第五讲 DNA的复制课件

分子生物学第五讲DNA的复制ThereplicationofDNA第五讲DNA的复制第五讲DNA的复制

一、DNA的复制二、RNA的反转录三、DNA的转座第五讲DNA的复制

脱氧核糖核酸（DNA）是生物界遗传的主要物质基础。生物有机体的遗传特征以密码的形式编码在DNA分子上，表现为特定的核苷酸排列顺序－即遗传信息。在细胞分裂前通过DNA的复制，将遗传信息由亲代传递给子代。在后代的个体发育过程中，遗传信息自DNA转录给RNA，并指导蛋白质的合成，以执行各种生命功能。使后代表现出与亲代相似的遗传性状，这种遗传信息的传递方向，是从DNA到RNA再到蛋白质，即所谓的生物学“中心法则”。80年代以后，在某些致癌RNA病毒中发现遗传信息也存在于RNA分子中，由RNA通过逆转录的方式将遗传信息传递给DNA。这个中心法则加入了新的内容。这也就是我们前面提到过的，目前被生物界认可的遗传信息传递的中心法则。

第五讲DNA的复制

复制转录反转录翻译DNARNAPRO生理功能遗传信息传递的中心法则第五讲DNA的复制第五讲DNA的复制（一）、DNA的复制（二）、复制的起始阶段（三）、DNA复制的延长阶段以及参与的酶和蛋白质分子

（四）、DNA复制的终止阶段（五）、复制的几种主要方式（六）、真核生物复制第五讲DNA的复制DNA复制（theReplicationofDNA

）亲代双链DNA分子在DNA聚合酶的作用下，分别以每单链DNA分子为模板，聚合与自身碱基可以互补配对的游离的dNTP,合成出两条与亲代DNA分子完全相同的子代DNA分子的过程。

第五讲DNA的复制（一）、DNA的复制

1、DNA半保留复制的机理2、DNA的半不连续复制

第五讲DNA的复制1、DNA半保留复制的机理

Semi-Conservation

ReplicationDNA作为遗传物质的基本特点就是在细胞分裂前进行准确的自我复制，使DNA的量成倍增加，这是细胞分裂的物质基础。1953年Watson和Crick提出DNA双螺旋结构模型，模型指出，DNA分子由两条多核苷酸链组成，两条链的碱基配对规则：G只能与C配对，A只能与T配对，以氢键相连，所以两条链是互补的，一条链上的核苷酸排列顺序决定了另一条链上的核苷酸排列顺序。就是说，DNA分子的每一条链都含有合成它的互补链所需的全部信息。

第五讲DNA的复制这就说明DNA的复制是由原来存在的分子为模板来合成新的链。曾经有许多关于DNA复制方式的学说，包括半保留复制，全保留复制以及分散复制等。Watson和Crick在提出DNA双螺旋结构模型时就推测，DNA在复制时首先两条链之间的氢键断裂开，然后以每一条链分别做模板各自合成一条新的DNA链，这样新合成的子代DNA分子中一条链来自亲代DNA，另一条链是新合成的，这种复制方式为半保留复制。第五讲DNA的复制Threereplicationhypotheses第五讲DNA的复制1958年Maselson和Stahl利用氮标记技术在大肠杆菌中首次证实了DNA的半保留复制。他们将大肠杆菌放在含有N15标记的培养基中培养，得到N15－DNA。然后将细菌转移到含有N14标记的培养基中进行培养，在培养不同代数时，收集细菌，裂解细胞，用氯化铯密度梯度离心法观察DNA所处的位置。由于N15标记的DNA的密度比普通DNA的密度大，在氯化铯密度梯度离心时，两种密度不同的DNA分布在不同的区带。

第五讲DNA的复制

实验结果表明：在全部由N15标记的培养基中得到的N15－DNA显示为一条重密度带，位于离心管的管底。当转入N14标记的培养基中繁殖后第一代，得到了一条中密度带，这是N15－DNA和N14－DNA的杂交分子。第二代有中密度带及低密度带两个区带，这表明它们分别为N14－DNA分子

和N14－N15－DNA杂合分子。随着以后在N14培养基中培养代数的增加，低密度带增强，而中密度带逐渐减弱，离心结束从管底到管口，CsCL溶液密度，不同重量的DNA分子就停留在于其相当的CsCL密度处，在紫外光可以看到DNA分子形成的区带。第五讲DNA的复制为了证实第一代杂交分子确实是一半N15－DNA一半N14－DNA：将这种杂交分子经加热变性，对于变性前后的DNA分别进行CsCL密度梯度离心。结果变性前的杂交分子为一条中密度带，变性后则分为两条区带，即重密度带（N15－DNA）和低密度带（N14－DNA）。它们的实验只有用半保留复制的理论才能得到圆满的解释。

