色谱分析平面色谱法

色谱分析平面色谱法第五章平面色谱法第一节概述1938年俄国人首先实现了在氧化铝薄层上分离一种天然药物。1965年德国化学家出版了“薄层色谱法”一书，推动了这一技术的发展。因TLC法设备简单，分析速度快，分离效率高，结果直观，很快被用作定性和半定量的方法。70年代中后期发展了高效薄层色谱。80年代以后发展了薄层色谱光密度扫描仪，和各步操作的仪器化，并实现了计算机化。第2页,共30页，2024年2月25日，星期天Thin-layerchromatographyofstandardPLsamplesFig.1Description:Thethermo-stabilityofphospholipidsandlysophospholipidswasdeterminedbyonedimensionalthin-layerchromatography(TLC).Achloroform-methanol-28%aqueousammoniasolventsystem(65:35:8,v/v)providedclearseparationofmajorphospholipids(PL)andtheirlysoforms.The5%(w/v)dodecamolybdophosphoricacidsolutioninethanolwasusedassprayreagent.ThethermostabilityofphospholipidswasevaluatedbycomparethespotsdensityandareaofPLsampleswithvaryingheattreatment.Rapiddeterminationofthermo-stabilityofphospholipidsbyTLC第3页,共30页，2024年2月25日，星期天第五章平面色谱法定义：平面色谱法(planechromatography)是在平面上进行分离的一种色谱方法。

一、平面色谱法的分类和原理分类纸色谱法：滤纸为载体，纤维素的羟基与水结合形成液-液分配色谱固定相，展开剂由于毛细作用沿滤纸向上运动。---分配色谱薄层色谱法：将吸附材料均匀固定在载板上，由于吸附剂颗粒间的毛细作用，展开剂（流动相）上行。-----吸附色谱薄层电泳法：荷电组分样品负载于惰性支持介质（纸、纤维素、聚丙烯酰胺凝胶等），在电场作用下进行分离。第4页,共30页，2024年2月25日，星期天二、平面色谱法的基本流程确定样品的预处理方法选择吸附剂和展开剂制备层析用薄板点样层析分离显色定性或定量分析分析结果，给出结论第5页,共30页，2024年2月25日，星期天三、平面色谱法参数（一）定性参数1.比移值Rf(retardationfactor;Rf)溶质移动的距离与流动相移动距离之比

Rf范围：

0<Rf<1Rf=0.2~0.8（常用）

Rf=0.3~0.5（最佳）第6页,共30页，2024年2月25日，星期天Lds1ds2图18－1第7页,共30页，2024年2月25日，星期天2.相对比移值Ris

讨论参考物与被测组分在完全相同条件下展开可以消除系统误差，大大提高重现性和可靠性；参考物可以是后加入纯物质，也可是样品中已知组分相对比移值Ris与组分、参考物性质及色谱条件有关，范围可以大于或小于1第8页,共30页，2024年2月25日，星期天（二）面效参数1、理论塔板数N=16(ds/W)2ds:原点到斑点中心的距离

W：组分斑点的纵向宽度2、塔板高度H=ds/N=(Rf

L)/Nds：原点到展开剂前沿的距离

N越大，H越小。与展开剂的速率常数、组分在展开剂中的扩散系数、吸附剂的平均粒径及其粒度分布等因素有关。第9页,共30页，2024年2月25日，星期天（三）容量因子k’与比移值Rf的关系容量因子：k’=ts/tmts

、tm分别为组分在固定相和展开剂中的保留时间保留值的定义：第10页,共30页，2024年2月25日，星期天（四）分离参数1、分离度(resolution;R)两相邻斑点中心的距离与两斑点平均宽度的比值

R=2(ds2-ds1)/(W1+W2)=2d/(W1+W2)ds1

、ds2:分别为原点至两半斑点中心的距离，W1、W2斑点的宽度。第11页,共30页，2024年2月25日，星期天2.分离数(separationnumber;SN)定义：相邻斑点分离度为1.177时，在Rf=0(原点)到Rf=1(溶剂前沿)之间能容纳的色谱斑点数。

W(1/2)0,W(1/2)1为实验测得的某组分色谱峰的半峰宽对ds作图外推至在原点处和溶剂前沿处的半峰宽。

一般薄层板的分离数为7~10，高效薄层板可达10~20。SN是衡量分离容量的重要参数。第12页,共30页，2024年2月25日，星期天第二节薄层色谱法一、主要类型二、吸附剂与展开剂三、操作方法四、定性与定量分析五、高效薄层色谱法六、薄层扫描法七、应用实例ThinLayerchromatographyTLC第13页,共30页，2024年2月25日，星期天概述1．TLC定义：将固定相均匀涂布在表面光滑的平板上，形成薄层而进行色谱分离和分析的方法2．操作过程：铺板→活化

