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文档简介

生物大分子药物

研究开发前沿

2021/3/29星期一1

内容第一部分:生物大分子药物

及其研发现状第二部分:生物大分子药物

传递系统研究进展2021/3/29星期一2第五讲

复习思考题生物技术药物的研发关键环节有哪些?生物技术药物的翻译后修饰方法有哪几种?蛋白质、多肽药物载体型传递系统有哪些?疫苗载体型传递系统有哪些?2021/3/29星期一3第一部分:生物大分子药物及其研发现状2021/3/29星期一4生物大分子药物及其现状生物药物:肽、蛋白质、抗体、核酸(基因)、疫苗、糖治疗剂、基于细胞或组织的治疗剂已批准的生物药物:超过250个,包括重组蛋白质、血液产品、单克隆抗体和重组疫苗药物应用最多的为重组蛋白质和抗体主要用于治疗癌症、艾滋病、冠心病、糖尿病和一些罕见的遗传疾病等。2021/3/29星期一5年销售额

40亿美元的基因工程药物

至2010年底,FDA共批准250种生物技术药物上市2007年销售额超过40亿美元的药物有16种,基因工程药物占据7种:1.治疗非霍奇金淋巴瘤的

anti-CD20抗体

Rituxan2.治疗乳腺癌的anti-EGFRII

抗体

Herceptin3.治疗肿瘤放化疗后出现的白细胞减少的

G-CSF4.治疗肺癌、乳腺癌和结直肠癌的

anti-VEGF抗体Avastin5.治疗类风湿关节炎的

anti-TNFα抗体Enbrel、Remicade2021/3/29星期一62021/3/29星期一7生物制药发展迅速1982-2008年美国FDA批准的新生物产品

2021/3/29星期一82008年美国处于临床试验的生物技术药物

按产品类型分类按适应症分类2021/3/29星期一9重组生物药物的研发过程各种天然存在的治疗蛋白质E.coli等微生物表达药效更强的蛋白质工程产品多种表达体系开发应用突变技术融合蛋白质表达定向进化基因渗入基因敲除

活性提高稳定性增加半衰期增加免疫原性减少真核哺乳动物细胞为主一、生物技术药物的研发过程及关键环节2021/3/29星期一10药物的设计——药物的靶点及药物设计药物的生产——表达体系和质量控制药物的评估——药效和毒副作用2021/3/29星期一11(一)药物设计--药物靶点研究探讨致病分子机理,寻找合适的药物治疗新靶点单个靶点的多种生物学功能及精细调控单个靶点的多种存在形式:亚型个体化治疗,针对特异人群的靶向诊断试剂和治疗药物多个信号途径的相互作用:网络病理学从老药中寻找治疗疾病的新靶点:不明确靶点的老药有17%发现老药的新型治疗用途2021/3/29星期一12

2021/3/29星期一13(二)生物药物的生产

高效表达系统生产工艺质量控制

2021/3/29星期一14生物制药的生产—表达系统原核表达真核表达表达系统大肠杆菌枯草杆菌青枯病产碱杆菌假单胞菌NPro自身蛋白酶融合技术,NAFT(山德士公司,新微生物表达系统)酵母丝状真菌昆虫/杆状病毒表达系统植物哺乳动物细胞表达系统转基因动物生物反应器2021/3/29星期一15FDA批准的生物药物表达系统细菌酵母哺乳动物2021/3/29星期一16原核表达系统大肠杆菌E.coli—安全、经典的标准化表达系统

成本低廉、工艺成熟、表达量高简单蛋白质药物生产不可或缺的表达系统

2000年后,在欧美新药的研究中比例减少

2005年至今美国FDA批准的重组蛋白质药物都是真核表达缺点:容易形成包涵体(寄主细胞内形成一种蛋白质性质的病变结构),须变复性处理,易造成活性下降或丧失;提取时需破碎细胞,往往会造成核酸、热原、内毒素或脂多糖的释放;不存在翻译后修饰作用,蛋白质产物不能糖基化;目的蛋白质的N端常多余一个甲硫氨酸残基,容易引起免疫反应2021/3/29星期一17真核表达系统--酵母

