《食品微生物检验技术》课件-生化制剂的制备

生化试剂制备目录/Contents1糖（醇）类代谢试验法生化试剂制备氨基酸和蛋白质代谢试验法2呼吸酶类试验3毒性酶类试验401糖（醇）类代谢试验法（1）试验原理：不同的细菌对各种糖醇的分解能力及所产生的代谢产物各不同，有的能分解多种糖醇，有的只能分解1-2种糖醇，有的分解糖醇只产酸不产气，有的分解糖醇能产酸产气，通过这些特点，我们可以鉴别细菌。01糖（醇）类代谢试验法糖发酵培养基主要有：液体糖发酵管、半固体糖发酵管、固体糖发酵管、双糖(或三糖)高层斜面发酵管四类。01糖（醇）类代谢试验法糖发酵试验法的具体操作方法：采用无菌操作法，首先将已分离培养的纯种细菌用接种针或者接种环移取，然后接种在糖发酵管中，如果是半固体培养基，则用接种针作穿刺接种。最后放置于36±1℃温箱内培养，经过一定时间（数小时以至二周之间）的培养，培养过程中每天观察结果，并与指示剂比对即可。01糖（醇）类代谢试验法（3）葡萄糖氧化发酵培养基（O/F）的制备称取蛋白胨2.7克，氯化钠5.0克，0.2%溴麝香酚兰0.03克，琼脂3克，0.3克KH2PO4，葡萄糖10.0克，水1000毫升。加热溶解，121℃高压灭菌20min即可。01糖（醇）类代谢试验法（2）V-P.试验的试验方法首先取3支葡萄糖蛋白胨水培养基，将它们一一编号，第1号接种大肠杆菌，第2号接产气杆菌，第3支接未知菌；然后放入37℃培养箱中培养48h，之后加入40%KOH5-10滴，再加入等量的5%α-萘酚溶液，用力振荡；最后放入37℃温箱中保温30min，以加快反应速度；保温期间注意观察培养基的颜色变化：①当发酵管出现红色者时，称为阳性，记作V-P+②当发酵管为黄色或铜绿色时，称为阴性，记作V-P-。01糖（醇）类代谢试验法（2）V-P.试验的制备方法制备方法：将3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂生长物接种3%氯化钠MR-VP培养基，36℃士1℃培养48h。取1mL培养物转放到一个试管内，加0.6mL甲液，摇动。加0.2mL乙液，摇动。随意加一点肌酸结晶，4h后观察结果。阳性结果是呈伊红的粉红色。01糖（醇）类代谢试验法

3．甲基红（MR）试验（1）试验原理肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸，进一步分解中，由于糖代谢的途径不同，可产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，可使培养基pH值下降至pH=4.5以下，使甲基红指示剂变红，即为甲基红试验阳性；有的细菌使丙酮酸脱羧后形成酮、醇类中性产物，培养液pH＞5.4，甲基红指示剂呈桔黄色，示为甲基红试验阴性。简而言之，甲基红试验原理就是检测不同细菌分解葡萄糖产酸的能力。01糖（醇）类代谢试验法（2）试验方法首先挑取少许新鲜的待测试验培养物，接种于磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基中；然后放于36±1℃或30℃（以30℃较好）培养箱中培养3~5天；其中注意，从培养的第48h起，每天要取培养液1mL，加入甲基红指示剂1~2滴，立即观察结果。01糖（醇）类代谢试验法（3）结果观察与记录①呈鲜红色或橘红色为阳性，呈淡红色为弱阳性，记MR+；②呈橘黄色或黄色为阴性，记MR-。