→点样

→

展开

→定位(定性)/洗脱(定量)3．分离机制：吸附*、分配*、离子交换、空间排阻4．特点；分离能力强、灵敏度高、展开时间较短、显色方便。5．应用：药物杂质检查、纯度测定、定性及定量等。第14页,共30页，2024年2月25日，星期天第15页,共30页，2024年2月25日，星期天一、主要类型（一）吸附薄层色谱

固定相为吸附剂的薄层色谱。利用吸附剂对不同组分的吸附能力差异而实现分离.经过吸附、解吸、再吸附、再解吸……最后混合物得到分离.K大，Rf值小，移动慢；K小，Rf大，移动快。（二）分配薄层色谱

固定相为液体，吸留在载体上的薄层色谱。利用被分离组分在固定相与流动相中的分配系数不同而被分离。常用的是反相薄层色谱法，固定相是烷基化学键合相，展开剂是水及与水相溶的有机溶剂。第16页,共30页，2024年2月25日，星期天二、吸附剂与展开剂(一）吸附剂1.硅胶：硅胶H------不含黏合剂硅胶G------含煅石膏（13-15%）硅胶F254---既含煅石膏，又含荧光指示剂2.氧化铝：可分为中性（pH7.5)、碱性（pH9.0）和酸性（pH4.0）（二）展开剂常用的有：

石油醚<环己烷<二硫化碳<四氯化碳<三氯乙烷<苯<甲苯<二氯甲烷<乙醚<氯仿<乙酸乙酯<正丁醇<丙酮<乙醇<甲醇<吡啶<酸<水第17页,共30页，2024年2月25日，星期天吸附剂与展开剂的选择展开剂的选择：根据被测组分、吸附剂和展开剂本身的极性吸附剂的选择：根据被测物极性和吸附剂的吸附能力

被测物极性强——弱极性吸附剂

被测物极性弱——强极性吸附剂图18－3第18页,共30页，2024年2月25日，星期天三、操作方法定性分析——窄条定量分析——10×20cm硅胶G——自含粘和剂硅胶H——不含粘和剂，铺板时另加入CMC硅胶FH254——含荧光剂，254nm紫外光照发绿光硅胶FH365——含荧光剂，365nm紫外光照发光（一）薄层板的制备（二）点样：用毛细管或微量注射器，几微升，2~4mm（三）展开：见续页（四）显色方法：日光、紫外光(254、365nm)显色剂等第19页,共30页，2024年2月25日，星期天连续展开：层析缸，预饱和，防止边缘效应浸入展开剂深度0.51.0cm，展开至整板3/4距离,标记。1,2样品3标准品前沿原点

•••1.5-2.0cm2.0cm123展开方式第20页,共30页，2024年2月25日，星期天展开方式二维展开——在两个垂直的方向上进行展开。将样品点在薄层板的一个角上，展开适当距离后，挥干溶剂，再将薄层板以与原展开方向成90

的方向进行展开。原点12第21页,共30页，2024年2月25日，星期天四、定性和定量分析定性分析利用保留值测定Rf值测定相对Rf值，即Ris值。利用二维色谱（改变色谱条件，比较Rf值是否一致）sb1b2b2sb1sb1b2点样第一次展开第二次展开第22页,共30页，2024年2月25日，星期天定量分析1.目视比较半定量2.测量斑点面积3.洗脱法4.薄层扫描法第23页,共30页，2024年2月25日，星期天五、高效薄层色谱法高效薄层色谱法（highperformancethinlayerchromatography；HPTLC)所用的吸附剂颗粒很小（5μm或10μm），用喷雾法制成高效薄层板。常用的有硅胶、氧化铝、纤维素和化学键合相预制薄层板。第24页,共30页，2024年2月25日，星期天六、薄层扫描法薄层扫描法是用一定强度光束照射薄层上的斑点，用仪器测量照射前后光束强度的变化，从而求得物质含量的方法。检测方法

紫外-可见吸收测定法和荧光测定法测量方法

投射法和反射法扫描方式

单波长和双波长影响薄层扫描定量的因素

均匀度展开距离随行标准及点样次序显色均匀度及稳定性第25页,共30页，2024年2月25日，星期天第四节纸色谱法以纸做载体的色谱法，分离原理属于液-液分配色谱法，操作与薄层法类似。选纸→点样

→

展开

→显色(定性)/洗脱(定量)固定相：纸纤维吸附的水流动相：与水不互溶的有机溶剂（水饱和正丁醇）分离机制：同液-液分配色谱定性参数：讨论：Rf与组分性质、流动相及溶解度有关极性组分→易保留，Rf小（流动相极性↑，Rf↑）非极性组分→易流出，Rf大（流动相极性↑，Rf↓）第26页,共30页，2024年2月25日，星期天本章小结掌握:平面色谱法的基本分离原理及相关参数的计算（比移值、相对比移值，分离度）；薄层色谱法的特点；吸附薄层色谱中吸附剂和展开剂的选择原则。熟悉:薄层色谱法的主要操作步骤。了解:薄层扫描法的应用及技术；