微生物学检验基本技术

1.葡萄糖代谢类型鉴别试验(O/F或Hugh-Leifson,HL)

下层：蛋白陈1克氯化钠0.5克

葡萄糖0.2克水100毫升1.6%浪甲酚紫(Brom。cresolpurple)乙

醇溶液0.1-0.2mL

PH=7.6注意：调完pH值后再加葡萄糖.

(1)原理：细菌在分解葡萄糖的过程中，必须有分子氧参加，称为氧化型；能进行无氧降

解的为发酵型；不分解葡萄糖的细菌为产碱型。发酵型细菌无论在有氧或无氧环境中都

能分解葡萄糖，而氧化型细菌在无氧环境中则不能分解葡萄糖。本试验又称氧化发酵(O/F

或Hugh—Leifson,HL)试验，可用于区别细菌的代谢类型。

(2)方法：挑取少许纯培养物(不要从选择性平板中挑取)接种2支HL培养管中，在其

中一管加入高度至少为0.5cm的无菌液体石蜡以隔绝空气(作为密封管)，另一管不加

(作为开放管)。置30c孵箱孵育48h以上。

(3)结果：两管培养基均不产酸(颜色不变)为产碱型；两管都产酸(变黄)为发酵型；

加液体石蜡管不产酸，不加液体石蜡管产酸为氧化型。

(4)应用：主要用于肠杆菌科与其它非发酵菌的鉴别。肠杆菌科、弧菌科细菌为发酵型，

非发酵菌为氧化型或产碱型。也可用于鉴别葡萄球菌(发酵型)与微球菌(氧化型)。

2.氧化酶试验

(1)原理：氧化酶乂称细胞色素氧化酶，是细胞色素氧化酶系统中的最终呼吸酶。此酶并

不直接与氧化酶试剂起反应，而是先使细胞色素C氧化，然后此氧化型细胞色素C再使

对苯二胺氧化，产生颜色反应。因此，本试验结果与细胞色素C的存在有关。

(2)方法：取洁净滤纸条，沾取菌落少许，加氧化酶试剂(10g/L盐酸四甲基对苯二胺水

溶液或10g/L盐酸二甲基对苯二胺水溶液)1滴，Imin内观察结果。也可将试剂滴加到

菌落上进行试验。

(3)结果：阳性者立即变粉红色，5-10s内呈深紫色。无色为阴性。

(4)应用：用于奈瑟菌属的菌种鉴定，该属细菌均阳性。此外，也用于气单胞菌和假单胞

菌属与肠杆菌科细菌的区别，气单胞菌和假单胞菌属为阳性，而肠杆菌科细菌阴性。莫

拉菌属、产碱杆菌属等均为阳性。

注意事项：①试验时应避免接触含铁物质，以免出现假阳性。②10g/L盐酸四甲基对苯

二胺或10g/L盐酸四甲基对苯二胺水溶液为无色溶液，在空气中易被氧化而失效，故应

经常更换新试剂，并盛于棕色瓶中，若试剂已变成深蓝色，应弃去不用。

3.克氏双糖铁或三糖铁琼脂培养基试验

双糖铁培养基

成份：

下层：蛋白陈1克氯化钠0.5克

葡萄糖0.2克琼脂0.3-0.5克

水100毫升

将上述物质混匀调PH7.6后加1.2%酚红0.4毫升

上层：蛋白陈1克氯化钠0.5克

乳糖1克硫代硫酸钠0.03克

硫酸亚铁0.02克琼脂1克

水100毫升

制法：1将下层配好，分装中号试管(1毫升)，塞好包扎，15磅高压灭菌半小时，使凝

固后备用。

2制上层时，先将蛋白陈水制好，加入硫酸亚铁，硫代硫酸钠，加热溶解PH8.1,

再加入酚红分瓶，(每瓶300毫升，称取琼脂包扎灭菌，趁热加入乳糖隔水煮沸30分钟

或112℃消毒15分钟)。

3取已制的下层管，每管用无菌法倒入上层液约1。5毫升，边斜放置使成斜面，凝

固后备用。

标准：无菌试验合格，接种大肠杆菌下层产酸产气，上层产酸。

试验过程与意义

(1)原理：克氏双糖铁(KIA)或三糖铁琼脂(TSI)培养基制成高层和短的斜面，其中葡萄糖

