临床微生物检验基本技术标准操作规程

临床微生物检验基本技术标准操作规程

微生物检验实验室标本处理标准操作规程...................................137

微生物检验实验室标本接种标准操作规程...................................138

微生物检验实验室细菌鉴定操作规程.......................................139

微生物检验实验室不染色标本检查法标准操作规程.........................140

微生物检验实验室革兰染色标准操作规程...................................141

微生物检验实验室抗酸染色标准操作规程...................................142

微生物检验实验室墨汁染色标准操作规程...................................144

微生物检验实验室药物敏感试验标准操作规程...............................145

文件编号：

XXX医院检验科XXX-JY-CZ-WSW-0562

标本处理标准操作规

微生物检验实验室版本：20140601

程

作业指导书生效日期：20140615

共1页

1.目的

规范标本处理标准操作规程。

2.范围

临床微生物标本。

3.职责

微生物检验人员严格执行本程序。

4.程序

4.1血液标本、

接收标本后，立即对标本进行编号、登记。门诊病人要同时登记

住址、联系电话等信息。将血培养瓶置于全自动培养仪中培养。

4.2痰标本

4.2.1接收编号、登记后的痰标本，加入痰消化剂或无菌生理盐水

处理。

4.2.2用无菌棉签挑取标本分别涂布于血琼脂平板、巧克力琼脂平

板，麦康凯平板的第一区，然后用接种环划第二、第三区.....

4.2.3同时做痰涂片镜检。

4.3咽拭子标本涂布于血琼脂平板、巧克力琼脂平板、麦康凯平

板第一区，然后用接种环划第二区、第三区.....

4.4脑脊液、胸腹水等穿刺液床边抽取体液标本l-2ml注入多功

能体液培养瓶或需氧血培养瓶，即送实验室。接收标本后，立即对标

本进行编号、登记，置孵育箱培养。脑脊液标本需离心涂片检查。

4.5粪便或肛拭标本接收标本后，立即对标本进行编号、登记，

取粪便脓血部位标本根据检验申请单要求选择平板，立即接种。

4.6尿标本接收标本后，立即对标本进行编号、登记，将尿标本

混匀，用10ul定量接种环立即接种血琼脂平板、麦康凯平板，分离细

菌和菌落计数。

参考文献

[1]周庭银编著.临床微生物诊断与图解.第二版.上海：上海科学技

术出版社，2007

[2]叶应妩，王毓三，申子瑜主编.全国临床检验操作规程.第3版.

南京：东南大学出版社，2006

编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员

批准人：________

XXX医院检验科标本接收标准操作规文件编号：

微生物检验实验室程XXX-JY-CZ-WSW-0563

作业指导书版本：20140601

生效日期：20140615

共1页

1.目的

规范标本接种标准操作规程，确保检验结果准确可靠。

2.范围

微生物所有标本的接种。

3.职责

微生物检验人员严格执行本程序。

4.程序

4.1分区划线法

4.1.1此法多用于粪便等含菌量较多的标本。

4.1.2用接种环先将标本涂布在平板第一区并作数次划线，再在

二、三区依次用接种环划线。每划一个区域，应将接种环烧灼

1次，待冷却后再划下一个区域。每一个区域的划线应接触上一个区

域的接种环2-3次，使菌量逐渐减少，以形成单个菌落。

4.2斜注平板法

4.2.1本法用于尿液等标本的细菌计数。

4.2.2将灭菌生理盐水适量稀释的标本1mL置于灭菌平皿内，注

入已熔化并冷却至50℃左右的培养基15ml,混匀，待冷却后，倒置。

4.3斜面接种法

4.3.1此法主要用于鉴定或保存菌种，或观察细菌的某些生化特性

和动力。

4.3.2用左手握住菌种管和斜面培养管底部，右手持接种环。用右

手小指于手掌、小指于无名指分别拔出两管的棉塞，将管口通过火焰

灭菌。用接种环伸入菌种管内挑取移种之菌落。伸入斜面培养管内，

先从斜面底部到顶端拖一条接种线，再自下而上蜿蜒划线，或直接自

下而上蜿蜒划线。将接种环垂直插入半固体培养基的中央，穿刺至培

养基底部，然后穿刺线推出接种环。

4.4穿刺培养法

4.4.1此法用于保存菌种，观察动力及某些生化反应。

4.4.2以接种环挑取细菌培养物，插入半固体培养基的中央，穿刺

至培养基底部，然后沿原穿刺线退出接种环。

4.5液体培养基接种法用灭菌接种环挑取菌落或标本。在试管内

壁于液面交界处研磨，使细菌混匀在液体培养基中。

参考文献

[1]周庭银编著.临床微生物诊断与图解.第二版.上海：上海科学技

术出版社，2007

[2]叶应妩，王毓三，申子瑜主编.全国临床检验操作规程.第3版.

