菌，或用70%酒精杀菌，降低污染源。（2）真菌污染原因分析接种室的空气本身不洁净、灰尘很多超净工作台的过滤装置失效培养用器皿的口径过大操作不慎等原因引起防治：1、无菌室内安装空气循环过滤装置，通过紫外线照射灭菌。2、超净工作台提前开机20min以达到空气的充分过滤灭菌。3、接种，用70%酒精棉球擦拭双手，戴口罩，不聊天；每接一瓶后用酒精擦手指。4、接种时要严格操作，接种工具要烧红，不碰触任何物品，打开瓶盖时动作要轻及去掉瓶塞后瓶子应拿成斜角等。5、培养瓶容器的封口类型。6、每个培养周期不宜过长。7、凡是污染材料先高原蒸汽灭菌，或用70%酒精杀菌，降低污染源。8、培养室安装净化设备，并勤开紫外灯灭菌，以及酒精喷雾和冰醋酸熏蒸灭菌。

提问针对操作流程：外植体取材——预处理——消毒——接种——组培苗培养与管理，分析每个步骤引起的污染源2、培养常见问题及对策1）污染所谓污染是指在组织培养过程中，有细菌、真菌等微生物的侵染，在培养基的表面滋生大量菌斑，造成培养材料不能生长和发育的现象。（1）污染识别若污染菌类是零星分散在培养基中，则可确定是人为引起的污染。若从培养基以下开始长菌，发生时间较早，且有从里向外的趋势，则说明是切口引起的污染。若是外植体带菌，菌类从材料的培养基以上部位长起，且发生在5天以后，则说明是材料带的内生菌。（2）来源材料表面消毒不彻底，植物材料带入培养过程。植物内生菌随材料带入培养过程。无菌操作过程中外界环境进入培养容器造成。（3）种类细菌性污染：培养基某一位置或培养材料周围出现黏液状或浑浊的水渍状痕，有时呈现发酵状泡沫。接种后1-2天可见。真菌性污染：培养基污染部位发霉，颜色黝黑、白、黄等。接种后3-5天或更长时间出现。（4）污染的防止选择合适的植物材料：幼嫩材料、温室材料、清洁材料、草本材料、中午阳光最强时的材料带菌少。严格灭菌：对难灭菌材料采用多次灭菌法，对材料内部的细菌，可在培养基中添加抗生素来解决。污染的防止合理安排繁殖程序：将获得的无菌培养物一部分保存起来，分批繁殖和复检后再提供给大规模生产。操作规范：培养室要求清洁、密闭、接种室要经常用紫外线照射、冰乙酸熏蒸、70%酒精喷雾杀菌等。2）褐变褐变（又称褐化）是指培养材料向培养基释放褐色物质，致使培养基逐渐变褐，培养材料也随之变褐，甚至死亡的现象。（1）成因切割外植体时，体内的多酚氧化酶被激活，使细胞里的酚类物质氧化成棕褐色的醌类物质，当扩散到培养基后，会抑制其他酶的活性，从而影响所接种外植体的培养。（2）影响褐变的因素基因型：褐变和品种有关，在多酚氧化酶活性上的差异，对不同的品种分别进行处理。生理状态：褐变程度的轻重常与取样外植体组织的生理状态有关；处于幼龄期的植物材料或幼嫩的组织褐变程度不明显，而从成年的植株或老熟的组织采收的外植体，含醌类物质较多，容易褐变。培养基成分：无机盐浓度过高，会使某些观赏植物的褐变程度增加；细胞分裂素的水平过高会刺激某些外植体的多酚氧化酶的活性，从而使褐变现象加深。