质粒提取及纯化

质粒提取及纯化DNA的提取和纯化小量制备大量制备碱裂解小量制备法氯化铯/溴化乙锭平衡力新法碱裂解法制备粗制裂解物煮沸小量制备法第2页,共24页，2024年2月25日，星期天名词解释1.质粒质粒zhìlì（Plasmid）是附加到细胞中的非细胞的染色体或核区DNA原有的能够自主复制的较小的DNA分子（即细胞附殖粒、又胞附殖粒）。大部分的质粒虽然都是环状构型，它存在于许多细菌以及酵母菌等生物中，乃至于植物的线粒体等胞器中。然而，1984年，在Streptomycescoelicoler（天蓝色链霉菌）等放线菌以及在Borreliahermsii（赫氏蜱疏螺旋体）等原核生物中，又相继发现线形质粒。第3页,共24页，2024年2月25日，星期天2.基因工程基因工程（geneticengineering）又称基因拼接技术和DNA重组技术。所谓基因工程是在分子水平上对基因进行操作的复杂技术，是将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作。第4页,共24页，2024年2月25日，星期天它是用人为的方法将所需要的某一供体生物的遗传物质——DNA大分子提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中，以让外源物质在其中“安家落户”，进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一种崭新技术。它克服了远缘杂交的不亲和障碍。第5页,共24页，2024年2月25日，星期天溶液一50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris-Cl10mmol/LEDTATris-ClTris-HCl缓冲液（0.05mol/L，25℃），中文别名：三（羟甲基）氨基甲烷；氨丁三醇；缓血酸铵；三羟甲基氨基甲烷；Tris，英文名称：Tris(hydroxymethyl)aminomethane分子式：C4H11NO3分子量：121.14CAS号：77-86-1密度：1.353熔点：167-172℃沸点：219-220℃(10mmHg)闪点：100℃水溶性：550g/L(25℃)外观：白色结晶水溶性：无色，澄清毒性：毒性低，可致癌，不要直接接触皮肤。第6页,共24页，2024年2月25日，星期天用途Tris缓冲液不仅被广泛用作核酸和蛋白质的溶剂，还有许多重要用途。Tris被用于不同pH条件下的蛋白质晶体生长。Tris缓冲液的低离子强度特点可用于线虫（C.elegans）核纤层蛋白（lamin）的中间纤维的形成。Tris也是蛋白质电泳缓冲液的主要成分之一，其在电泳缓冲液中与甘氨酸构成缓冲体系，稳定电泳过程中的PH。此外，Tris还是制备表面活性剂、硫化促进剂和一些药物的中间物。Tris也被用作滴定标准物。作为蛋白缓冲液时，若后续工作需要质谱，则不适宜用Tris，最好换成其他质谱仪可耐受的缓冲液。苏宁易用途Tris缓冲液不仅被广泛用作核酸和蛋白质的溶剂，还有许多重要用途。Tris被用于不同pH条件下的蛋白质晶体生长。Tris缓冲液的低离子强度特点可用于线虫（C.elegans）核纤层蛋白（lamin）的中间纤维的形成。Tris也是蛋白质电泳缓冲液的主要成分之一，其在电泳缓冲液中与甘氨酸构成缓冲体系，稳定电泳过程中的PH。此外，Tris还是制备表面活性剂、硫化促进剂和一些药物的中间物。Tris也被用作滴定标准物。作为蛋白缓冲液时，若后续工作需要质谱，则不适宜用Tris，最好换成其他质谱仪可耐受的缓冲液。苏宁易购宝宝知道拇指医生百度知道首页电脑版反馈词条由网民创作并享有版权，请保护版权归属了解更多Tris-HCl用百度知道词条目录百科名片概述简介用途第7页,共24页，2024年2月25日，星期天EDTA溶液乙二胺四乙酸能与Mg2+、Ca2+、Mn2+、Fe2+等二价金属离子结合的一种螯合剂。由于多数核酸酶类和有些蛋白酶类的作用需要Mg2+，故常用做核酸酶、蛋白酶的抑制剂；也可用于去除重金属离子对酶的抑制作用。用途EDTA是一种重要的络合剂。EDTA用途很广，可用作彩色感光材料冲洗加工的漂白定影液，染色助剂，纤维处理助剂，化妆品添加剂，血液抗凝剂，洗涤剂，稳定剂，合成橡胶聚合引发剂，EDTA是螯合剂的代表性物质。能和碱金属、稀土元素和过渡金属等形成稳定的水溶性络合物。第8页,共24页，2024年2月25日，星期天第9页,共24页，2024年2月25日，星期天溶液一的作用溶液Ⅰ50mM葡萄糖/10mMEDTA/25mMTris-HCl,pH=8.0葡萄糖增稠,使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部；EDTA抑制DNase的活性.