南京：东南大学出版社，2006

编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员

批准人：______

文件编号：

XXX-JY-CZ-WSW-056

XXX医院检验科

4

微生物检验实验室作细菌鉴定操作规程

版本:20140601

业指导书

生效日期:20140615

共1页

1.目的

规范细菌鉴定标准操作规程。

2.适用范围

革兰阴性菌、革兰阳性菌等。

3.职责

检验人员严格执行本程序。

4.程序

4.1观察菌落大小、颜色、气味、溶血、形态特征等，观察内容应

记录在《细菌鉴定流程表》。

4.2涂片，革兰染色，观察染色性及细菌形态、大小和排列，球

菌、杆菌或螺形菌等，观察内容记录在《细菌鉴定流程表》。

4.3初步生化反应根据菌落特征和涂片结果选择初步生化反

应，如氧化酶、触酶、凝固酶（玻片法）等。

4.4制定细菌鉴定方案

4.4.1仪器鉴定方案（以VITEK2为例）

革兰阴性杆菌：选择GN卡（阴性菌鉴定卡）。

革兰阳性球菌：选择GP卡（阳性菌鉴定卡）。

酵母菌：选择YST卡（酵母菌鉴定卡）。

需氧芽胞杆菌：选择BBL卡（需氧芽孑包杆菌卡）。

4.4.2手工细菌鉴定法

氧化酶阳性革兰阴性杆菌，选择非发酵鉴定生化反应组合：葡萄

糖O/F、木糖、麦芽糖、硝酸盐、动力、七叶昔等生化反应。

氧化酶阴性革兰阴性杆菌，选择肠杆菌科细菌鉴定生化反应组合:

触酶、硝酸盐、葡萄糖O/F、动力、乳糖、VP、口引噪、甲基红、枸椽

酸盐、精氨酸、鸟氨酸、赖氨酸等生化反应。

疑不动杆菌氧化酶阴性革兰阴性杆菌，选择非发酵鉴定生化反应

组合。

革兰阳性球菌，选择革兰阳性球菌鉴定生化反应组合：触酶、葡

萄糖O/F、胆汁七叶昔、蔗糖、木糖、甘露醇、硝酸盐、胭酶等。

参考文献

[1]周庭银编著.临床微生物学诊断与图解.第二版.上海：上海科学

技术出版社，2007

[2]王钦升，周正明，高屹主编.实用医学培养基手册.北京：人民军

医出版社，1999

编写人:AAA、BBB操作人：本室操作人员

批准人：________

文件编号：

XXX-JY-CZ-WSW-056

XXX医院检验科不染色标本检查法

5

微生物检验实验室作标准

版本：20140601

业指导书操作规程

生效日期：20140615

共1页

1.目的

规范不染色标本检查法标准操作规程。

2.范围

微生物不染色标本检查。

3.职责

微生物检验人员严格执行本程序。

4.程序

不然色标本检查法主要用于检查细菌的动力及运动状况。有鞭毛

的细菌，在显微镜下呈现活泼的运动，

4.1湿片法用接种环取细菌悬液或细菌培养液2环，置于清洁

载玻片中央，轻轻覆上盖玻片，于油镜下观察。制片时菌液要适量，

不可有气泡，不可外溢。

4.2悬滴法取洁净的凹窝载玻片及盖玻片各一块，将凹孔四周

的平面上涂薄薄一层凡士林，取1接种环菌液置盖玻片中央，将凹窝

载玻片的凹面向下，对准于盖玻片的液滴盖上，然后迅速翻转玻片，

用小镇子轻轻压，使盖玻片与凹孔边缘粘紧，使凡士林密封其边缘，

菌液不致挥发变干。镜下观察时，先用低倍镜，调成暗光，对准焦距

后以高倍镜观察，不可压碎盖玻片。有动力的细菌可见其从一处移动

到另一处，无动力的细菌呈现布朗运动而无位置改变。螺旋体由于菌

体纤细、透明，需用暗视野或位相显微镜观察其形态、活动。

4.3毛细管法主要用于检查厌氧菌的动力。以毛细管（长60〜

70mm，管径0.5〜1.0mm）接触培养物，让菌液吸入毛细管后，用火焰

将毛细管两端熔封，将毛细管固定在载玻片上，镜检。

参考文献

[1]周庭银编著.临床微生物学诊断与图解.第二版.上海：上海科学

技术出版社，2007

[2]王钦升，周正明，高屹主编.实用医学培养基手册.北京：人民军

医出版社，1999

（周庭银）

编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员

批准人：________

XXX医院检验科革兰染色标准操作规文件编号：

微生物检验实验室作程XXX-JY-CZ-WSW-056

业指导书6

版本：20140601

生效日期:20140615

共1页

1.目的

规范革兰染色标准操作规程。

2.原理

细菌样本先经紫色草酸盐结晶复合物染色,之后用Lugol-PVP媒染

剂处理以促进燃料与革兰染色阳性菌结合。经酒精-丙酮的脱色作用，

革兰染色阴性菌中的结晶紫会被洗脱。番红精则是作为复染剂：革兰

染色阴性的细菌呈现粉红色，而革兰染色阳性的细菌呈现紫色。o

3.试剂

3.1结晶紫草酸盐溶液结晶紫2%；酒精20%；草酸铁0.8%。

3.2稳定Lugol-PVP复合物碘1.3%；碘化钾2%；PVP（聚乙烯

此咯烷酮）10%o

3.3脱色剂95%酒精50%；丙酮50%。

3.4番红精溶液番红精0.25%；95%酒精10%。

4.质控

4.1采用大肠埃希菌ATCC25922质控菌株，每周1次，有室内质

控记录。

4.2采用金黄色葡萄球菌ATCC25923质控菌株，每周1次，有室

内质控记录。。

5.操作步骤

5.1初染第一液初染剂（结晶紫）染色1分钟，水洗。

5.2媒染第二液媒染液（碘液）染色1分钟，水洗。

5.3脱色第三液脱色剂（95%酒精）用到无紫色脱落为止，水洗。

5.4复染第四液复染剂（石碳酸复红或沙黄）染色30秒，水洗。

自然干燥后镜检。

6.结果判断

革兰阳性菌呈紫色，革兰阴性菌呈红色。

7.注意事项

7.1染色的结果常受操作者技术的影响，尤其是容易过度脱色，往

往阳性染成阴性。

7.2在同一载玻片上，需用已知金黄色葡萄球菌及大肠埃希菌作革

兰阳性及阴性对照。

7.3染色关键在于涂片和脱色，涂片不宜过厚，固定不宜过热，脱

色不宜过度。

7.4菌龄为18〜24小时为佳。

8.临床意义

8.1鉴定细菌可将细菌分为阳性和阴性两大类，因而可以初步识

别细菌，缩小范围，有利于进一步鉴定。

8.2选择药物革兰阳性菌与阴性菌的细胞壁结构有很大差别，因

而抗菌药物有差异。

参考文献

[1]周庭银编著.临床微生物学诊断与图解.第二版.上海：上海科学

技术出版社，2007

[2]王钦升，周正明，高屹主编.实用医学培养基手册.北京：人民军

医出版社，1999

（周庭银）

编写人:AAA、BBB操作人：本室操作人员

批准人：_______

XXX医院检验科抗酸染色标准操作文件编号：

微生物检验实验室作规程XXX-JY-CZ-WSW-056