从发现阴性并培养至第5天仍为阴性，即可判定结果。（4）试验中所用培养基和试剂的制备①磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基的制备称取蛋白胨5g，葡糖糖5g，磷酸氢二钾2g，加入蒸馏水1000mL，充分溶解后调pH7.0-7.2，过滤。分装于试管中，每管10mL，121℃灭菌30min。01糖（醇）类代谢试验法②甲基红试剂称取甲基红（Methylred）0.04g，溶于60mL的95％乙醇中，再加入40mL的蒸馏水即可。02氨基酸和蛋白质代谢试验法（1）原理某些细菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可以用显色反应来表现。吲哚与对二甲基氨基苯甲醛结合，形成玫瑰吲哚，此物质为红色化合物。也就是说，这一试验反应原理包括两个过程，一个是色氨酸分解反应，一个是吲哚反应。02氨基酸和蛋白质代谢试验法（2）试验方法先找取3支胰蛋白水培养基，分别编号，1号接种大肠杆菌，2号接种产气杆菌，第3支接未知菌；然后将三个培养基放于37℃培养箱中培养1~2天；培养完成后，沿试管壁滴加数滴吲哚试剂于培养物液面，观察结果。若结果呈现玫瑰红色，则为阳性反应，记吲哚试验阳性；若结果无红色者，则为阴性反应，记作吲哚阴性。02氨基酸和蛋白质代谢试验法（2）试验方法先找取3支胰蛋白水培养基，分别编号，1号接种大肠杆菌，2号接种产气杆菌，第3支接未知菌；然后将三个培养基放于37℃培养箱中培养1~2天；培养完成后，沿试管壁滴加数滴吲哚试剂于培养物液面，观察结果。若结果呈现玫瑰红色，则为阳性反应，记吲哚试验阳性；若结果无红色者，则为阴性反应，记作吲哚阴性。02氨基酸和蛋白质代谢试验法（2）试验方法与结果①琼脂穿刺法培养基为三糖铁培养基、含硫酸亚铁(或醋酸铅)的半固体培养基两种。操作方法：将试验细菌用接种针沿着管壁穿刺接种到含醋酸铅或硫酸亚铁培养基中，经37℃培养24h-48h后，观察结果。结果：培养基变成黑色则为阳性。当产生硫化氢量少时，为了便于观察结果，在穿刺接种培养时，一定要沿培养基管壁进行。02氨基酸和蛋白质代谢试验法（2）试验方法与结果②醋酸铅试纸法培养基为含胱氨酸的半固体培养基，还需要准备一个浸有醋酸铅的滤纸条。操作方法：待检菌穿刺接种培养基，悬挂醋酸铅纸条，于37℃培养箱中培养24h-48h。结果：如果试纸呈现黑色，则为阳性。此方法比较敏感。02氨基酸和蛋白质代谢试验法3.尿素酶（Urease）试验（2）试验方法挑取大量培养18h~24h的待试菌，浓密涂布接种于尿素琼脂斜面上，不要到达底部，留底部作变色对照。在培养2h、4h和24h三个时间点时，分别观察一次结果。如果培养基变为粉红色则为阳性，颜色不变者即为阴性。倘若初步判断为阴性，则应该继续培养至4天，作最终判定。02氨基酸和蛋白质代谢试验法（3）尿素琼脂培养基的制备①成分蛋白胨1g，琼脂20g，氯化钠5g，葡萄糖1g，磷酸二氢钾2g，0.4%酚红溶液3mL，20%尿素溶液100mL，蒸馏水1000mL。pH7.2±0.1②培养基的配制在蒸馏水或去离子水100mL中，加入上述所有成分（除尿素和琼脂外），混合均匀并校正pH，121℃灭菌15min。冷至50～55℃，加入经除菌过滤的尿素溶液。尿素的最终浓度为2%，最终pH应为7.2±0.1。