第五讲DNA的复制(CsClgradientcentrifuge)

N15

N14DNASemi-ConservationReplicationM.MeselsonandF.W.Stahl,Sciences44:675,1958.第五讲DNA的复制1、DNA半保留复制的证据第五讲DNA的复制

模板：能提供合成一条互补链所需要精确信息的核酸链。

第五讲DNA的复制2、DNA的半不连续复制

（semi-discontinuouseplication）

在体内，DNA的两条链都能作为模板，同时合成出两条新的互补链。由于DNA分子的两条链是反向平行的，一条链的走向为5'－3'，另一条链为3'－5'。但是所有已知DNA聚合酶的合成方向都是5'－3'，而不是3'－5'。这就很难说明，DNA在复制时，两条链如何能够同时作为模板合成其互补链。为了解释这一现象，日本学者岗崎提出了半不连续复制模型。。

第五讲DNA的复制3‘5‘3‘5‘OK!How?5‘3‘5‘3‘第五讲DNA的复制1968年，岗崎用3H－脱氧胸苷短时间标记大肠杆菌，提取DNA，变性后用超离心法得到了许多3H标记的，后人称为岗崎片断的DNA。延长标记时间后，岗崎片度可转变为成熟的DNA链，因此，这些片断必然是复制过程的中间产物。第五讲DNA的复制但是冈崎等最初不能确定DNA链的不连续只发生在一条链上还是两条链都如此。对岗崎片断进行测定，结果测得的数据远超过新合成DNA的一半，似乎两条链都是不连续的。后来发现，这是由于尿嘧啶代替胸腺嘧啶掺入DNA造成的。DNA中的尿嘧啶可被尿嘧啶－DNA-糖苷酶切除，随后该处的磷酸二脂键断裂，一些核苷酸被水解，造成一个缺口，最后缺口空隙被填补和修复，在此过程中也会产生一些类似岗崎片断的DNA片断。第五讲DNA的复制dUTP:dTTP=1：300incell

---A-------T--------G--------C----AUGUdutgenedUTPase少数dUTP

DNA中不能有U?---A-------T----突变频率=1/1200！？---A------A---

---U---------Ungase

ungU尿嘧啶-N-糖基酶第五讲DNA的复制UUdenaturedumpfragment~1200base~Okazakifragment●

ung–dumpfragmentlonger●dut

–

dumpfragmentshorterAA第五讲DNA的复制当用缺乏糖苷酶的大肠杆菌变异株（ung-进行实验时，尿嘧啶不再被切除。）此时，新合成的DNA有一半放射性标记出现于岗崎片断中，另一股直接进入大的片断。由此可见，当DNA复制时，一条链是连续的，另一条链是不连续的，因此称为半不连续复制（semi-discontinuousreplication）

。第五讲DNA的复制前导链(leadingstrand)：以复制叉向前移动的方向为标准，一条模板链是3‘－5’走向，在其上DNA能以5‘－3’方向连续合成，称为前导链。

滞后链(laggingstrand)：另一条模板链是5‘－3’走向，在其上DNA也是从5‘－3’方向合成，但是与复制叉移动的方向相反，所以随着复制叉的移动，形成许多不连续的片断，最后完成一条完整的DNA链，这条链称为滞后链。第五讲DNA的复制DNA的半不连续复制第五讲DNA的复制DNA复制的过程可以人为地划分成3个阶段:第一阶段为DNA复制的起始阶段，这个阶段包括起始点，复制方向以及引发体的形成；第二阶段为DNA链的延长，包括前导链及随从链的形成和切除RNA引物后填补空缺及连接冈崎片段；第三阶段为DNA复制的终止阶段。DNA复制的整个过程中需要30多种酶及蛋白质分子参加，我们将在DNA复制的各个阶段着重介绍它们的作用。第五讲DNA的复制第五讲DNA的复制（二）、复制的起始阶段

1、复制的起点2、复制的方向3、复制的速度

4、DNA复制起始引发体的形成及所参与的酶和蛋白质

第五讲DNA的复制1、复制的起点

（originofreplication）很多实验都表明：复制是从DNA分子上的特定部位开始的，这一部位叫做复制起始点常用ori或o表示。细胞中的DNA复制一经开始就会连续复制下去，直至完成细胞中全部基因组DNA的复制。复制子（Thereplicon