业指导书7

版本：20140601

生效日期:20140615

共2页

1.目的

规范抗酸染色标准操作规程。

2.原理

抗酸菌具有耐受酸性介质脱色的生物状，此类细菌在石碳酸（苯酚）

的协同作用下，被复红染色剂着色，能够耐受酸性酒精脱色，显微镜

观察时保持紫色红色；而其他脱落细胞或标本中的非抗酸菌被酸性酒

精脱色，可被复染剂亚甲蓝染为蓝色。

3.试剂

3.1Kinyoun溶液。

碱性品红40g乙醇（95%）200ml

石碳酸80ml蒸储水1000ml

3.2Gabett溶液

亚甲蓝10g无水酒精300ml

硫酸200ml蒸储水500ml

4.质控

每天用龟分支杆菌ATCC93326做阳性对照，大肠埃希菌ATCC25922

做阴性对照。

5.操作步骤

5.1初染涂片上滴加石碳酸复红液，用火焰加热至产生蒸汽，约

5分钟，水洗。

5.2脱色第二液脱色约1分钟，轻轻摇动玻片，无红色脱色或略

呈粉红色时为止，水洗。

5.4复染第三液复染30秒，水洗。自然干燥后镜检。

6.结果判断

抗酸杆菌呈红色。

7.注意事项

7.1每张玻片只能涂一份标本，禁止将2份或2份以上的标本涂在

同一张载玻片上。

7.2为防止交叉感染，标本应先高压灭菌后再涂片染色。

7.3在涂抹痰标本时，严禁对载玻片进行加热。

7.4菌龄为18〜24小时为佳。

8.临床意义

只针对用于结核病、麻风病等的细菌检查，初步诊断。

9.安全防护措施

9.1操作人员要戴口罩、手套和穿隔离衣。

9.2涂片制备痰标本要高压灭菌或者在标本中加入等量0.5%

“84”消毒液（含有效氯2500mg/L）后涂片。气管刷片送检的

玻片，紫外线灯下照射30分钟进行染色镜检。或者对于进行抗

酸染色的痰标本（因使用的容器原因不能高压灭菌）。

9.3镜检后的玻片均浸泡在含有效氯1000mg/L的消毒液中，高压

灭菌后处理。

9.4所有标本、污染物丢弃之前，都需经高压灭菌、焚烧或浸泡杀

菌剂中。

参考文献

[1]周庭银编著.临床微生物学诊断与图解.第二版.上海：上海科学

技术出版社，2007

[2]王钦升，周正明，高屹主编.实用医学培养基手册.北京：人民军

医出版社，1999

（周庭银）

编写人:AAA、BBB操作人：本室操作人员

批准人：_______

XXX医院检验科墨汁染色标准文件编号：

微生物检验实验室作操作规程XXX-JY-CZ-WSW-05

业指导书68

版本：20140601

生效日期:20140615

共1页

1.目的

规范墨汁染色标准操作规程。

2.原理

墨汁染色（负染色法）：背景着色而菌体本身不着色的染色法称负

染色法。此法用以观察细菌及某种真菌的荚膜等。

3.试剂

印度墨汁。

4.质控

新型隐球菌ATCC32609为阳性，白念珠菌ATCC90038为阴性。

5.操作步骤

脑脊液等其他标本离心取沉淀物或者挑取菌液1环涂于洁净玻片

上，然后加印度墨汁1环，覆以盖玻片后镜检。镜下背景呈黑褐色,

菌体无色。

6.结果判断

新型隐球菌可呈宽阔透亮的厚荚膜，背景为纤细均匀的黑色，白细

胞被染成黑色不透亮，但核形明显。

7.注意事项

7.1不要使用过期的印度墨汁。

7.2墨汁应无污染、无颗粒等。

8.临床意义

主要用于新型隐球菌的鉴定。

参考文献

[1]周庭银编著.临床微生物学诊断与图解.第二版.上海：上海科学

技术出版社，2007

[2]王钦升，周正明，高屹主编.实用医学培养基手册.北京：人民军

医出版社，1999

（周庭银）

编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员

批准人：________

XXX医院检验科药物敏感性试验标文件编号：

微生物检验实验室作准操作规程XXX-JY-CZ-WSW-056

业指导书9

版本:20140601

生效日期:20140615

共2页

1.目的

规范药物敏感性试验标准操作规程，确保药敏结果准确。

2.原理

将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种待检菌的琼脂平板上，纸片

中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后会不断的向纸片周围区域

扩散，形成递减的浓度梯度，在纸片周围抑菌浓度范围内待检菌的

生长被抑制，从而产生透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映检测菌对

测定药物的敏感程度，并与该待检菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负

相关，即抑菌圈愈大，MIC愈小。

3.试剂

M-H培养基、无菌生理盐水、药敏纸片、无菌棉签、35℃孵育箱、

标准比浊管或比浊仪。

4.质控

4.1常用细菌药敏质控标准菌株参见CLSI规定。

4.2质控菌株每日随临床标本一起进行药敏试验，测定质控菌株的

抑菌环。质控菌株的抑菌