药学中的生物技术和方法抗体和免疫分析

药学中的生物技术和方法抗体和免疫分析抗体

---生物体自造的“magicbullet”医疗

直接或与毒素连结攻击

病变細胞研究

各种免疫分析第2页,共56页，2024年2月25日，星期天抗体药物销售趋势图第3页,共56页，2024年2月25日，星期天国际抗体药物2009年美国市场上的抗体药物成为生物技术药物销售额最大的类别。2010年美国市场的单抗药物销售额为185亿美元2011年，全球单抗药物的市场总量已经达到628亿美元，世界范围内的单抗药物销份额约是整个生物制药市场份额的36%。第4页,共56页，2024年2月25日，星期天国内抗体药物目前我国的上市抗体品种中,国外进口单抗占据多数2011年国内市场规模超过10亿元我国抗体药物产业化的主要限制因素：动物细胞大规模培养技术已成为各个国家生物医药产业化的核心竞争点抗体下游纯化成本已占45%到70%高质量纯化工艺研究刻不容缓QbD（质量源于设计）理念的应用第5页,共56页，2024年2月25日，星期天抗体偶联药物(AntibodyDrugConjugates，ADC)结合单克隆抗体的靶

向性和小分子药物的

高度细胞毒性，可以

有效地杀伤肿瘤细胞，

在临床前研究、甚至人体临床研究中，取得了良好的抗肿瘤效果，成为生物药物研究的热点领域之一;ADC药物为疾病的“精准医疗”提供有效的武器。抗体-药物偶联剂（ADCs）的研究进展与产业现状:/master/liuboning/584302.shtml第6页,共56页，2024年2月25日，星期天Antibodyandstructure特点：2个基因决定一个蛋白质与抗原的结合力强，高度专一性第7页,共56页，2024年2月25日，星期天抗原和抗原决定簇一个抗原分子上可能有数个抗原决定簇每個抗原决定簇至少誘生一种专一性抗体蛋白质抗原的决定簇含有六个以上氨基酸第8页,共56页，2024年2月25日，星期天

。

第9页,共56页，2024年2月25日，星期天克隆选择

学说第10页,共56页，2024年2月25日，星期天单抗和多抗多克隆抗体（polyclonalantibody）指由不同B细胞产生的针对多种抗原决定簇的多种抗体混合物，如免疫血清。单克隆抗体（monoclonalantibody）指由一种

B细胞生产，针对某一抗原决定簇的单一抗体。第11页,共56页，2024年2月25日，星期天Preparationofpolyclonalantibodies传统抗血清抗原免疫混合抗体123412341234免疫前要先把抗原作成乳剂约在两月內注射五到八次第12页,共56页，2024年2月25日，星期天Preparationofmonoclonalantibodies第13页,共56页，2024年2月25日，星期天Preparationofrecombinantantibodies淋巴细胞总RNA抗体轻、重链文库重组单链抗体基因轻、重单链基因大肠杆菌表达体系单链抗体第14页,共56页，2024年2月25日，星期天单链抗体在重链与轻链之间加上一段连接肽，连成一条单链如果仅是两条链的可变区，称为ScFv连接肽的长度在10-15个氨基酸左右，不宜太长或太短，它应具有柔软性，侧链少，抗原性弱等特点。常用的连接肽是GGGGS×3第15页,共56页，2024年2月25日，星期天Abasantigen-PrimaryandsecondaryantibodyPrimaryAbSecondaryAbPrimaryAbProteinA二抗针对一抗的物种特异性ProteinA针对所有动物抗体Fc第16页,共56页，2024年2月25日，星期天ImmunoassaysThemostimportantbiologicalassaysfor:Identificationofproteinsandsmallbio-moleculesQuantificationforcomplexbiologicalsamplewithoutseparationPowerfulseparationHighsensitivity,specificityandaccuracy

第17页,共56页，2024年2月25日，星期天抗体的标记方法放射性同位素标记酶标记荧光标记有机分子荧光标记绿色荧光蛋白标记稀土荧光标记通用标记第18页,共56页，2024年2月25日，星期天放射性碘标记第19页,共56页，2024年2月25日，星期天HRP酶标记简单化学偶联方法：

1．过碘酸钠法：

仅用于HRP的标记。HRP是一种糖蛋白，过碘酸钠可将与酶活性无关的多糖羟基氧化为醛基，再与抗体蛋白的游离氨基结合，结合反应后，再加人硼氢化钠(NaHB4)还原后，形成稳定的HRP—CH2—NH—IgG酶标记物。为防止酶蛋白氨基与醛基反应发生自身偶联，常在标记前知用二硝基氟苯(DNFB)封闭酶蛋白上的α和ε氨基。

