样品保存和相关设备

样品存贮及相关设备实验室基本仪器技术课程1样品保存和相关设备5/8/2024实验室样本保存的种类生物大分子（蛋白、核酸）细菌、酵母血液、组织其他（试剂、组织液等）细胞（贴壁、悬浮）2样品保存和相关设备5/8/2024生物大分子保存的主要因素温度（加速反应）水分（加速反应和霉变）光线（光化作用）空气（水分、氧气、微生物）PH值（稳定范围）时间（保存期限）3样品保存和相关设备5/8/2024⑴空气：空气的影响主要是潮解、微生物污染和自动氧化。空气中微生物的污染可使样品腐败变质，样品吸湿后会引起潮解变性，同时也为微生物污染提供了有利的条件。某些样品与空气中的氧接触会自发引起游离基链式反应，还原性强的样品易氧化变质和失活，如维生素C、巯基酶等。⑵温度：每种生物大分子都有其稳定的温度范围，温度升高10℃，氧化反应约加快数倍，酶促反应增加1～3倍。因此通常绝大多数样品都是低温保存，以抑制氧化、水解等化学反应和微生物的生成。⑶水份：包括样品本身所带的水份和由空气中吸收的水份。水可以参加水解、酶解、水合和加合。加速氧化、聚合、离解和霉变。⑷光线：某些生物大分子可以吸收一定波长的光，使分子活化不利于样品保存，尤其日光中的紫外线能量大，对生物大分子制品影响最大，样品受光催化的反应有变色、氧化和分解等，通称光化作用。因此样品通常都要避光保存。⑸样品的pH：保存液态样品时注意其稳定的pH范围，通常可从文献和手册中查得或做实验求得，因此正确选择保存液态样品的缓冲剂的种类和浓度就十分重要。⑹时间：生化和分子生物学样品不可能永久存活，不同的样品有其不同的有效期，因此，保存的样品必须写明日期，定期检查和处理。4样品保存和相关设备5/8/2024DNA保存

短期保存，加无菌水或TE缓冲液，4°或－20°。长期保存，刚提取好的DNA直接保存到乙醇里，放－20°或者-70°。需要用的时候，再离心后，弃去乙醇，加水或TE溶解即可。

DNA本来就是酸性，所以需要弱碱性环境保存，如果用中性或者酸性环境保存时间长容易降解。保存时间长会降解。所以还是要尽快的利用了。有文献报道高纯DNA的最佳保存条件是4度，提纯的DNA放在4°一段时间（数周-数月）都没问题。但是长期保存建议-20°或-70°，并且浓度不能太低。

5样品保存和相关设备5/8/2024RNA保存

保存RNA应该尽量低温。

若要长期保存,需沉淀下来后置于无水乙醇冻在-70度,用的时候再离心下来除去无水乙醇,用DEPC水溶解。为了防止痕量RNase的污染，从富含RNase的样品（如胰脏、肝脏）中分离到的RNA需要贮存在甲醛中以保存高质量的RNA，为了增加贮存RNA样品的稳定性，可以将RNA溶解在去离子的甲酰胺中，存于-70℃。RNA即使是放在-80度下也会降解，所以最好的保存方法是将RNA逆转成cDNA后保存。

提取的RNA保存在DEPC处理的水中，加入RNAse抑止剂，在-80度保存2个月，应该是可以保证不降解的。最好是反转录后保存。

6样品保存和相关设备5/8/2024蛋白质保存

选择什么样的贮存方法取决于该蛋白的稳定性和你打算保存多长时间以及下一步你打算如何利用。注意事项：蛋白溶液应避免极端的pH（强酸or强碱），同时也不能接近其等电点的pH。另外，还应该避免其他物质的掺入。

如果保存时间在24h以内，大多数蛋白可以放置到4℃。

如果保存时间在24h以上，应该考虑避免蛋白溶液长菌，可以事先过滤一下或者加入抑菌的物质（如叠氮化钠）。

7样品保存和相关设备5/8/2024蛋白质有什么比较实用的保存方法?1.冻成干粉，低温保存。

2.甘油+防腐剂，低温保存，甘油浓度5%~50%，防腐剂一般选择NaN3（叠氮化钠），但对于氧化酶类的蛋白，不能使用NaN3，会影响蛋白活性，推荐不加防腐剂，或者改加PMSF（苯甲基磺酰氟）。