酿酒酵母Saccharomycescerevisiae——应用最多限制:糖基化修饰中糖链结构和组成与天然糖蛋白相差甚远,不适用糖链极大影响生物活性的蛋白质(EPO、治疗性抗体等)2021/3/29星期一18哺乳动物细胞表达系统具有准确的转录后修饰功能,表达的蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白分子;具有重组基因的高效扩增和表达能力,外源蛋白整合稳定;具有产物胞外分泌功能,便于下游产物分离纯化;能以悬浮培养方式或在无血清培养基中达到高密度培养,可以大规模生产美国FDA倾向在21世纪都采用真核表达系统生产蛋白质药物2021/3/29星期一19欧美生物制药哺乳动物细胞表达产品ExpresssionsystemsandtransformedhostsNumberMammaliancells,nonprimatehamster,Chineseovary(CHO)仓鼠50murinemyelomacells鼠科骨瘤11murinecellsother1Mammaliancells,primate灵长类monkeycells,diploid,kidney,orfetallung4Humancellshumancells,transformedwithEpstein-Barrvirustransformed1humancells,geneactivationbyTKT22humankidneycells,embryonic胚胎样1humancells,unspecified1现有的利用哺乳动物细胞表达的药物中有70%是以CHO表达生产的

[RonaldA.Rader.ExpressionSystemsforProcessandProductImprovement.BioProcessInternationalJUNE2008]2021/3/29星期一20构建的重组CHO细胞生产效率低,产物浓度亦低某些糖基化表达产物不稳定,不易纯化上游构建与下游分离纯化脱节重组细胞培养费用昂贵,自动化水平低下缺点:研究方向:发展新的强启动子和合适的增强子提高基因剂量的新途径选择载体-宿主的最优组合装配适合于cDNA高效表达的必要元件大规模培养条件和无血清及无蛋白培养条件的探索CHO细胞表达系统的不足和改进2021/3/29星期一21表达系统发展方向研发可表达复杂的真核基因的真核微生物系统或改造的原核微生物系统真核表达系统中糖基化系统的重构用作生物反应器的转基因动物系统——动物乳腺生物反应器

利用动物乳腺天然、高效合成并分泌蛋白的能力,在动物的乳汁中生产一些具有重要价值产品的转基因动物的总称。2006年6月,世界上第一个利用乳腺生物反应器生产的基因工程蛋白药物—重组人抗凝血酶Ⅲ(ATryn)的上市许可申请获得了欧洲医药评价署人用医药产品委员会批准,2009年获得美国FDA批准上市。2021/3/29星期一22(三)生物药物的质量控制

新的蛋白质纯度检测指标:

化学修饰类型:脱氨基,二硫键错配,氧化存在状态:降解片段,二聚体,多聚体

糖基化

蛋白质错误折叠2021/3/29星期一23二、生物药物的药效和副作用改善基因工程改造:现有上市重组药物中基因改造率达30%以上翻译后修饰2021/3/29星期一24(一)生物药物的基因工程改造原则:

改变蛋白结构,在不弱化其生物功能及产生新的抗原性基础上优化其药代动力学实例:Lispro:重组人胰岛素B28、B29之间颠换——聚体的可能性降低1/300, 起速效作用ReFacto:重组凝血因子VIII为缺失突变体——血友病有较好的疗效注意: 基因工程改变序列应非常谨慎,一些很小的变化可能导致蛋白构象的较大变化,诱发免疫反应2021/3/29星期一25(二)生物技术药物的翻译后修饰PEG修饰: 聚乙二醇(polyethylene,PEG)共价修饰蛋白质糖基化修饰脂肪酸、白蛋白修饰融合蛋白:不同蛋白的不同功能域通过基因工程手段构建成一个蛋白,具有双功能或新的功能2021/3/29星期一26I、生物药物的PEG修饰增加蛋白质的分子量,减少小分子蛋白药物被肾小管直接过滤清除作用作为屏障挡住蛋白质分子表面的抗原决定簇,减少免疫原性,减少体内清除率保护蛋白质不易被蛋白酶水解提高溶解性、流动性,延长药物作用,减少毒副作用均有利于延长蛋白药物的半衰期2021/3/29星期一27已上市的PEG化蛋白药物PEG修饰前后体内半衰期比较2021/3/29星期一28II、生物药物的糖基化修饰蛋白糖基化是真核生物常见的蛋白质翻译后修饰过程三种形式:N-糖苷(N-glycan)、O-糖苷(O-gly2can)、糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol,GPI)。蛋白质经糖基化修饰后产生数千种具有独特生物活性