这一步溶液中还可以加入RNase,不受EDTA影响,并且可以在后续步骤中被除去第10页,共24页，2024年2月25日，星期天溶液二200mmol/LNaOH1/100SDS(临用前配置)第11页,共24页，2024年2月25日，星期天SDSSDS（全称为sodiumdodecylsulfate,sodiumsalt）是一种化学品，中文名为十二烷基硫酸钠。主要成分：纯品外观与性状：白色粉末。理化熔点(℃)：204-207沸点(℃)：无资料相对密度(水=1)：1.09溶解性：溶于水，微溶于醇，不溶于氯仿、醚。主要用途：用作洗涤剂原料、印染工业的匀染剂、矿物的浮选剂。还可作为表面活性剂，起到助溶作用。第12页,共24页，2024年2月25日，星期天溶液三由醋酸以及钾盐所形成，前者在于中和碱性，后者有利于染色体DNA的沉淀。第13页,共24页，2024年2月25日，星期天实验原理质粒是一种独立于染色体DNA之外的能自主复制的双链，闭合，环装小分子的DNA，其大小范围从1kb~200kb以上不等。广泛存在于细胞中，在一些动，植物细胞中也发现有质粒的存在。目前提纯质粒的方法比较多，如碱裂解法，煮沸法和SDS法等。最常用的是碱裂解法，其优点为效率高，价廉简单易学等。碱裂解分离质粒DNA是基于染色体DNA与变性与质粒DNA的复性的差异而达到分离的目的。在PH12.0~12.6的碱性环境中，宿主的染色体DNA变性（是氢键断裂，破坏碱基配对），蛋白质变性。质粒DNA的碱基对也被破坏，闭环的DNA链处在缠绕状态而不能彼此分开。加入乙酸钾缓冲液中和后，PH调至中性，小分子的变性质粒DNA迅速复性为可溶状态，而变性的染色体DNA因分子量巨大而难以复性，随同高分子量RNA以及K+/SDS/蛋白质/膜复合物形成沉淀，故经离心，即可将染色体DNA和质粒DNA分离。在实验步骤中，加入溶解液1的目的主要是将细菌团块重新悬浮于缓冲溶液中。溶液2含有SDS和NaOH，前者可将细菌溶解，后者可将DNA变性。溶液3由醋酸及钾盐所形成，前者在于中和碱性，后者则由于DNA的沉淀。加入溶液3后离心，大部分蛋白质和染色体DNA沉在下面，而上清液中所含的质粒DNA可继续进行纯化。纯化质粒采用氯化锂沉淀和聚乙二醇沉淀的方法。进一步用RNA酶消化可去除残余的RNA。用酚：氯仿：异戊醇抽提可除去PEG和残余的蛋白质。在经乙醇沉淀和离心回收，即可得到高度纯化的质粒DNA。制备的质粒DNA可用于酶切，连接，转化，以及PCR等。第14页,共24页，2024年2月25日，星期天第15页,共24页，2024年2月25日，星期天质膜微囊通常直径约50-100nm，富含胆固醇、鞘磷脂（sphingomyelin）和鞘糖脂（glycosphingolipids），并形成一个去垢剂不溶性的膜区域，以存在caveolin蛋白分子为特征。质膜微囊大量存在于内皮细胞、脂肪细胞、血管平滑肌细胞、纤维母细胞和肺上皮细胞。随着分子生物学研究的进展，发现质膜微囊参与许多细胞生命活动，例如细胞内吞（endocytosis）、胆固醇运输、细胞膜组装、信号传导和肿瘤生成，并参与许多致病性细菌和病毒的内吞过程。第16页,共24页，2024年2月25日，星期天第17页,共24页，2024年2月25日，星期天基本方案1.碱裂解小量制备（最常用）恒温摇床普通离心机台式高速离心机漩涡振荡器-20度冰箱三角烧瓶烧杯量筒刻度吸管制冰机Eppendorf管架Tip头保温瓶可调式移液器（0~20ul,0~200ul,20~1000ul）试管架纸巾或吸水纸2.试剂(1)溶液一：50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris-Cl(PH=8.0),10mmol/LEDTA(2)溶液二：200mmol/LNaOH,1/100SDS(临用前配制)(3)溶液三：5mmol/L乙酸钾，冰乙酸，水按6:1.15:2.85混合而成，所配溶液对钾是3mol/L，对乙酸根是5mol/L(4)STE溶液：0.1mol/LNaCl,10mmol/LTris-Cl(PH=8.0),1mmol/LEDTA(5)TE缓冲液：10mmol/LTris-Cl(PH=8.0),1mmol/LEDTA(6)3mol/L乙酸钠(PH5.2)(7)5mol/LiCl(8)1.6mol/LNaCl,13/100PEG：将3.9g聚乙二醇溶于20ml1.6mol/LNaCl中，再加1.6mol/LNaCl定容至30ml过滤除菌，置4摄氏度保存。(9)饱和酚(10)氯仿：异戊醇(24:1)