如果抗体用于染色或处理活细胞，用于体内研究：叠氮化钠在抵抗微生物的同时，对其它大部分有机物也是有毒的，因为它阻断了线粒体的细胞色素电子转运。

大多数的蛋白、RNA酶抑制剂都是致癌或潜在致癌的，因为它有可能阻碍体内蛋白、RNA的正常更替。

PMSF通过与蛋白质的serine残基结合而达到抑制serine蛋白酶的作用。

检测用的粗蛋白，全蛋白当然可以分装低温保存，制备级最好是冻干，-80度存放，但经常使用的（比如抗血清、纯化的酶）最好采取公司商品化酶类的保存方法，就是50%甘油+低温，即保证了低温，甘油又保证了整个体系不会结晶，避免了反复冻融，而且甘油有稳定蛋白活性的作用。8样品保存和相关设备5/8/2024关于叠氮化钠的使用

为了防止微生物污染，叠氮化钠经常被加入到抗体中（终浓度0.02%(w/v)）。

在下述情况中不能使用叠氮化钠：（1）如果抗体用于染色或处理活细胞，用于体内研究：叠氮化钠在抵抗微生物的同时，对其它大部分有机物也是有毒的，因为它阻断了线粒体的细胞色素电子转运。（2）要偶联带有氨基基团的抗体：叠氮化钠会干扰任何含有氨基基团的偶联，因此在进行偶联之前，应将叠氮化钠去除。偶联后的抗体可以加入叠氮化钠保存，但是浓度只能是0.01%。

9样品保存和相关设备5/8/2024蛋白保存的注意事项

在4度下顶多保存一个礼拜。在-20度最长保存一个月。如果打算保存数月之久，要加入一定量甘油，避免“冻伤”。最好的保存办法还是将蛋白样品冻干成粉末，放置-80度冰箱。冻干在大多数情况下可以很好地保存蛋白的活性，但不适于某些蛋白（因有些蛋白对冻干重溶时必然产生的盐离子浓度的急剧变化反应不佳，其活性会永久丧失。蛋白样品最忌讳反复冻融。为避免多次冻溶致使蛋白活性降低或变性，应该将蛋白溶液分装保存，一次用多少就取多少。除此之外，还可以加入一些甘油(5-50%(w/v))或者血清(10mg/ml)帮助目的蛋白保持稳定。尽量将蛋白保存在冰箱里层，而不是门上。

10样品保存和相关设备5/8/2024抗体的保存

绝大多数已稀释的抗体应存在4℃-8℃条件下，以免冻融对抗体蛋白产生有害效应。抗体原液和已分离的免疫球蛋白组分应保存于-20℃条件下，并避免反复冻融。反复冻融会导致抗体变性，导致多聚体形成冷冻的抗体溶液应置于室温中缓慢地解冻，应绝对避免用高温快速解冻。

被细菌污染的抗体常会出现假阳性结果，应将污染的抗体溶液及其他试剂弃之。为防止细菌污染，可于抗体溶液中加入0.01%叠氮钠。抗体经真空冷冻干燥后置-20℃以下可保存3-5年。

除非特别要求-20℃冻存，一般4℃可稳定一年（无菌，如加叠氮钠），因为抗体是一种具有非常稳定结构的蛋白；要求具有活性的蛋白,最好根据需要分装保存4℃(一周）、-20℃(一个月)、-80℃(六个月)、液氮（基本无限期）特殊抗体的保存条件：1.酶联抗体：永远保存在4度，避免冻起来。否则会导致酶活性的下降或者丧失。2.偶联抗体：所有偶联抗体都是在棕色管中或使用锡箔纸避光保存。尤其是荧光抗体，对光极为敏感，因此在所有的实验阶段也是要避光操作的！3.IgG3的同型对照：永远保存在4度，避免冻起来。因为如果出现冻融过程，该抗体非常容易形成多聚体。无论是保存还是运输，绝对避免反复冻融！反复冻融会导致抗体变性，导致多聚体形成，从而降低抗体的结合能力！