含量仅为乳糖或蔗糖的十分之一，若细菌只分解葡萄糖而不分解乳糖和蔗糖，分解葡萄

糖产酸使pH降低，因此斜面和底层均先呈黄色，但因葡萄糖量较少，所生成的少量酸可

因接触空气而氧化，并因细菌生长繁殖利用含氮物质生成碱性化合物，使斜面部分又变

成红色；底层由于处于缺氧状态，细菌分解葡萄糖所生成的酸类一时不被氧化而仍保持

黄色。细菌分解葡萄糖、乳糖或蔗糖产酸产气，使斜面与底层均呈黄色，且有气泡。细

菌产生硫化氢时与培养基中的硫酸亚铁作用，形成黑色的硫化铁。

(2)方法：用接种针挑取待检菌的菌落，先穿刺接种到KIA或TSI深层，距管底3〜5mm

为止，再从原路退回，在斜面上自下而上划线，置35℃孵育18〜24h,观察结果。

(3)结果：常见的KIA反应有如下几种：①斜面碱性/底层碱性：不发酵碳水化合物，系

不发酵菌的特征。如铜绿假单胞菌。②斜面碱性/底层酸性：葡萄糖发酵、乳糖(和TSI

中的蔗糖)不发酵，是不发酵乳糖菌的特征，如志贺菌。③斜面碱性/底层酸性(黑色)：

葡萄糖发酵、乳糖不发酵并产生硫化氢，是产生硫化氢不发酵乳糖菌的特征。如沙门菌、

亚利桑那菌、枸檬酸杆菌和变形杆菌等。④斜面酸性/底层酸性：葡萄糖和乳糖(和TSI

中的蔗糖)发酵，是发酵乳糖的大肠菌群的特征，如大肠埃希菌、克雷伯菌属和肠杆菌

属°

(4)应用：鉴别肠道杆菌用。KIA或TSI对初分离出的、可疑为革兰阴性杆菌鉴定特别有

用。其反应模式是许多杆菌鉴定表的组成部分，也可作为观察其他培养基反应的有价值

的质控依据。

4.0/129试验

(1)原理：0/129(2,4二氨基-6,7-二异丙基喋唬)能抑制弧菌属、发光杆菌属和邻单胞

菌属细菌生长，而气单胞菌属和假单胞菌属细菌则耐药。

(2)方法：用棉拭子将待检菌菌悬液均匀涂布于碱性琼脂平板上，将10圈/片及150图/片

的0/129诊断纸片贴于平板上，置35c孵育18-24h,观察结果。

(3)结果：出现抑菌圈者表示敏感，无抑菌圈者为耐药。

(4)应用：主要用于弧菌属、邻单胞菌属与气单胞菌属的鉴别，弧菌属和邻单胞菌属菌为

敏感，气单胞菌属菌为耐药。其它菌属有发光杆菌属为敏感，假单胞菌属为耐药。

5.触酶试验(H2O2)

(1)原理：触酶又称过氧化氢酶，具有过氧化氢酶的细菌，能催化过氧化氢成为水和原子

态氧，继而形成氧分子，出现气泡。

(2)方法：取洁净玻片1张，用接种环挑取细菌，加3%H2O21滴，立即观察结果。

(3)结果：若立即出现大量气泡为阳性。无气泡为阴性。

(4)应用：大多需氧和兼性厌氧菌均产生过氧化氢酶，但链球菌科阴性，故常用此试验来

鉴定。此外，金氏杆菌属的细菌也为阴性。分枝杆菌的鉴别则用耐热触酶试验，结核分

枝杆菌为阴性，戈氏分枝杆菌和地分枝杆菌为阳性。

注意事项：①3%H2O2溶液要新鲜配制。②不宜用血琼脂平板上生长的菌落，因红细

胞含有触酶，可致假阳性反应，③取对数生长期的细菌。

4.苯丙氨酸脱氨酶试验(phenylalanine)

(1)原理：测定细菌是否产生苯丙氨酸脱氨酶。细菌产生的苯丙氨酸脱氨酶使苯丙氨酸脱

氨后生成苯丙酮酸，加入三氯化铁试剂后产生绿色反应。若延长时间，会引起退色。

⑵方法：将待检菌大量接种入苯丙氨酸培养基中，35c孵育18〜24h,滴加100g/L三氯

化铁试剂4〜5滴，立即观察菌落生长处有无绿色出现。

⑶结果：有绿色出现为阳性。

(4)应用：变形杆菌属、普罗威登菌属、摩根菌属均为阳性，肠杆菌科其它细菌均为阴性。

4.0一半乳糖甘酶试验(ONPG试验)