）：DNA复制从起始点开始直到终点为止，每个这样的DNA单位称为复制子或复制单元。第五讲DNA的复制在原核生物中，每个DNA分子只有一个复制起点，因而只有一个复制子。而在真核生物中，DNA的复制是从许多起始点同时开始的，所以每个DNA分子上有许多个复制子。第五讲DNA的复制DNA复制起始点有结构上的特殊性。例如：大肠杆菌染色体DNA复制起始点Oric由422个核苷酸组成，其中有9个核苷酸或13个核苷酸组成的保守序列，这些部位是大肠杆菌中DnaA蛋白识别的位置，大肠杆菌染色体DNA是环状双链DNA。DNA是环状双链DNA，它的复制是典型的θ型复制。从一个起点开始，同时向两个方向进行复制，当两个复制方向相遇时，复制就停止。第五讲DNA的复制二、复制的起始阶段第五讲DNA的复制

复制叉（replicationfork）：DNA分子中正在进行复制的分叉部位。它由两条亲代链及在其上新合成的子链构成。大多数生物体内DNA的复制都是从复制起点开始以双向等速形式进行。少数为双向不等速或单向方式进行复制。第五讲DNA的复制复制叉第五讲DNA的复制2、复制的方向（1）、定点开始双向复制（2）、定点开始单向复制（3）、两点开始单向复制第五讲DNA的复制（1）、定点开始双向复制这是原核生物和真核生物DNA复制最主要的形式，从一个特定位点解链，沿着两个相反的方向各生长出两条链。第五讲DNA的复制1、复制子第五讲DNA的复制（2）、定点开始单向复制质粒colE1是个典型的例子，复制从一个起始点开始，以同一方向生长出两条链，形成一个复制叉。第五讲DNA的复制（3）、两点开始单向复制第五讲DNA的复制（3）、两点开始单向复制

腺病毒DNA的复制是从2个起点开始的，形成2个复制叉，各以一个单一方向复制出一条新链。第五讲DNA的复制（3）、两点开始单向复制第五讲DNA的复制（3）、两点开始单向复制第五讲DNA的复制3、复制的速度有双向等速的，也有双向不等速的。第五讲DNA的复制4、DNA复制起始引发体的

形成及所参与的酶和蛋白质

（1）、DNA双螺旋解旋（2）、引发体的形成

第五讲DNA的复制（1）、DNA双螺旋解旋

DNA在复制时，其双链首先解开，形成复制叉。现在已经发现一些酶和蛋白质能使DNA双链变得易于解开，或者可以使超螺旋分子松弛。1）、单链结合蛋白（SSB）

2）、

DNA解链酶（DNAhelicase）

3）、DNA的解链过程

第五讲DNA的复制单链结合蛋白（SSB）

其作用是保证解链酶解开的单链在复制完成前保持单链结构，它以四聚体形式存在于复制叉处，待单链复制后才掉下，重新循环.第五讲DNA的复制DNA解链酶（DNAhelicase）DNA解链酶能通过水解ATP获得能量来解开双链DNA。它分解ATP的活性依赖于单链DNA的存在。如果双链DNA中有单链末端或切口，则DNA解链酶可以首先结合在这一部分，然后逐步向双链方向移动。大部分DNA解链酶可沿滞后链模板的5’－3’方向并随着复制叉的前进而移动，只有另一种解链酶（Rep蛋白）是沿着前导链模板的3’－5’方向移动。因此推测Rep蛋白和特定DNA解链酶分别在DNA的两条链上协同作用，解开双链DNA。