糖蛋白,参与机体生命活动。2021/3/29星期一29蛋白质的溶解性;生物活性;稳定性;免疫原性;蛋白药物的动力学作用

有效改善

在蛋白药物表面增加侧链长度—增加蛋白质稳定性,阻碍蛋白酶对蛋白药物的降解使蛋白药物分子量增大——减少了肾小球滤过率定点突变增加生物药物的糖基化水平2021/3/29星期一30糖基化提高生物药物稳定性糖基化-β-干扰素:热变性的敏感性降低糖基化-白细胞介素-5(IL-5):热稳定性增加糖基化-rhEPO:

在盐酸胍、加热和pH变化中比去糖基化rhEPO稳定糖基化-rhEPO:免受氧自由基损伤2021/3/29星期一31糖基化增加蛋白质药物的生物活性、减少免疫原性rhEPO糖基化修饰产物:血浆中的半衰期显著延长,体内活性大大增强,单次注射小鼠时,相当于30~40倍的非糖基化rhEPO活性瘦素加成糖类似物:治疗糖尿病小鼠疗效增加10倍,时间维持更长mpl配体加成N-连接糖类似物:明显改善小鼠中血小板生成量和持续时间IgG1糖基化:极大消弱抗体依赖性细胞毒性和补体依赖性细胞毒性R05072759(GA101):第一个进入临床试验的人源化和糖基化CD20单抗,体内外研究疗效优于利妥昔单抗2021/3/29星期一32糖基化提高蛋白类药物的血浆半衰期EPO的33位和88位糖基化修饰:体内半衰期是未糖基化修饰的3倍(Amgen公司研制已上市)突变体TK-tPA:糖基化tPA-T103Q-296-299四等位基因替换--延长了体内清除时间,同时保持正常的凝血活性糖基化-IL-3:聚集在细胞外基质中--血浆半衰期提高了2倍2021/3/29星期一33糖基化提高蛋白质药物的靶向治疗作用葡萄糖脑苷脂酶(GBA)-甘露糖结合:靶向肝中的巨噬细胞唾液酸糖蛋白受体与含有末端半乳糖或氮乙酰半乳糖胺的糖蛋白结合:可作为组织特异性蛋白质靶向带有特异性靶向病毒复制位点糖基化干扰素:有可能减小其毒性2021/3/29星期一34III、脂肪酸、白蛋白修饰延长半衰期SOD-白蛋白:半衰期由5min提高至6h;超氧化物歧化酶

(SuperoxideDismutase,SOD),白蛋白-GH:半衰期由5min提高至2~3h;生长激素insulindetemir:脂肪酸修饰后的长效胰岛素类似物,NovoNordisk公司研发,2004年5月在瑞士首次上市干扰素α-2b-白蛋白(Interferonalfa-2b-albumin,修饰的人白蛋白-干扰素,丙肝用药):能延长干扰素的半衰期。2021/3/29星期一35

IV、融合蛋白Enbrel(Amgen):TNF受体和IgG的Fc片段的融合蛋白,含934个氨基酸残基,适应症为风湿性关节,1998年批准;OntakLigand:缺失细胞结合域的白喉毒素与IL-2的N端133个氨基酸残基的融合蛋白,适应症为皮肤T细胞淋巴瘤,1999年上市;AmeviveBiogenIdec——LEF-3的CD2与IgG的Fc片段的融合蛋白,适应症牛皮癣,2003年上市2021/3/29星期一361.抗体药物具有高度特异性,是靶向治疗的基础2.目前批准上市27种抗体药物,临床转化率以及批准成功率都较高3.抗体药物生产条件复杂,不易受仿制的威胁4.已上市的抗体药物具有很高的市场回报率,大大刺激了投资抗体药物是大分子糖蛋白,结构复杂,不利储存,不能口服,进入体内5-7天才能到达靶位置;2.抗体药物研发费用较高,达10-18亿美元抗体药物单剂用量大,质量标准高,生产成本高昂,价格昂贵