2．戊二醛交联标记法：

戊二醛具有两个活性醛基，分别与酶分子和抗体分子上的氨基结合。NaHB4HRP第20页,共56页，2024年2月25日，星期天LabelingwithisoFITC第21页,共56页，2024年2月25日，星期天GFPlabelingGFPgeneScFvgeneVectorexpressionGFPgeneProteinAgeneVectorexpressionAb-Fc第22页,共56页，2024年2月25日，星期天通用标记+Avidin/streptA+Anti-digoxinAb2ndAbProteinAPrimaryAbPrimaryAb第23页,共56页，2024年2月25日，星期天ImportantassaysImmunostainingWesternblotFluorescentmicroscopyQuantificationofimmunostainingQuantitativeassays:Radioimmunoassay,RIA—competentbindingFluorescenceimmunoassay,FIAFPIA---homogeneousassayTRFIAEnzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA第24页,共56页，2024年2月25日，星期天ImmunostainingFluorescence/luminescenceColorizationor第25页,共56页，2024年2月25日，星期天组织切片或培养细胞单层细胞/组织固定免疫染色（荧光）显微镜观察第26页,共56页，2024年2月25日，星期天免疫荧光标记的c-Mycphalloidin荧光标记的微丝荧光染色的细胞核合成图像第27页,共56页，2024年2月25日，星期天Immunoblot---WesternBlot第28页,共56页，2024年2月25日，星期天ElectroblottinggelPVDFmembrane第29页,共56页，2024年2月25日，星期天Immunostaining封闭分析抗体显色抗体显色数字化灰度图像分析第30页,共56页，2024年2月25日，星期天0.51246812162430(h)c-mycp53CyclinD1Actin第31页,共56页，2024年2月25日，星期天CaNCaM:La3+HRPStreptAvidinBiotin第32页,共56页，2024年2月25日，星期天RIAAssay第33页,共56页，2024年2月25日，星期天免疫竞争结合分析---小分子抗原分析的基本方法Ag+AbAgAb+Ag

+

*

Ag

*AgAb+*Ag[*AgAb:Precipitant↓]放射性计数第34页,共56页，2024年2月25日，星期天常用分离沉淀技术盐析法：饱和硫酸铵、硫酸钠聚乙二醇法（w=6000）特点：快速，价廉，来源方便，受环境影响大抗体免疫沉淀法特点：分离完全，非特异结合小，环境影响小，效价高，但成本高固相吸附剂第35页,共56页，2024年2月25日，星期天RIA测量步骤恒量的*Ag、Ab加入反应管中加入待测样品、或标准品（已知浓度）37℃或4℃温育加入分离剂分离结合及游离部分测定以总放射性为分母，测定*AgAb为分子，计算结合%，以结合率为纵坐标，浓度为坐标，制作标准曲线待测样品的结合率从标准曲线上求出浓度第36页,共56页，2024年2月25日，星期天第37页,共56页，2024年2月25日，星期天Calibrationcurve第38页,共56页，2024年2月25日，星期天ELISA（EnzymeLinkedImmunoSorbentAssay）第39页,共56页，2024年2月25日，星期天SandwichELISA竞争法（略）第40页,共56页，2024年2月25日，星期天HighConvenienceHighSensitivity第41页,共56页，2024年2月25日，星期天96-wellplate包被封闭结合显色酶标仪测定hv洗涤洗涤洗涤终止第42页,共56页，2024年2月25日，星期天酶的底物

邻苯二胺(OPD)+H2O2

TMBABTSHRP的底物氧化产物(橙红色)492nm吸收2mol/L硫酸终止反应AP的底物硝基苯磷酸酯对硝基酚(黄色)NaOH终止反应

405nm吸收峰磷酸4-甲基伞酮（荧光底物）第43页,共56页，2024年2月25日，星期天荧光偏振免疫分析第44页,共56页，2024年2月25日，星期天Principleoffluorescencepolarizationemittingdipoleabsorbingdipole

excitationlightpolarizedalongzxzyI

I

detector第45页,共56页，2024年2月25日，星期天FluorescencepolarizationimmunoassayAg+AbAgAb+Ag

+

*

Ag

*AgAb+*Ag

HighpolarizedfluorescenceLowpolarizedfluorescence第46页,共56页，2024年2月25日，星期天偏振度r第47页,共56页，2024年2月25日，星期天时间分辨荧光免疫分析第48页,共56页，2024年