第五讲DNA的复制DNAhelicases第五讲DNA的复制DNA的解链过程

DNA在未复制前处于超螺旋结构，首先在拓扑异构酶的作用下解开负超螺旋，并与解链酶共同作用，在复制起点处解开双链。在解链过程中除了解链酶，还有一些特异蛋白，如DnaA，一旦局部解开双链，就必需有SSB蛋白来稳定解开的单链，以保证局部不会恢复成双链。接着由引发酶等组成的引发体会马上作用于两条单链DNA。不论前导链还是滞后链都需要一段RNA引物以开始子链DNA的合成。第五讲DNA的复制（2）、引发体（primosome）的形成DNA复制起始的关键步骤是前导链DNA的合成，一旦前导链DNA的聚合作用开始，随从链DNA的合成也随着开始。由于前导链的合成是连续进行的，所以它的起始只要有一段RNA引物，DNA聚合酶就能以此为起点，一直合成下去，相对简单。而随从链的合成是不连续进行的，所以引发阶段比较复杂。大肠杆菌的引发前体由DnaB、DnaC和单链结合蛋白组成。第五讲DNA的复制（2）、引发体的形成1）、引物酶2）、引发体第五讲DNA的复制引物酶（primase）它是一种特殊的RNA聚合酶，可催化短片段RNA的合成，即引物的合成。引物：是短RNA片段，一般十几个至数十个核苷酸不等，它能与单链DNA配对，并且提供了一个自由的3’－OH末端，该末端提供了由DNA聚合酶催化形成DNA分子第一个磷酸二脂键的位置。第五讲DNA的复制DNA聚合酶需要一个3－OH末端以起始复制（primase）第五讲DNA的复制引发体引发体由6种蛋白质n,n’,n’’,DnaB、C和I共同组成，只有这6种蛋白质结合在一起并与引发酶进一步组装成引发体才能发挥其功效。引发体像火车头一样在滞后链分叉的方向上浆进，并在模板上断断续续的引发生成滞后链的引物RNA短链，再由DNA聚合酶三作用合成DNA，直至遇到下一个引物或岗崎片断为止。第五讲DNA的复制Primosome（consistsofsixproteins）

PriA(dualrole)displaceSSBfromS.SDNAandhelicase

DnaT

requiredatpreprimingstage

DnaBiscentralcomponent,actionwithDnaC

DnaC

iscentralcomponent,actionwithDnaBPriB

functionisunknown

PriC

functionisunknownDnaGprimase第五讲DNA的复制第五讲DNA的复制replisome第五讲DNA的复制（2）、引发体的形成第五讲DNA的复制（三）、DNA复制的延长

阶段以及参与的酶和蛋白质分子

1、DNA聚合反应和DNA酶2、与超螺旋松驰有关的酶：第五讲DNA的复制DNA的复制DNA的复制实际上就是以DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下，将有力的四种脱氧单核苷酸（dATP，dGTP，dCTP，dTTP，简写为dNTP）聚合成DNA的过程。这是一个非常复杂的酶促反应，需要许多酶和蛋白质参与，现在分别叙述它们在DNA复制中作用。第五讲DNA的复制SubstratesrequiredforDNAsynthesis第五讲DNA的复制+n1dATPn4dTTPn3dCTP+n2dGTP++DNA+Mg2+DNA聚合酶DNAdAMPdTMPdCMPdGMP(n1+n2+n3+n4)PPi第五讲DNA的复制1、DNA聚合反应和DNA酶1957年，Arthurkornberg首次在大肠杆菌中发现DNA聚合酶I，简写为DNApolI。后来又相继发现了DNA聚合酶II和DNA聚合酶III。实验证明大肠杆菌中DNA复制的主要过程靠DNApolIII，而DNApolI和

DNApolII在DNA错配的修正和修复中起作用。第五讲DNA的复制这种酶的共同性质是：

①需要DNA模板，因此这类酶又称为依赖DNA的DNA聚合酶。②需要RNA或DNA作为引物，即DNA聚合酶不能从头催化DNA的起始。③催化dNTP加到生长中的DNA链的3‘-OH末端，因而DNA的合成方向是5’－3’④三种DNA聚合酶都是多功能酶，它们在DNA复制和修复过程的不同阶段发挥作用。第五讲DNA的复制1、DNA聚合反应和DNA酶（1）、原核生物DNA聚合酶（2）、真核生物DNA聚合酶第五讲DNA的复制（1）、原核生物DNA聚合酶1）、DNA合酶I2）、DNA合酶Ⅱ3）、DNA合酶Ⅲ第五讲DNA的复制1）、DNA合酶I

DNApolI是由一条多肽链组成，分子量为109KD。酶分子中含有一个Zn2＋，是聚合活性必须的。A、DNA聚合酶的5’－3’聚合活性

B、DNA聚合酶的3‘→5’外切酶活性──校对作用

C、DNA聚合酶的5'→3'外切酶活性──切除修复作用第五讲DNA的复制第五讲DNA的复制A、DNA聚合酶的5’－3’聚合活性

这是DNA聚合酶最主要的活性，在引物RNA3‘-OH末端，以dNTP为底物，按模板DNA上的指令由DNApolⅠ逐个将核苷酸加上去，就是DNApolⅠ的聚合作用。酶的专一性主要表现为新进入的脱氧核苷酸必须与模板DNA配对时才有催化作用。dNTP进入结合位点后，可能使酶的构象发生变化，促进3‘-OH与5’-PO4结合生成磷酸二酯键。若是错误的核苷酸进入结合位点，则不能与模板配对，无法改变酶的构象而被3'-5'外切酶活性位点所识别并切除之。第五讲DNA的复制1）、DNA合酶I