第18页,共24页，2024年2月25日，星期天(11)RNnaseA溶液(10mg/ml),无水乙醇，异丙醇(12)LB培养基(含100mlug/ml氨苄青霉素)：称取胰蛋白胨5g，酵母提取物2.5g,NaCl5g,加双蒸水400ml溶解，用5mol/LNaCl调至PH=7.4，定容至500ml，在103.4kpa下高压灭菌20min3.细菌和质粒大肠杆菌JM103(pUC19),大肠杆菌JM103(pUC19-cTnI)第19页,共24页，2024年2月25日，星期天4.实验步骤1.细菌繁殖：LB培养基，2ml/20ml，37℃，200rpm，摇一摇，过夜。

2.离心10min，5000rpm，4℃；弃上淸液。

3.沉淀（菌体细胞）预冷的TES缓冲液洗涤，离心10min，5000rpm，4℃，加入预冷的1mlSolutionI，冰浴10min。

4.重新悬浮，加入150ul溶菌酶母液，室温放置5min。

5.加入1.2mlSolutionII，冰浴5min。

6.加入0.9ml预冷乙酸钾，混匀，离心10min，12000rpm，4℃。

7.加入1.5ml异丙醇，-20℃冰箱内放置15min。

8.离心10min，12000rpm，4℃。

9.取沉淀，悬于400ulTE缓冲液中。

第20页,共24页，2024年2月25日，星期天10.加入40ul，3MNaAc。

11.酚/氯仿，抽提，乙醇沉淀。

12.离心10min，12000rpm，4℃。

13.取沉淀，冷冻干燥，再悬浮于50ulTE缓冲液中。

14.电泳检测提取DNA的质量。第21页,共24页，2024年2月25日，星期天二.质粒DNA的大量制备1.原理大量碱裂解方法不仅相当快捷可靠，而且可获得相当纯净的粗制DNA，煮沸法的大量制备也简单易行。但得到的DNA比较粗制，高纯度的质粒DNA可通过氯化铯或溴化乙锭平衡离心法或层析法进一步纯化，促使DNA得到。2材料含有氨苄青霉素或其他适当的选择性试剂的LB培养基或丰富培养基带有质粒的大肠杆菌菌株。葡萄糖溶液/Tris/EDTA溶液卵清溶菌酶3mol/l的乙酸钾溶液（PH约5.5）异丙醇70/100乙醇约20ml容量的高速离心管步骤1.往5ml的含选择性试剂（通常是氨苄青霉素）的LB培养基或丰富培养基接种单菌落。于37摄氏度及剧烈震荡培养过夜。2.往2L烧瓶加入500ml含有适当抗生素的LB培养基，然后将1ml过夜培养的大肠杆菌培养物，在与37摄氏度培养至饱和状态第22页,共24页，2024年2月25日，星期天注意：以提高产量，应采用表面积较大及带折流板的烧瓶以增大通气度，振摇速度大于400r/min3于4摄氏度，6kg离心10min4用4mlGTE重悬沉淀并转移到一个容积大于等于20ml的高速离心管中5加入1ml新配的含25mg/ml溶菌酶的GTE溶液彻底重悬沉淀，于室温放置10min注意：如果DNA要用层析法纯化，加入5微