03呼吸酶类试验（三）呼吸酶类试验1.氧化酶试验（1）试验原理氧化酶使细胞色素C氧化，氧化型细胞色素C再使盐酸二甲基对苯二胺氧化，生成由玫瑰红色变成暗紫色的醌类化合物，它再和α-萘酚结合生成吲哚酚蓝。03呼吸酶类试验（三）呼吸酶类试验（2）试验方法用滴管直接滴加1%盐酸二甲基对苯二胺试剂在培养物上，滴加量为1-2滴；再加入1%α-萘酚-乙醇液1-2滴，于30秒内判定试验结果。如果在30秒内呈现蓝色反应，则为阳性，记作+；如果不变色或为粉红色者，为阴性，记作-。03呼吸酶类试验2.过氧化氢酶试验（1）原理某些细菌能够分泌过氧化氢酶，当加入过氧化氢以后，可将过氧化氢分解生成水和氧气，产生气泡，此为阳性反应。03呼吸酶类试验2.过氧化氢酶试验（2）试验方法取下固体培养基上的新鲜菌落一环，放置在一个干净玻璃片上或者试管上，向其上滴加3%过氧化氢液数滴，立即观察结果。若产生气泡，就是阳性，记为+，若不产生气泡，则为阴性，记-。03呼吸酶类试验3.硝酸盐还原试验（1）原理某些细菌具有还原硝酸盐的能力，能将硝酸盐还原为亚硝酸盐。在酸性条件下，亚硝酸盐可以生成亚硝酸，亚硝酸与对氨基苯磺酸作用，生成重氮苯磺酸，而重氮苯磺酸又与α-萘胺作用，生成红色的化合物，呈红色反应，为阳性反应。03呼吸酶类试验（2）试剂A试剂是对氨基苯磺酸试剂：将对氨基苯磺酸0.8g，溶解于2.5mol/L，乙酸溶液100mL中；B试剂是α-萘胺试剂：将甲萘胺0.5g溶解于2.5mol/L乙酸溶液100mL中。03呼吸酶类试验（3）试验方法取新鲜的纯培养物待检菌，接种在硝酸盐培养基上，于36±1℃培养箱中培养1~4天，每天取2mL培养液，加入等量的A、B试剂混合物各二滴，混和均匀，立即观察结果。若结果是红色，则为阳性，记+；若无红色出现，即为阴性，记-。03呼吸酶类试验4.氰化钾试验（1）原理氰化钾是细菌呼吸酶系统的抑制剂，它能与呼吸酶作用，让酶失去活性，从而抑制细菌的生长，但有的细菌在一定浓度的氰化钾存在时，仍能生长，依此来鉴别细菌。03呼吸酶类试验4.氰化钾试验（2）试验方法取下1环已培养20h~24h的营养肉汤培养液，将其接种到对照培养基及氰化钾培养基内，立即用橡胶塞塞紧，放置于36±1℃培养箱中，培养24h~48h，观察结果。当对照管中有菌生长，同时试验管也有菌生长时，为阳性，记作+；当对照管中有菌生长，而试验管中无菌生长为阴性，记作-。04毒性酶类试验1．溶血试验（1）原理某些细菌在代谢过程中能产生溶血素，可使人或动物的红细胞发生溶解，不同的细菌有不同的溶血反应，借此可鉴别细菌。（2）试验方法方法有平板法和试管法两种，这里只介绍试管法。先把待检菌培养液与2%的羊血球等量混合，然后于36±1℃培养16h-18h，观察其结果。如果溶血，培养液可出现透明状，即为阳性，记作+；如果无溶血现象，则为阴性，记作-。04毒性酶类试验2．血浆凝固酶试验（1）原理致病性葡萄球菌能产生血浆凝固酶，可使血浆中的纤维蛋白原转变成纤维蛋白，附着在细菌的表面，形成凝块；或作用于血浆凝固酶原，使它成为血浆凝固酶，从而使抗凝的血浆发生凝固现象，为阳性。04毒性酶类试验2．血浆凝固酶试验（2）试验方法以试管法为主。即找灭菌小试管3支，向三个试管中各加入1:1体积的血浆－无菌水0.5mL，1支加入被检菌株的营养肉汤培养液0.5mL；其余2支作对照管，其中一支加入金黄色葡萄球菌的营养肉汤培养液0.5mL作阳性对照；另一支加入