第五讲DNA的复制B、DNA聚合酶的3‘→5’外切酶活性──校对作用

这种酶活性的主要功能是从3‘→5’方向识别和切除不配对的DNA生长链末端的核苷酸。这种功能称为校对功能，这是保证聚合作用的正确性不可缺少的，因此，对于DNA复制中极高的保真性至关重要。第五讲DNA的复制1）、DNA合酶I

第五讲DNA的复制第五讲DNA的复制C、DNA聚合酶的5‘→3’外切酶活性──切除修复作用5‘→3’外切酶活性就是从5‘→3’方向水解DNA生长链前方的DNA链，主要产生5‘-脱氧核苷酸。这种酶活性只对DNA上配对部份(双链)磷酸二酯键有切割活力作用，方向是5‘→3’。每次能切除10个核苷酸，而且DNA的聚合作用能刺激5‘→3’外切酶活力达10倍以上。因此，这种酶活性在DNA损伤的修复中可能起着重要作用。对冈崎片段5'末端DNA引物的去除依赖此种外切酶活性。第五讲DNA的复制DNApolI的5'→3'聚合活性和5'→3'外切酶活性协同作用，可以使DNA一条链上的切口从5'→3'方向移动，这种反应叫做缺刻平移，利用此反应可在体外对DNA片段进行放射性P标记制成探针，进行核酸的分子杂交实验。第五讲DNA的复制1）、DNA合酶I

第五讲DNA的复制1）、DNA合酶I

第五讲DNA的复制2）、DNA合酶Ⅱ

此酶分子量为120KD，每个细胞约有100个酶分子，但活性只有DNapolⅠ的5%。活性5′→3′聚合活性3′→5′外切活性而没有5′→3′外切活性，它的作用可能与DNA损伤修复有关。第五讲DNA的复制3）、DNA合酶Ⅲ

这是在DNA复制过程中起主要作用的聚合酶，它是由一个多亚基组成的蛋白质分子，其分子量＞600kDa整个酶分子形成一个不对称的二聚体，每个大肠杆菌细胞中只有1000个酶分子，但催化dNTP参入DNA链的速率却是最快的，约为9000核苷酸/每分钟/每个酶分子。这也证明DNapolⅢ是DNA复制过程中主要发挥作用的酶。在大肠杆菌染色体DNA进行复制时，DNA聚合酶Ⅲ全酶并不是单独起作用的，而是与引发体等构成一个复制体(replisome)。第五讲DNA的复制3）、DNA合酶Ⅲ

由于复制体的存在，先导链和随从链可以同时复制。DNapolⅢ是由多亚基组成的不对称二聚体，它可能同时负责先导链和随从链的复制。第五讲DNA的复制随着DNApolⅢ向前移动，先导链的合成逐渐延长的同时，岗崎片段也在不断延长。当岗崎片段合成到前一个片段的5′端时，这冈崎片段就释放出来，由于复制叉向前移动又可将另一部分随从链的模板置换出来，由引发体合成新的引物，然后进行新的岗崎片段的合成。由此模型不难看出：随从链的合成需要周期性的引发，因此其合成进度总是与前导链相差一个岗崎片段的长度。第五讲DNA的复制岗崎片段完成后，其5′端的RNA引物由DNapolⅠ的5′→3′外切酶活性切除，由此造成的空隙再由DNApolⅠ的5′→3′聚合活性催化dNTP得到填补。所以DNA的复制是在DNapolⅢ和DNApolⅠ互相配合下完成的。第五讲DNA的复制原核DNA聚合酶（E.coli)聚合酶Ⅰ聚合酶Ⅱ聚合酶Ⅲ5´→3´聚合酶活性3´→5´外切酶活性5´→3´外切酶活性作用+++DNA损伤的修复和冈崎片段之间间隙的填补，实践上其产生的“缺口平移”（nicktrans-lation）技术也用于分子杂交时的核酸分子探针的标记++-DNA的修复++-DNA复制中子链的延长，为主导聚合酶第五讲DNA的复制（2）、真核生物DNA聚合酶1）、DNA聚合酶α2）、DNA聚合酶β3）、DNA聚合酶γ第五讲DNA的复制2）、DNA聚合酶β