11样品保存和相关设备5/8/2024

菌种保藏的原理和方法一、菌种保藏的目的

保存、不退化二、菌种保藏的原理

DNA复制时自发突变是造成菌种退化的原因，因此要创造代谢不活泼的状态。

休眠态（孢子、芽孢）代谢不活泼的状态环境（干燥、低温、缺氧、缺营养）12样品保存和相关设备5/8/2024真空冷冻干燥保藏法

目前常用的较理想的一种方法。其基本原理是在较低温度下，（-18℃），快速地将细胞冻结，并且保持细胞完整，然后在真空中使水分升华。在这样的环境中，微生物的生长和代谢都暂时停止，不易发生变异。一般可保存5~10年左右。液氮超低温保藏法

液氮超低温保藏技术是将菌种保藏在-196℃的液态氮，或在-150℃的氮气中的长期保藏方法，它的原理是利用微生物在-130℃以下新陈代谢趋于停止而有效地保藏微生物。是适用范围最广的微生物保藏法，其保存期最长。因为液氮的温度可达-196℃，远远低于菌种新陈代谢作用停止的温度（-130℃），故此时代谢活动已停止。保藏期一般为2~3年，长的可达9年之久。13样品保存和相关设备5/8/2024-80℃低温冷冻保藏

将菌种保藏在-80℃冰箱中以减缓细胞的生理活动进行冷冻的一种保藏方法。

在最适宜的培养条件下将细胞培养至静止期或成熟期，进行纯度检查后，与保护剂混合均匀，分装（分装时应注意在无菌条件下操作)。将安瓿管或塑料冻存管置于-80℃冰箱中保藏。

复苏方法

从冰箱中取出安瓿管或塑料冻存管，应立即放置38℃-40℃水浴中快速复苏并适当快速摇动。直到内部结冰全部溶解为止，约需50秒-100秒。开启安瓿管或塑料冻存管，将内容物移至适宜的培养基上进行培养。

14样品保存和相关设备5/8/2024

细胞的冻存

按照冷冻保护液在冻结后是否形成冰晶来划分为两种。若降温速率过快，则形成胞内冰，这些胞内冰在复温过程中会发生再结晶使细胞受损;若降温速率过慢，则细胞收缩过剧，并且细胞处在高浓度溶液中也会引起损伤。非玻璃化冻存是利用各种温级的冰箱分阶段降温至-70～-80度，然后直接投入液氮进行保存；或者是利用电子降温仪以及利用液氮的气、液，按一定的降温速率从室温降至-100度以下，再直接投入液氮保存的方法。以该种方法冻结的细胞悬液或多或少都有冰晶的形成。细胞在液氮中可长期冻存，而不会影响细胞活力；在-70度可保存数月。在将细胞冻存管投入液氮时，动作要小心、轻巧，以免液氮从液氮罐内溅出。若液氮溅出，可能对皮肤造成冻伤。冻存管宜采用塑料冻存管，不宜使用玻璃安瓿。因为在复苏时，需要从-196度的液氮中取出冻存管，立即投入37～40度温水中，温差很大，玻璃安瓿瓶容易爆炸而发生危险。冷存管置于4℃10～30分钟--->-20℃1～2小时--->-80℃4～12小时(或隔夜)--->液氮罐长期储存。玻璃化冻存则是指利用多种高浓度的冷冻保护剂联合形成的玻璃化冷冻保护液（丁二醇、丙二醇、二甲基亚砜（DMSO）、乙二醇、甘油等CPA及适量聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚乙二醇等高聚合物）保护悬浮细胞，直接投入液氮进行冻存的方法。以该中方法冻结的细胞悬液没有冰晶的形成。

15样品保存和相关设备5/8/2024实验室样本保存相关的设备真空冷冻干燥机4.液氮罐3.超低温冰箱、深冷冰箱2.普通冰箱、低温冰箱1.16样品保存和相关设备5/8/2024生物样本冷冻储存温度建议

17样品保存和相关设备5/8/2024各种生物样品的建议保存温度

18样品保存和相关设备5/8/2024冷冻技术•冷冻原理：冷冻过程对细胞和组织影响的主要来源于冰晶损伤和溶液渗透压损伤。若降温速率过快，则形成胞内冰，这些胞内冰在复温过程中会发生再结晶使细胞受损;若降温速率过慢，则细胞收缩过剧，并且细胞处在高浓度溶液中也会引起损伤。

