细胞传代培养-自助学习

细胞培

养培养细胞的观察自主查阅（课后）（1）细胞的常规观察主要包括哪些项目？（2）体外培养的细胞生长方式如何？（3）体外培养的细胞生长过程如何？（4）体外培养的细胞有何形态？（5）细胞培养的污染途径有哪些？如何排除 ？细胞培养培养细胞的常规观察项目细胞培养1.培养液颜色及清亮度：肉眼观察培养液颜色的变化反映培养液pH值的变化培养液的清亮度反映培养液是否被微生物污染2.细胞生长状态：倒置显微镜观察3.

细胞形态：倒置显微镜或相差显微镜观察4.微生物污染：肉眼观察或镜检1、培养液的变化培养瓶刷洗不洁，残留碱性物质，致营养液pH值升高，颜色变紫红色细胞代谢旺盛，酸性物质积累，致营养液pH值下降，颜色变黄。新鲜RPMI－1640培养液呈橙红色（pH7.2左右），适合细胞生长。细胞培养贴附生长：必须贴附于支持物表面才能生长(这种细胞称为贴壁依赖性细胞)。大多数细胞是这种生长方式。这类细胞存在接触抑止和密度依赖性的生长特性。2.培养细胞的生长方式细胞培养悬浮生长：于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面(这种细胞称为非贴壁依赖性细胞)

。如某些癌细胞和血液白细胞。细胞悬浮生长时胞体为圆形。细胞培养兼具上述两种生长方式的细胞，称为兼性贴壁细胞，如CHO细胞3.培养细胞的生长过程（1）培养细胞的生命期所谓培养细胞的生命期，是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。大致可分为以下三个阶段：原代培养期：也称初代培养，即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，一般持续1一4周。传代期：初代培养细胞一经传代后便改称做细胞系。一般情况下当传代10～50次左右，细胞增殖逐渐缓慢，以至完全停止，细胞进入衰退期。衰退期：此期细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；细胞形态轮廓增强，最后衰退凋亡。细胞培养细胞培养（2）一代贴附生长细胞的生长过程“一代”指的是从细胞接种到下一次再传代接种的一段时间潜伏期：游离期：细胞接种后在培养液中呈悬浮状态．此时胞体呈圆球形。一般

10分钟一4小时。贴壁期：贴附底物,一般24小时内贴壁。潜伏期：此时细胞有生长活动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为6～24小时。对数生长期：细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。停滞期（平台期）：细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂。机制：接触抑制、密度依赖性培养细胞贴壁过程停滞期跟生命期中的衰退期是一回事吗？细胞培养培养细胞的形态，主要可分为以下四种类型：成纤维细胞型：上皮细胞型：游走细胞型：多型细胞型：不常见细胞培养常见4.培养细胞的形态此细胞形态与体内成纤维细胞的相似而得名，胞体呈梭形或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质向外伸出２～３个长短不齐的突起。成群细胞呈放射状、旋涡状等形式，除真正的成纤维细胞外，心肌、平滑肌、成骨细胞、血管内皮等细胞常呈此形态。成纤维细胞型细胞培养本型细胞呈扁平、不规则多角形，中有圆形核。细胞彼此紧密相连，因为相互拥挤而呈现“铺路石”状，皮肤表层、消化层上皮、肝、胰、肺泡上皮等皆呈上皮型形态。上皮细胞型细胞培养5.培养细胞的微生物污染细胞培养（1）污染途径：操作室环境不佳清洗消毒不彻底无菌操作技术不当培养液配制不过关血清污染组织或细胞污染微生物污染细菌污染真菌污染支原体污染病毒污染化学污染（2）污染的检测及排除：细胞培养细菌污染检测肉眼直接观察法：培养液浑浊或细胞生长缓慢。培养检查法：用肉汤培养基或琼脂培养基37度培养待检样品数日，观察肉汤培养基有无浑浊，或琼脂培养基有无菌落形成。显微镜观察法：镜下可见大量菌体细胞培养a.微生物污染的检测常见细菌形态细胞培养白色念珠球菌污染细胞培养真菌污染的检测肉眼直接观察法：大多呈白色或浅黄色小点漂浮于培养液表面显微镜观察法：镜下可见丝状、管状或树枝状菌丝，纵横交错。念珠菌或酵母菌形态呈卵圆形。细胞培养常见真菌形态细胞培养真菌污染的成纤维细胞细胞培养支原体污染的检测特点：大小介于0.2-2

µm，约1%可通过滤菌器。青霉素无效。最常见，主要来源为操作者和血清。不易察觉，给人“正常”的感觉：被支原体污染后培养液不浑浊，细胞无明显变化。严重时，细胞增殖缓慢、脱落。对热较敏感。细胞培养支原体污染电镜照片细胞培养支原体污染的检测细胞培养相差显微镜观察法：直接培养支原体于培养基中，培养3－5星期，观察其生长及菌落生成。DNA荧光染色法：利用荧光染剂（bisbenzimide,Hoechst 33258）检测支原体污染。此染剂会结合到DNA的A-T 富集区域，因为支原体之DNA中A-T含量占多数（55～80%），所以可将其染色而检测。被支原体污染之细胞经染色后，在细胞核外与细胞周围可看到许多大小均一之荧光小点，即为支原体之DNA，证明有支原体之污染。病毒污染的检测细胞的直接观察动物接种检查电子显微镜观察细胞培养b.微生物污染的排除细胞培养细菌污染的排除抗生素对预防和杀灭细菌有一定效果。预防应用比污染后使用效果好。已发生细菌污染，再使用抗生素，常难根除。有价值的细胞被污染后，可试用5～10倍常用剂量，作用24～28小时，再换入常规培养液中，有时可奏效。支原体污染的排除细胞培养抗生素法：用100微克/毫升卡那霉素处理3周。高热处理法：将受污染的细胞41度作用5～10小时，最长18小时。联合使用抗生素法效果更好。血清处理法：将污染细胞接种到含10％非灭活血清培养基中，培养6小时。巨噬细胞吞噬法：将同种动物腹腔巨噬细胞加入被支原体污染的细胞中（巨噬细胞：污染细胞＝10