Avastin:

单个病人年度费用高达4-6万美元三、抗体药物研发缺点:2021/3/29星期一37抗体自身的抗原性抗体靶抗原的不确定性针对不同表位可能产生完全相反的生物学效应抗体治疗的脱靶抗体药物临床存在问题2021/3/29星期一38使用剂量大:>1克/人/年,抗体生产厂商的年生产规模在几十至几百公斤/年;固定资产投入大:

建造年产抗体300~500公斤的工厂,需要4亿~5亿美元投资生产成本高:

一般在2000~5000美元/克抗体抗体药物的剂量大多在2~6克/人/年,病人的抗体药费负担在1-4万美元/人/年销售单价低:

治疗肿瘤或类风湿关节炎的抗体药物的价格约3000~8000美元/克

CHO表达的EPO,其销售单价约200万美元/克抗体类药物是价格最接近生产成本的一类生物技术药物抗体药物的生产瓶颈-生产成本过高2021/3/29星期一39解决方法抗体药物靶向药物抗体核酸小分子………..2021/3/29星期一40第二部分:生物大分子药物

传递系统的研究2021/3/29星期一41蛋白质、多肽药物载体型传递系统研究进展2021/3/29星期一42

蛋白质、多肽药物的特点:

结构复杂,理化性质不稳定,口服给药易受胃肠道

pH、菌群及酶系统破坏,稳定性差分子量大,生物膜穿透性差,吸收难,生物利用度低药理活性高生物半衰期短,体内清除率高2021/3/29星期一43市场上的多肽、蛋白药物制剂及存在的问题肠溶片和肠溶胶囊优点:患者顺应性好缺点:多肽、蛋白生物利用度低溶液剂和冻干粉针剂优点:疗效确切缺点:稳定性较差多肽、蛋白半衰期短,多次注射给药患者顺应性差

靶向性问题,在体内只与特定的受体结合起作用,受体在组织的分布影响多肽的药效2021/3/29星期一44

80年代开始国外主要研制的新剂型:非注射途径给药及长效注射剂。非注射途径给药:口服、鼻腔、肺部、颊含、直肠、透皮、眼部、阴道等。非注射途径给药的主要屏障是致密的肠上皮细胞膜、胃酸和各种消化酶,即生物膜及酶屏障。2021/3/29星期一45

研究多肽、蛋白非注射途径给药制剂的重点:

提高其对生物膜的通透性和抵抗酶的降解作。主要方法有:化学修饰吸收促进剂脂质体固体微粒

2021/3/29星期一46

微粒穿过胃肠道上皮的3种可能吸收和转运途径

(I)paracellularuptake,(II)endocytoticuptakebyenterocytesand(III)Mcells.2021/3/29星期一47载体型传递系统思路用适当的载体材料包裹,以减少药物与胃肠道中的酶类的直接接触,避免降解载体材料应具有生物黏附性,以利定位释放,提高局部的药物浓度,促进吸收考虑使用吸收促进方法来增加药物对胃肠道上皮细胞的透过性。口服生物大分子药物可通过肠多肽转运系统及Peyer’spatches等吸收。2021/3/29星期一48载体--实现药物传输之关键2021/3/29星期一49生物可降解材料有PLA,PLGA等保护蛋白药物不受降解,延长释放时间,或脉冲释放上市药物:

亮丙瑞林

(Leuprolideacetate)PLGA微球

那法瑞林缓释微球注射剂

重组人生长因子缓释微球注射剂

生物可降解微球2021/3/29星期一50氨化明胶微球(AGMS)鼻腔给药系统:动物试验表明,干粉状AGMS能够显著提高大鼠鼻腔胰岛素的吸收。药物和微球之间的静电作用被认为是影响药物释放行为的主要因素。pH敏感微球:

一种pH敏感结肠定位微球提高了降钙素(CT

,Calcitonin)的口服生物利用度IL-2-PLGA微球:现有给药方法受剂量依赖的毒性和副作用限制。局部给药的PLGA-IL-2微球实现了IL-2的缓释。

2021/3/29星期一51原位微球:将药物与可生物降解的聚合物溶解在特定的溶剂中形成注射剂,当注入体内后,聚合物随着溶剂的扩散而固化,从而形成微球,达到控制释药的目的。与常规的注射微球和皮下埋植剂相比,原位微球具有制备工艺简单,控释可靠及使用方便的优点。最近,FDA批准了AtrixLab公司生产的亮丙瑞林(leuprolide)缓释注射液(商品名Eligard),经小口径针头皮下注射后在体内形成微球,释放出亮丙瑞林,已用于晚期前列腺癌的姑息治疗。2021/3/29星期一522021/3/29星期一53聚合物修饰PEG修饰(PEGylation)2021/3/29星期一542021/3/29星期一55脂质体(Liposome)2021/3/29星期一56肺部给药胰岛素脂质体

肺脏表面积大,粘膜层薄,血管丛丰富,为蛋白类药物的吸收的好途径。但人体气道的复杂性和呼吸运动的影响使得肺部给药问题重重。Huang等研制的载胰岛素脂质体气雾剂,包封率达40%,粒径约1µm,有效增加药物在肺部滞留时间,提高疗效。

胰岛素脂质体在小鼠肺泡内均匀分布2021/3/29星期一57DepoFoam-IGF-1DepoTech公司开发了缓释多囊脂质体制剂技术(DepoFoam),它是一种脂质体多囊颗粒,每个颗粒内部有含水的药室,能溶解水溶性药物如蛋白质或多肽,室外由脂薄膜包裹。其中,Depol(胰岛素样生长因子-1,IGF-1)可以在体内连续10d释放药物,半衰期达142h,而未包囊的IGF-1仅为4h。2021/3/29星期一58胶束有的肿瘤血管开口较小而脂质体体积过大,故难以通过EPR效应在肿瘤内部产生有效聚集。因此,一些体积较小的传递系统将更有效,如蛋白-聚合物结合物及载药胶束。2021/3/29星期一592.5纳米粒纳米粒体内分布有一定靶向性缓释特性生物利用度提高药物透皮吸收与细胞内药效发挥

2021/3/29星期一60举例:供口服和皮下注射INS聚氰基丙烯酸酯纳米粒体内试验表明降皮下注射INS纳米粒降血糖效果能持续6-72h,而口服INS纳米粒的效果也显著好于未包裹的胰岛素。InternationalJournalofPharmaceutics,288(2005)289–293CaCO3-纳米粒作为胰岛素动物试验结果表明,这一透皮给药系统能显著降低正常和糖尿病大鼠的血糖水平,为开发胰岛素纳米透皮给药系统提供了有力支持,DiabetesTechnolTher2006Jun;Vol.8(3),pp.369-742021/3/29星期一61偶联单抗OX26的壳聚糖-PEG纳米粒的脑靶向研究

Z-DEVD-FMK是一种特异性抑制Caspase酶的多肽,能够减少神经细胞的衰亡,但这一分子无法跨越血脑屏障(BBB)。利用亲和素生物素复合物技术(ABC)设计CS-PEG-OX26纳米粒,其能通过转铁蛋白受体介导的跨膜转运穿过BBB。2021/3/29星期一62其他载体无痛微针Microneedle

透皮给药胰岛素,寡核苷酸,蛋白疫苗,DNA疫苗,2021/3/29星期一63细胞穿透多肽Cellpenetratingpeptide

Gros等发现Pep-1

能有效传递不少多肽、蛋白质药物进入细胞内,而无须进行化学交连。

Pep-1在生理条件下稳定,毒性低,对血清不敏感等优点,故可以运用于蛋白多肽类药物传递系统的研究。其可能的机制似乎并不涉及内吞途径,而是一种直接的跨膜行为。2021/3/29星期一64可能的跨膜机制反向胶束反向胶束转运直接渗透转运吞饮转运2021/3/29星期一653待解决的问题如何实现体内药物传输?如何延长药物体内驻留时间,改变蛋白质体内药物动力学和体内分布性质?如何维持制剂过程中的蛋白质结构完整性?如何开发新剂型和新技术?是否适于大生产,成本的问题?2021/3/29星期一66疫苗载体型传递系统的