外植体大小：材料太小，在培养过程中容易褐变。外植体组织的受伤程度：在取材料时，应尽量减少伤口面积，创伤面要尽量平整。影响褐变的因素培养材料的继代时间：培养过程中，如果推迟继代时间，会导致材料的褐变，最终材料全部死亡。灭菌的化学药品：杨树叶片作外植体，用70%乙醇时间处理过长，容易褐变。温度和光照：光照国强、温度过高、培养时间过长等，均可使多酚氧化酶的活性提高，加速培养物的褐变程度。(3)克服外植体褐变的方法适合外植体和培养条件：选择生长处于旺盛的外植体，可使褐变现象明显减轻。无机盐成分，植物生长物质水平，适宜温度均可以减轻材料的褐变现象。连续转移（继代培养）：对容易褐变的材料可连续继代培养，减轻醌类物质对外植体的毒害。加入抗氧化剂：使用半胱氨酸，抗坏血酸、PVP等抗氧化剂能够较为有效地避免或减轻褐变现象。另外，使用0.1-0.5%的活性炭对防止褐变也有较为明显的效果。3）试管苗玻璃化当植物材料不断地进行离体繁殖时，有些培养物的嫩茎、叶片往往会呈半透明水渍状，这种现象通常称为玻璃化（也称为超水化现象）。发生玻璃化的试管苗称为玻璃化苗。（1）特点形态解剖学特点：整株矮小肿胀、失绿；叶片皱缩成纵向卷曲、脆弱易碎；叶表缺少角质层蜡质，没有功能性气孔，不具栅栏组织，仅有海绵组织。生理生化特点：玻璃化苗体内含水量与可溶性糖含量高，但干物质、叶绿素、蛋白质、纤维素和木质素含量低。(2)玻璃苗的危害呈现玻璃化的试管苗，其茎、叶表面无蜡质，体内的极性化合物水平较高，细胞持水力差，植株蒸腾作用强，无法进行正常移栽。玻璃庙生长缓慢、繁殖系数下降，如果再在相同的培养基上和相同的培养条件下进行继代培养后死亡。玻璃苗生根困难。（3）控制和克服玻璃化的措施使用固体培养基：增加琼脂浓度，降低培养基水势，造成细胞吸水阻遏；提高琼脂纯度，也可降低玻璃化。适当降低培养基中细胞分裂素和赤霉素的浓度。提高光照强度，玻璃苗放于自然光下几天后茎、叶变红，玻璃化逐渐消失，因自然光中的紫外线能促进试管苗成熟，加快木质化。使用透气性好的封口材料，改善氧气的供应状况，降低培养容器内部环境的相机湿度。（3）控制和克服玻璃化的措施培养基中加入间苯三酚或根皮苷、青霉素钾、活性炭、聚乙烯醇（PVA）均可有效抑制玻璃苗的发生。青霉素G钾（2-6mg/L）能有效防治菊花试管苗的玻璃化。改变供氮形态，降低铵态氮浓度，提高硝态氮含量，及时转移，减少氨积累。提高培养基中无机盐含量，增加培养基中\Ga\Mg\Mn\K\P\Fe\Gu元素含量，降低N和Cl元素比例。5、其他问题：还有黄化、变异、瘦弱或徒长、不生根或生根率低、移栽成活率低、材料死亡、增殖率低或过盛等问题。1.什么是褐变？2.什么是污染？3.什么是试管苗玻璃化？习题组培苗培养与管理组培苗的培养组培苗驯化与移栽【知识点】掌握组培苗驯化与移栽方法

