生物制药动物组织中核酸的提取与鉴定

生物制药动物组织中核酸的提取与鉴定核酸的含量与细胞的大小无关，所以制备核酸时常采用生长较旺盛的组织，如胰、脾、胸腺、肝等。这类组织比同样体积的其他组织，如肌肉脑等组织含有更多的细胞数，因而就有更高的核酸含量。动物组织细胞中的核糖核酸(RNA)与脱氧核糖孩酸(DNA)大部分与蛋白质结合形成核蛋白。核蛋白可被三氯醋酸沉淀，再用95％乙醇加热可以除去附着在沉淀上的脂类杂质，然后用10％NaCl溶液提取出核酸的钠盐，加入醇可使核酸钠沉淀析出。先用水由动物肝中提出核蛋白，再籍酚将核酸与蛋白质之间的结合键断裂，并用乙醚抽提去蛋白质及其它杂质，最后用乙醇将核酸沉淀。核酸(RNA、DNA)可被硫酸水解产生磷酸。有机碱（嘌岭、嘧啶）和戊糖（核糖、脱氧核糖）。此三类化合物可用下列方法鉴定之。1、磷酸：能与钼酸试剂作用生成磷钼酸，后者在还原剂的作用下。还原成兰色的钼兰。常用的还原剂有氨基苯磺酸、氯化亚锡，维生素C等。H3PO4＋12H2MoO4→H3PO4·12MoO3+12H2OH3PO4·12MoO3H3PO4·6MoO3·3Mo2O52、嘌呤碱：能与苦味酸作用形成针状结晶3、戊糖：(1)核糖：经与强酸(盐酸与硫酸)共热生成糠醛，后者可与3;5二羟甲基苯缩合成绿色化合物。(2)脱氧核糖：在强酸中加热，可生成ω—羟基γ—酮基戊醛，后者再与二苯胺作用生成一蓝色化合物。1、钼酸试剂，称取钼酸铵5克，溶于100ml蒸馏水中，再加入浓硫硫15ml待冷却后加蒸馏水至1000ml，此试剂可置阴凉处保质一月。2、拜耳（Bial）氏试剂：称取1.5克3，5一二羟甲苯，加入浓盐酸50ml。再加10％三氯化铁20—30滴，贮于冰箱。此试剂应在临用前配制。3、二苯胺试剂：称取纯二苯胺lg溶于1000ml的冰醋酸中，加入浓硫酸2.75ml，贮于棕色瓶中，此试剂亦需临用前配制。4、3.5一二轻甲苯5、95%乙醇，10%NaCl溶液,20%三氯醋酸。6、氨基奈酚磺酸：商品氨基奈酚磺酸(1，2，4-Amino-naphtholSulfonicAcid)为暗灰色。用下法提纯后使用:在100ml蒸馏水中(90℃)溶解15g亚硫酸氢钠及1g亚硫酸钠，加入1.5g商品氨基奈酚磺酸，搅拌使大部分溶解(仅少量杂质不溶解)，趁热过滤，再迅速使滤液冷却。加入lml浓盐酸，则有白色氨基奈酚磺酸沉淀析出。过滤并洗涤固体数次。再用乙醇洗涤直到纯白色为止。最后用乙醚洗涤，并将固体放在暗处，使乙醚挥发。将此提纯的氨基奈酚磺酸保存于棕色瓶中备用。（1）取猪肝，称重，按每克肝脏4ml比例加入1％三氯醋酸，制成肝匀浆。每组量取肝匀浆5ml于带塞离心管中，3000转／分离心5分钟。（2）将离心后的上清液倾去，于沉淀中加95％乙醇5ml充分混匀，在水浴中加热至沸2分钟，注意酒精沸腾后将火关小，避免酒精蒸汽燃烧。冷却后离心。（3）倾去上层乙醇液。于沉淀中再加入10％NaCI溶液4ml，置沸水浴中8分钟，并用玻棒不断搅拌，取出；冷却后再离心，（4）将上清液倾入另一离心管中，再离心一次，除去可能存在的微量残渣，将上清液倒入一试管。取等量95％的乙醇，逐滴加入到上清液中，即可见白色沉淀逐渐出现，静置10分钟后。将其内容物摇匀后倒入一圆底离心管中，离心5分钟，将上液倾去，所得白色沉淀即为核酸钠。核酸的水解：在有核酸沉淀的离心管中加入蒸馏水2ml。振摇至沉淀溶解后，加入10％H2SO42mL摇匀，于沸水浴中加热10分钟，即得核酸水解液，用流水冷却后进行下列定性试验。1、嘌呤碱的鉴定取中试管2支，分别标明测定管与对照管，依次加入下列各试剂。管号水解液5%H2SO4浓氨水5%AgNO3测定管20滴对照管-

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20滴10滴10滴10滴10滴加入AgNO3后，置沸水浴中5分钟，观察两管颜色有何变化。2、磷酸的鉴定取水试管2支，分别标明测定管与对照管，然后依次加入下列各试剂。管号水解液5%H2SO4钼酸铵试剂氨（基）萘酚磺酸测定管10滴10滴-

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5滴5滴10滴10滴对照管充分混匀，放置3分钟，再置于沸水浴中3分钟，比较两管颜色。3、核糖的鉴定取中试管2支，分别标明测定管与对照管，然后依次加入下列各试剂。对照管管号测定管水解液5%H2SO43，5-二羟甲苯试齐4滴-

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6滴6滴4滴将两试管放入沸水浴内加热5分钟，比较两管之颜色。4、脱氧核糖的鉴定取长试