研究进展2021/3/29星期一67疫苗免疫是控制微生物传播性疾病的有效手段,甚至被寄予治疗癌症的厚望。传统疫苗存在很多问题:多次免疫,不稳定性,细胞免疫应答差现代疫苗同样存在问题:免疫原性低使用载体传递系统是解决方法之一。2021/3/29星期一68微粒载体传递系统微球可生物降解微球一直是疫苗传递系统研究的重点。将疫苗包裹于微球之中具有很多优势:保护抗原增加抗原递呈细胞(APCs)的摄取缓释作用2021/3/29星期一69

近年来的研究热点提高载体材料的亲水性:减缓降解速率以延长药物的释放时间寻找适合的内水相:提高载药量如复乳法提高疫苗在制备或释放过程中的稳定性表面吸附载药:用带负电的载体材料,制成微球后表面吸附带正电的HIV-1Tat疫苗,免疫效果较好如何提高微球穿过粘膜屏障的能力:扩散屏障(肠腔>Peyer氏节>肠系膜淋巴结)对于所产生的抗体强度有很大的影响,2021/3/29星期一70纳米粒载体传递系统与非包裹疫苗相比具有以下优势:保护抗原抗原递呈细胞的限制性分布高载药量缓释作用靶向传递作用与微球比较具有以下优势:

在粘膜相关的淋巴组织(MALT)的吸收提高几倍到100多倍,且粒径越小则吸收越好。有可能通过小肠上皮细胞的细胞旁路吸收。2021/3/29星期一71

近年来的研究热点:粒径及电荷的影响细胞模型研究经皮给药2021/3/29星期一72

生物黏附载体给药系统生物可降解微粒在粘膜给药中的吸收效率较低,通过使用生物黏附材料,增加微粒在粘膜表面的滞留时间,可以进一步提高微粒的吸收效率。2021/3/29星期一73壳聚糖

缺点:a.中性及碱性条件下水溶性差b.在生理pH条件下不带电,因此失去增加细胞旁路转运的能力

优势:a.有较好黏附作用b.可促进细胞旁路转运c.微粒制备条件温和d.高载药量

壳聚糖衍生物

主要解决壳聚糖的水溶性问题,同时增加黏附力,增加所带电荷密度等特征。三甲基壳聚糖(TMC)2021/3/29星期一74

pH敏感疫苗传递系统对于口服给药系统来说,引起口服免疫失败的最大原因仍然是胃内的低pH值以及消化道内的蛋白水解酶对疫苗的降解作用。使用pH敏感材料包裹疫苗或对微粒进行包衣,可以使疫苗在较高的pH环境下或定位释放,以减少由于疫苗过早释放所带来的不必要的损失。2021/3/29星期一75脂质体及脂质体相关的给药系统脂质体是具有双层磷脂膜结构的微囊,抗原可以于脂质体相结合或连接到脂质体的表面。由于脂质体的免疫佐剂活性不强,因此可将佐剂和抗原共同包裹或结合到脂质体的表面以提高免疫效力。2021/3/29星期一76脂质体相关的给药系统

融合脂质体(Fusogenicliposomes)通过融合靶细胞促进包裹药物的细胞内传递囊泡体(Fusogenicvesosomes)用融合脂质体膜包裹阳离子融合脂质体制成囊泡体(Fusogenicvesosomes),将包裹的脂质体直接释放进入抗原递呈细胞的包浆,减少了单纯使用阳离子融合脂质体时,抗原在进入细胞前的释放

胆盐体(bilosomes)在胃酸中可有效保护脂质体胆盐是具有穿透效应的天然脂质,还可增加了脂质体的粘膜穿透效力和生

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