19样品保存和相关设备5/8/2024内旋冻存管与外旋冻存管的使用区别•外旋冻存管是为超低温冰箱设计，不适用于液氮储存系统。液氮冻存容器推荐使用内旋冻存管。•内旋盖污染问题，通过单手操作解决使用梯度降温盒或程序降温仪减少对细胞的伤害•蛋白冻存使用急冻。细胞冻存需要缓慢降温，需要使用梯度降温盒或者更严格的程序降温仪。40C

-200C

-860C液氮会增加冻存过程中对细胞的伤害•微量离心管的管壁厚度和插拔式管盖均不适用于液氮系统，会出现大量炸管现象，造成样品的损失20样品保存和相关设备5/8/2024冻存操作的注意事项

•与液氮接触的样品需在操作时注意：•急冻或长期液氮储存的样品会接触到液氮•不建议用微量离心管•对管口进行密封，避免液氮渗透•液氮渗入的风险：炸管、样品间交叉污染•转移过程中注意使用冰盒•生物安全柜中操作冻存管：•单手操作，避免污染，解决静电、管子滑落等问题•用力适中，避免扭力过度造成脱丝，影响密封效果•注意做好标记：•管盖和管壁均做标记•推荐使用冷冻标签纸和低温记号笔

•21样品保存和相关设备5/8/202422样品保存和相关设备5/8/2024•注意做好个人防护，避免炸伤•护目镜、面罩、手套、防护服•尽量使用镊子•水浴锅/烧杯上覆盖毛巾样品复苏时的注意事项

•样品复苏时：•对于未经保护的冻存管，切忌快速扔进水浴中•冻存管从液氮液相取出后必须在液氮气相中储存24h，这样可以使得液氮从冻存管中慢慢的蒸发和逃逸，从而降低冻存管中的压力。•冻存管从液氮液相取出后快速放置于-20度冰箱30min，再进行水浴复苏。•冻存管从液氮取出后，用手轻轻拧松管盖，使液氮蒸发后再进行水浴复苏。•对于不需水浴复苏的样品，建议取出后放置于0~-20度冰盒上，尽量避免发生挤压、碰撞、跌落。23样品保存和相关设备5/8/202424样品保存和相关设备5/8/2024•提高冰箱空间使用率：•在冰箱中制作必要的支架•使用冻存盒，替代各种手套、袋子、板架•采用节省空间的冻存管•对于长期储存的重要样品：•实验室重要的菌种、组织、蛋白等样品做好标记冰箱存放样品的建议

25样品保存和相关设备5/8/2024超低温冰箱的注意事项

必须静置冷柜至少24小时以上才能通电。空箱不放入物品，通电开机，分阶段使冷柜先降温至﹣40度，正常开停后再降到﹣60度，正常开停8小时后再调到﹣80度，观察冷柜有正常开停24小时以上。证明冷柜性能正常。可以向冷柜内存放物品。原则上应存放﹣60度的物品，不超过1/3箱体容量。如果存放的物品温度高于﹣60度，应将冷柜温度设置在高于存放物品的温度3度左右(即，如果物品温度为20度，则将低温柜温度设定在23度)，保证冷柜停机，并有正常开停8个小时以上。禁止：所有低温保存箱均为保存设备，严禁一次性放入过多相对太热的物品，会造成压缩机长时间不停机，温度不下降且很容易烧毁压缩机。物品一定要分批放入，分阶梯温度降温，直至所需要的低温！存取样品时门开得不要过大，存取时间尽量要短。

26样品保存和相关设备5/8/2024液氮罐的安全使用

液氮贮存：液氮贮存种类一般可分为贮存罐、运输罐两种。贮存罐主要用于室内液氮的静置贮存，不宜在工作状态下作远距离运输使用；为了满足运输条件，运输罐主要有专项防震设计，除静置贮存外，还可在充装液氮状态下，作运输使用，但应避免剧烈的碰撞和震动；另外，在短时间、短距离内使用少量液氮时，也可以临时使用保温瓶（杯）等器具存放。

27样品保存和相关设备5/8/2024液氮罐使用注意事项

液氮罐的安全使用：正常情况下，液氮贮存在密封式