它能以人工合成的多聚脱氧核糖核苷酸为模板，而以适当的寡聚脱氧核糖核酸链为引物合成DNA。此酶活性水平稳定，可能主要在DNA损伤的修复中起作用。1）、DNA聚合酶α是真核生物的复制酶，它在细胞内的活性变化与DNA复制有明显的平行关系，在细胞分裂的S期达到高峰。第五讲DNA的复制3）、DNA聚合酶γ它能有效利用人工合成的多聚核糖核酸作为模板，以脱氧核糖核酸链为引物合成DNA，但不是反转录酶。它在分裂细胞中的活性有明显的变化，细胞进入S期后，它活性升高2倍，然后回到正常水平。它可能在分裂细胞DNA复制调控方面起作用。第五讲DNA的复制2、与超螺旋松驰有关的酶

DNA复制从起始点开始向一个方向复制时，局部的DNA双链必须打开，主要靠解链酶的作用，打开后的单链还需要单链结合蛋白与其结合，在复制叉向前移动时造成其前方DNA分子所产生的正超螺旋，必须由拓扑异构酶来解决。下面分别介绍它们的作用。第五讲DNA的复制拓扑异构酶(topoisomerase)是一类改变DNA拓扑性质的酶。在体外可催化DNA的各种拓扑异构化反应。而在生物体内它们可能参与DNA的复制与转录。在DNA复制时，复制叉行进的前方DNA分子部分产生有正超螺旋，拓扑酶可松驰超螺旋，有利于复制叉的前进及DNA的合成。DNA复制完成后，拓扑酶又可将DNA分子引入超螺旋，使DNA缠绕、折叠，压缩以形成染色质。

第五讲DNA的复制（四）、DNA复制的终止阶段DNA在复制过程中，合成出的前导链为一条连续的长链。随从链则是由合成出许多相邻的片段，在连接酶的催化下，连接成为一条长链。连接作用是在连接酶催化下进行的。第五讲DNA的复制连接酶(ligase)的作用是催化相邻的DNA片段以3′、5′－磷酸二酯键相连接。连接反应中的能量来自ATP(或NAD＋)。连接酶先与ATP作用，以共价键相连生成E-AMP中间体。中间体即与一个DNA片段的5′－磷酸相连接形成E-AMP-5′－DNA。然后再与另一个DNA片段的3′-OHH末端作用，E和AMP脱下，两个DNA片段以3′、5′磷酸二酯键相连接。随从链的各个DNA片段就是这样连接成一条DNA长链。

第五讲DNA的复制第五讲DNA的复制已有研究证明大肠杆菌染色体DNA有复制终止位点此处可以结合一种特异的蛋白质分子叫做Tus，这个蛋白质可能是通过阻止解链酶(Helicase)的解链活性而终止复制的。详细的机制还不完全清楚。DNA复制完成后，靠拓扑酶将DNA分子引入超螺旋结构。

第五讲DNA的复制（五）、复制的几种主要方式1、线状DNA双链的复制；2、环状DNA双链的复制：1）型复制；2）滚环型复制；3）D-环型；第五讲DNA的复制1、线状DNA双链的复制线状双链DNA上复制叉生长方式有单一起始点或多个起始点，在此形成复制眼，从复制眼开始复制叉可以单向(如腺病毒)及双向(如T7)。真核生物都为多复制眼起始的双向复制。第五讲DNA的复制2、环形DNA双链的复制－型大肠杆菌DNA环状分子半保留复制的中间产物就是

型。复制的起点涉及到DNA双链的解旋和松开，形成两个方向相反的复制叉。复制从ori开始以顺时针和逆时针双向进行时，复制的中间产物在电镜下表现为型。第五讲DNA的复制2、环形DNA双链的复制－滚环型环形DNA双链复制的一种，为单向复制。复制过程中，首先形成共价闭环的双链分子（RF型），然后其正链由一核酸内切酶在特定位置切开，游离出3‘羟基和5’磷酸基。5‘磷酸末端在酶的作用下固着在细胞膜上，随后在DNA聚合酶的作用下，以环状负链为模板，从正链的3’羟基末端加入脱氧核苷酸，使链不断延长，通过滚环形成新的正链。第五讲DNA的复制2、环形DNA双链的复制－D环型单向复制：双链环在固定点进行复制，但两条链的合成高度不对称，一条链先复制，另一条链保持单链而被取代，在电镜下呈D环形状。待一条链复制到一定程度，露出另一条链的复制起点，另一条链才开始复制。这表明：两条链的复制起点并不总在同一点上，当两条链的起点分开一定距离时就产生D-环复制。第五讲DNA的复制（六）、真核生物DNA的复制

