怒江金丝猴种群遗传档案建立技术规程-编制说明

怒江金丝猴种群遗传档案建立技术规程编制说明

编制说明的内容包括：

一、工作简况，包括任务来源、协作单位、主要工作过程、标准主要起草人及其所做工作等

1.1任务来源

制定怒江金丝猴种群遗传档案建立技术规程，建立统一的方法和技术流程，推进怒江金丝猴粪便样品获取、粪便DNA提取、个体识别以及遗传资源数据获取的标准化和和规范化技术建设，促进怒江金丝猴种群遗传资源信息获取规范化，为怒江金丝猴遗传资源多样性保存和科学研究提供技术参考。根据科技部重点研发项目2023年第一批团体标准计划通知，团体标准《怒江金丝猴种群遗传档案建立技术规程》由云南大学提出，云南省动物学会归口，标准由云南大学牵头起草。

1.2主要工作过程

（1）成立起草小组：云南大学成立了《怒江金丝猴种群遗传档案建立技术规程》的标准起草工作小组；同时及时部署了制标工作方案和小组成员分工负责制及标准起草工作时间安排表，全面启动了该规程的编制工作；工作小组研究了标准制定思路，明确本标准的编写框架以及需制定的内容。

（2）收集资料及预试验：标准发起单位开始进行资料收集、数据整理和开展预实验等工作。

（3）标准起草：标准起草小组在前期研究工作及预试验的基础上，对技术进行总结，并查阅了大量的国内外文献资料，确定了《怒江金丝猴种群遗传档案建立技术规程》的基本内容和思路，形成了标准基本框架。

1.3标准主要起草人及所做工作

本标准主要起草人：于黎，匡卫民，李圆，骆佳。

本标准制定过程中主要由匡卫民和李圆负责文本起草、编制说明撰写、资料

收集等工作，由骆佳负责资料收集、分析调研、样品采集、试验论证等工作，由于黎组织协调和文本修改等工作。

二、团标主要技术内容及确定依据（如技术指标、参数、公式、性能要求、实验方法、检验规则等）的论据（包括施用、统计数据）；修订团标时，应增加新、旧团标水平的对比

本标准规定了怒江金丝猴种群遗传档案建立中的有关术语和定义、怒江金丝猴粪便样品采集、粪便DNA提取、个体识别以及种群遗传档案建立的技术方法。

2.1粪便样本采集

根据怒江金丝猴粪便的新鲜程度，选取新鲜的怒江金丝猴粪便作为实验样品。同一堆粪便只采集一份样品，若采集了多份样品，需在采样记录表中注明为同一堆粪便，两堆粪便样品的距离应大于2m。采集怒江金丝猴新鲜粪便样品时，应佩戴一次性PE手套。禁止直接用手拾取怒江金丝猴粪便，以避免人为因素导致的样品污染；每次采样时必须更换新的PE手套，以避免样品间的交叉污染。采集时，选取远离地面一侧的粪便，尽量不采集与地面接触的粪便，减少污染。使用灭菌的镊子直接剥取分离新鲜粪便分别放入盛有RNAlater保存液的样品管中，每份样品采集4管粪便保存液保存。拧紧盖子后上下轻微摆动数次，使样品得到充分湿润，沿着管盖包裹一层封口膜，并检查是否有液体渗漏。在样品管盖和管壁上贴上标签纸，用记号笔在标签纸写上样品编号，用胶带将标签纸包裹住，避免摩擦或保存液流出导致编号丢失。最后将样品管放入样品盒，并在盖上标记种群、采样点、采集人以及时间等信息，同时使用胶带将冻存盒封住，防止冻存盒打开导致样品散落。在采集粪便样品的过程中，可用GPS数码照相机拍摄一些带有地理信息（经纬度、海拔）的样品照片。

粪便样品实验室保存：粪便样品应放于−80℃冰箱进行超低温保存，可短期（1个月内）在-20℃冰箱中冷冻保存。

2.2粪便DNA的提取、检测和保存

（1）粪便的DNA提取：使用商品试剂盒从怒江金丝猴粪便中进行总DNA

提取。

（2）DNA质量检测：使用1%琼脂糖凝胶电泳和Nanodrop2000分光光度计对提取的DNA样品进行质量检测，DNA样品的A260/A280比值应在1.7-2.1之间，浓度应超过10ng/µL，否则视为不合格样品。

（3）DNA保存：将装有DNA的离心管置于-20℃冰箱中进行短期保存；将装有DNA的离心管置于-80℃超低温冰箱中进行长期保存，注意在保存期间避免反复冻融。

2.3遗传标记

（1）线粒体标记：使用怒江金丝猴线粒体D-loop片段的引物，对怒江金丝猴粪便DNA样品进行PCR扩增，扩增序列长度为620bp左右。

（2）微卫星标记：对线粒体标记PCR扩增成功的个体进行个体识别，使用

10个微卫星标记对样品进行个体识别。

2.4个体识别：

选用多种适用于PCR反应的酶进行PCR扩增，将符合质量要求的PCR产物送至有关公司进行基因扫描分型：不同颜色标记引物的PCR产物或者相同颜色标记但PCR产物长度明显不重叠的可以混合后进行基因扫描分型。用软件对10个微卫星标记的分型数据进行个体识别：当两个或两个以上的样品微卫星标记分型结果完全一致时，判定样品来自同一个体；当两个样品的微卫星标记分型结果中有两个及以上标记分型结果不同时，判定样品来自不同个体；当两个样品的微卫星标记分型结果中只有一个标记差异时，对出现差异的位点重复进行PCR扩增（2-3次）和基因分型，若分型结果没有差异，则判定样品来自同一个体，反之则认为两个样品来自不同个体。

2.5种群遗传档案的管理和使用

对怒江金丝猴进行个体识别、种群遗传档案建立和种群遗传管理时，可使用本标准规定的分子标记。各保护区、各保护机构获得本机构相关数据，并妥善保存。

三、国内外标准情况简要说明；

怒江金丝猴仅分布于缅甸和我国云南省高黎贡山自然保护区内，国外目前