【技能点】能驯化管理移栽苗素质要求：培养学生无菌意识、创新意识、团队合作意识和生态环保意识；具有任务执行力，规范操作、注意安全；科学严谨、实事求是的工作态度。

组培苗驯化与移栽一、组培苗驯化1.组培苗的特点①组培苗生长细弱，茎、叶表面角质层不发达；②组培苗茎、叶虽呈绿色，但叶绿素的光合作用较差；③组培苗的叶片气孔数目少，活性差；④组培苗根的吸收功能弱。异养状态，自身光合能力很弱，依靠培养基为其生长提供营养物质。苗的类型生境光照温度相对湿度养分气体菌态组培苗弱，易调控适宜且稳定高丰富光下CO2低，有害气体量高无菌实生苗强，波动大波动性大较低，波度大较贫瘠各种气体成分较稳定有菌2.组培苗与实生苗的区别3.组培苗与实生苗在形态结构及功能上的差异苗的类型叶片及其功能根系及其功能组培苗角质层薄，水孔多，气孔的生理活性差，保水能力差；此外叶绿体的光合性能也差根系不发达，吸水能力差实生苗角质层较厚，水孔少，气孔的生理活性强；叶绿体的光合性能好根系发达，吸水能力强4.组培苗驯化1）驯化目的：是人为创造一种由组培苗生境逐渐向自然环境过渡的条件，促进组培苗在形态、结构、生理方面向正常苗转化，使之更能适应外界环境，从而提高组培苗移栽的成活率。2）驯化原则：应从光、温、气、湿及有无杂菌等环境要素考虑。3）驯化方法：将装有组培苗的培养容器移到温室或大棚，先不要打开瓶盖或封口膜，并不能立即接受太阳光的直接照射，以免瓶内升温太快，使幼苗因蒸腾作用过强失水萎蔫，甚至死亡。可以先进行适当遮蔽，再逐渐撤除保护，让组培苗接受自然散射光照射，并逐步适应自然的昼夜温差变化。3-5d后打开瓶盖或封口膜，使培养瓶中甚至更接近外界环境条件，再炼苗2-3d后即可移栽。组培苗驯化成功的标准是茎长粗、叶增绿、根系延长并由白色变为黄褐色。驯化要求：1）湿度锻炼：使小苗逐步适应周围环境的湿度。移栽前开瓶盖进行湿度锻炼。2）基质疏松：珍珠岩、蛭石、西沙，营养土、腐殖土等。3）调控光、温、湿等因子：生长季闭口炼苗期间调控光照强度、防雨水影响。部分遮光条件下移栽后管理，保持合适温度。4）将小苗进行分级苗高和根数是评估移栽苗的重要指标。5.试管苗的生根1）试管内生根5.试管苗的生根2）试管外生根甘薯5.试管苗的生根3）无根苗的嫁接二、组培苗移栽1.基质准备移栽基质要求疏松、透水、通气，有一定的保水性，易消毒处理，不利于杂菌滋生。常选用的基质有蛭石、珍珠岩、河沙、草炭土、腐殖土、炉灰渣、谷壳、锯木屑等。

常用的有珍珠岩：蛭石：草炭土为1:1:0.5，或河沙：草炭土为1:1。2.移栽方法1）常规移栽将驯化后的小苗取出，用清水洗去附着于根部的琼脂培养基，操作时应尽量减少对根系和叶片的损伤。用50%多菌灵800倍溶液浸泡消毒1-2min，然后移栽到混合基质中。（农药稀释倍数是指稀释用的水是农药的重量（固体）或体积（液体）倍数。）

移栽深度适宜，可埋没叶片。移栽后要浇一次透水，保持一定的温度和水分，适当遮阴。当长出2-3片新叶时，即可将其移栽到田间或盆钵中。2）直接移栽直接将组培苗移栽到盆钵中。这种方法适合具有专业化生产的温室条件，选用适宜的盆栽基质，直接将生根组培苗移栽入盆，随着植株的生长，再逐渐换大型号的花盆。3）嫁接有些木本植物不易在瓶内生根，可选取合适的实体幼苗作砧木，用组培苗作接穗进行嫁接。嫁接移栽法与常规移栽法相比具有移栽成活率高、适用范围广、成苗所需的时间短、有利于移栽植物的生长发育等许多优点。移苗注意：苗盘消毒：用0.1%的高锰酸钾对苗盘进行浸泡消毒或喷淋消毒。基质消毒：对已用过的需用0.1%高锰酸钾喷淋后用自来水冲洗干净。移栽技术：当根系打到一定长度（小于1cm）时移栽，带琼脂少，伤根轻，移栽时应将小苗基部的培养基冲洗干净，切忌伤根和茎叶。如根长，可剪为2-3cm。移栽后根迅速固着于土壤基质并吸收营养。3.注意事项常用的有珍珠岩：蛭石：草炭土为1:1:0.5，或河沙：草炭土为1:1。

苗盘移栽：将消毒后的蛭石或珍珠岩放在苗盘内，厚度约4-6cm，用水淋透后，将洗净的组培苗栽植在培养基质内，用水喷淋透后放置在拱棚内保护培养2-3周。保持温度和湿度。营养钵移栽：营养钵与营养土的准备：营养土最好采用腐殖土与细沙（或蛭石）按照3：1的比例混合过筛后备用。将组培苗从苗盘提出，栽植在营养钵中，浇一次透