1、真核生物与原核生物DNA复制的区别2、端粒和端粒酶第五讲DNA的复制（六）、真核生物DNA的复制

1、真核生物与原核生物DNA复制的区别（1）、真核生物有多个复制起点（2）、真核生物的染色体在全部完成之前，各个起点上DNA的复制不能再开始，而快速生长的原核生物种，复制起点上可以连续开始新的DNA复制，表现为虽只有一个复制单元，但可以有多个复制叉。第五讲DNA的复制（六）、真核生物DNA的复制

2、端粒和端粒酶1）、端粒2）、端粒酶3）、端粒与衰老4）、端粒酶与肿瘤第五讲DNA的复制2、端粒和端粒酶第五讲DNA的复制端粒端粒：真核生物线性染色体3末端的一种特殊结构。核苷酸重复序列富含G，和端粒结合蛋白组成核蛋白复合物。人的DNA端粒含有TTAGGG重复序列，长度5~15kb。作用：A保护染色体末端免于化学修饰或核酸酶降解；B解决染色体复制时末端丢失问题端粒酶能将端粒加到DNA末端的核糖核蛋白复合物，由多条肽链与一个RNA分子组成，端粒酶的蛋白质组分具有模板和逆转录酶的作用，但其逆转录酶活性只限于应用端粒酶特异的RNA作为模板。第五讲DNA的复制端粒酶第五讲DNA的复制端粒与衰老

实验：在无端粒酶活性的成纤维细胞中表达端粒酶时，端粒的缩短和细胞的衰老都受到抑制。结论：细胞的衰老是由端粒驱动的。体外培养的细胞端粒的长度随细胞逐代相传而缩短，丢失到一定程度便失去对染色体的保护作用。细胞随之发生衰老和死亡。第五讲DNA的复制端粒与衰老可把端粒看成一面钟，端粒的长度是钟上的刻度，记载了细胞分裂的次数，称为“端粒钟”，或有丝分裂钟或“生命的时钟”，可通过测定端粒的长度预测细胞的寿命。胚胎细胞和生殖细胞端粒的长度并不随细胞分裂次数的增加而缩短，具有无限的分裂能力，原因在于端粒酶的存在。第五讲DNA的复制端粒与肿瘤人体内除了生殖细胞和少数一些体细胞如淋巴细胞等细胞外，绝大多数体细胞中无法检测到端粒酶的活性，而在多数肿瘤细胞中能检测到端粒酶的活性。肿瘤的端粒长度很短，其继续缩短导致染色体融合、细胞死亡，而端粒酶的激活可以维持端粒的长度，维持肿瘤的继续分裂、增殖。端粒酶的表达可能是肿瘤形成和发展的共同途径。第五讲DNA的复制端粒酶与恶性肿瘤之间有相关性使之在肿瘤的诊断和治疗上有望成为新的靶目标。可以通过各种途径抑制端粒酶的活性有效抑制大多数肿瘤的生长，而对正常细胞没有影响。第五讲DNA的复制二、逆转录酶（一）、逆转录酶的发现（二）、逆转录酶的性质（三）、逆转录酶的功能（四）、逆转录酶的基因组复制（五）、逆转录酶的生物学意义第五讲DNA的复制（一）、逆转录酶的发现1964年，Temin发现Rous肉瘤病毒等RNA病毒所造成的感染可被DNA合成抑制剂遏制。表明：RNA肿瘤病毒的RNA复制过程中要合成DNA。Temin又发现放线菌素D能抑制致癌RNA病毒的复制，但不能抑制一般RNA病毒的复制。表明：转录对于RNA病毒增殖是必需的。第五讲DNA的复制Temin提出前病毒假说：原病毒DNA是RNA肿瘤病毒在复制和致癌中的中间物。1970年，Temin在Rouse肉瘤病毒、Baltimore在白血病病毒中发现逆转录酶。第五讲DNA的复制（二）、逆转录酶的性质

它是由α亚基和β亚基组成，含有锌离子；

DNA合成反应要求有模板和引物；以四种脱氧核苷三磷酸为底物；DNA合成方向也为5’－3’；需要适当浓度的镁离子和还原剂。第五讲DNA的复制（三）、逆转录酶的功能RNA指导的DNA聚合酶活性；DNA指导的DNA聚合酶活性；核糖核酸酶H的活力；沿3’－5’和5’－3’两个方向核酸外切酶的活力。第五讲DNA的复制（四）、逆转录病毒的基因组复制过程1、由病毒（＋）RNA作为模板合成互补的（－）DNA链；2、切除RNA-DNA杂种分子中的RNA，然后由（－）DNA链作为模板合成（＋）

DNA；3、形成双链DNA；第五讲DNA的复制第五讲DNA的复制第五讲DNA的复制第五讲DNA的复制乙肝病毒基因组的复制其复制需通过逆转录过程经RNA中间体实现，其DNA聚合酶也是一种逆转录酶。第五讲DNA的复制第五讲DNA的复制逆转录病毒：RNA→DNA→RNA乙肝病毒：DNA→RNA→DNA第五讲DNA的复制试管内cDNA的合成常用于获得或研究真核生物基因的方法。提取某一种特定的mRNA，经逆转录生成的cDNA可代表某一特定基因。常用的逆转录酶有两种：来自鸟类成髓细胞瘤逆转录病毒称为AMV-RT；来自鼠白血病毒称为MMLV-RT。第五讲DNA的复制第五讲DNA的复制病毒RNA复制的主要方式1、病毒含有正链RNA，如灰质炎病毒。RNA（+）→蛋白质（酶）→RNA复制2、病毒含有负链RNA和复制酶如狂犬病毒。RNA（—）→RNA（+）→蛋白质、复制病毒RNA。3、病毒含有双链RNA和复制酶。如呼肠孤。双链RNA→RNA（+）→蛋白质→RNA（—）→双链RNA4、逆转录病毒。第五讲DNA的复制（五）、逆转录病毒的生物学意义1、逆转录酶存在于所有致癌病毒RNA中。它的存在与RNA病毒引起细胞恶性转化有关。了解逆转录的过程，有助于人们对RNA病毒致癌机制的了解，并对防治肿瘤提供了重要线索。2、常用于获得或研究真核生物基因的方法。几乎所有真核生物mRNA分子3’端都有一段多聚腺苷酸，因此加入寡聚dT后，mRNA就可以成为逆转录酶很好的模板。利用这一方法能够合成出相应于一定mRNA的互补DNA。第五讲DNA的复制三、DNA的转座通常认为基因组是相对稳定的，变化只是在漫长的进化过程中发生。同总的稳定性相反，由于多态变异体的存在，在分子水平上，每个个体基因组之间具有明显的差异性。这个差异产生的主要原因之一，是被称为转座的一种机制。第五讲DNA的复制转座子：是存在于染色体DNA上可自主复制和位移的基本单位。它的标志是它不以独立的形式存在，而在基因组内由一个部位直接转移到另一个部位。转座：一个转座子由基因组的一个位置转移到另一个位置的过程。转座酶：促进转座的酶称为转座酶，转座子常常编码自己的转座酶，并且每次移动时携带转座必须的基因一起在基因内跃迁，所以转座子又称为跳跃基因。第五讲DNA的复制转座是以很低的频率发生，而且转座子的插入是随机的，不依赖于转座子与靶位点之间任何序列的同源性。转座子有时插入到一个结构基因或基因调节序列内并引起基因表达的改变。有时，转座子也引起基因组序列的重排。研究转座子的意义不仅在于其涉及到DNA的操作机制，它们的移动性也和进化有关，在基因组内，它们也许是突变的主要来源。第五讲DNA的复制三、DNA的转座

（一）转座子的类型（二）转座发生的机制（三）转座作用的遗传效应第五讲DNA的复制（一）转座子的类型

1、插入序列2、复合式转座子第五讲DNA的复制1、插入序列（IS）最早被鉴定出来的转座元件是细菌操纵子中的自主插入序列。这种插入阻止了插入部位基因的转录和翻译。类型：前缀IS＋数字转座子常常被定位到特定的基因中，造成该基因突变。科学上用标准命名法对这些突变进行编号，如λ：IS1表示有一个IS1序列插入到λ噬菌体基因组内。第五讲DNA的复制（1）、IS元件的结构特征

IS是独立的结构单位，每个元件只编码为自身转座所需的蛋白质。每种IS元件在序列上皆是不同的，但在结构上具有一些共同的特征。1）、末端的反向重复序列2）、编码区3）、靶位点的正向重复区第五讲DNA的复制1）、末端的反向重复序列123456789---------987654321123456789---------987654321所以类型的转座子的转座皆需末端识别，末端被与转座有关的转座酶识别。

第五讲DNA的复制2）、编码区除IS1外，所有的IS元件皆含有一个单一的长编码区，其起始于一端的反向