(1)原理：乳糖发酵过程中需要乳糖通透酶和「一半乳糖甘酶才能快速分解。有些细菌只

有半乳糖甘酶，因而只能迟缓发酵乳糖，所有乳糖快速发酵和迟缓发酵的细菌均可快速

水解邻硝基酚-0-D-半乳糖昔(O-nitrophenyl-P-D-galactopyranoside,ONPG)而生成黄色的

邻硝基酚。用于枸檬酸菌属、亚利桑那菌属与沙门菌属的鉴别。

(2)方法：将待试菌接种于ONPG肉汤中，35℃水浴或孵箱孵育18〜24h,观察结果。

(3)结果：呈现亮黄色为阳性，无色为阴性。

(4)应用：可用于迟缓发酵乳糖细菌的快速鉴定，本法对于迅速及迟缓分解乳糖的细菌均

可短时间内呈现阳性。埃希菌属、枸檬酸杆菌属、克雷伯菌属、哈夫尼亚菌属、沙雷菌

属和肠杆菌属等均为试验阳性，而沙门菌属、变形杆菌属和普罗威登斯菌属等为阴性。

柠檬酸盐

1.枸椽酸盐利用试验

(1)原理：某些细菌能利用枸椽酸盐作为唯一碳源，而在此培养基上生长，并分解枸椽酸

盐生成碳酸钠，使培养基变碱性。

(2)方法：将待检菌接种于枸椽酸盐培养基上，置35℃孵育1〜4d,逐日观察结果。

(3)结果：若用溪麝香草酚兰指示剂，斜面出现菌落或菌苔，培养基变蓝色为阳性；无菌

落生长，培养基绿色为阴性。

(4)应用：可用此试验作细菌种属间鉴定。埃希菌属、志贺菌属、爱德华菌属和耶尔森菌

属均为阴性，沙门菌属、克雷伯菌属通常阳性，粘质和液化沙雷菌和某些变形杆菌及枸

檬酸杆菌阳性。此外，铜绿假单胞菌、洋葱伯克霍尔德菌和嗜水气单胞菌也能利用枸檬

酸盐。

Gramnegativerodsidentification

isolatedfromfish

Cytochromeoxidase

+-

GlucoseutilizationAlsonegativefor:lactose

phenylalaninedeaminase

OxidizerFermentercitrate

(nonfermenter)

0/129

Indoleand

SensitiveResistant

PseudomonasHydrogensulfide

/I

NovobiocinAeromonas

tarda4^

SensitiveResistantEdwardsiella

Motilityat30°C

VibrioPlesiomonasshigelloides

YersiniaruckeriEdwardsiellaictaluri

[T7

微生物学检验基本技术

随着现代医学及相关科学技术的发展，各学科相互交叉和渗透，医学微生物学检验技术

已深入到细胞、分子和基因水平，许多新技术、新方法已在临床微生物实验室得到广泛

应用。医学微生物学实验室的基本任务之一是利用微生物学检验技术，准确、快速检验

和鉴定临床标本中的微生物，并对引起感染的微生物进行耐药性监测，为临床对感染性

疾病诊断、治疗、流行病学调查及研究等提供科学依据。

第一节微生物形态学检查

细菌形态学检查是细菌检验的重要方法之一，它是细菌分类和鉴定的基础，可根据其形

态、结构和染色反应性等，为进一步鉴定提供参考依据。

一、显微镜检查

由于细菌个体微小，肉眼不能看到，必须借助显微镜的放大才能看到。一般形态和结构

可用光学显微镜观察，其内部的超微结构则需用电子显微镜才能看清楚。常用显微镜有

如下儿种。

1.普通光学显微镜

采用自然光或灯光为光源，其波长约为0.%um显微镜的分辨率为波长的二分之一,

即0.2pim,而肉眼可见的最小形象为0.2mm。故用油（浸）镜放大1000倍、能将0.2pm

的微粒放大成肉眼可见的0.2mm。普通光学显微镜可用于细菌、放线菌和真菌等的观察。

2.暗视野显微镜

常用于观察不染色微生物形态和运动。在普通显微镜安装暗视野聚光器后，光线不能从

中间直接透入，视野呈暗色，当标本接受从聚光器边缘斜射光后可发生散射，因此可在

暗视野背景下观察到光亮的微生物如细菌或螺旋体等。

3.相差显微镜

相差显微镜利用相差板的光珊作用，改变直射光的光位相和振幅，将光相的差异转换为

光强度差。在相差显微镜下，当光线透过不染色标本时，由于标本不同部位的密度不一

致而引起光相的差异，可观察到微生物形态、内部结构和运动方式等。

4.荧光显微镜

荧光显微镜与普通光学显微镜基本相同，主要区别在于光源、滤光片和聚光器。目前大

多数使用的是落射光装置，常用高压汞灯作为光源，可发出紫外光或蓝紫光。滤光片有

激发滤光片和吸收滤光片二种。用蓝光的荧光显微镜除可用一般明视野聚光器外，也可

用暗视野聚光器，以加强荧光与背景的对比。本法适用于对荧光色素染色或与荧光抗体

结合的细菌的检测或鉴定。

5.电子显微镜

用电子流作为光源，波长与可见光相比差儿万倍，大大提高了分辨力，并用磁性电圈作

为光学放大系统，放大倍数可达数万倍或几十万倍，常用于病毒颗粒和细菌超微结构的

观察。

二、不染色标本检查

不染色标本一般可用于观察细菌形态、动力及运动情况。细菌未染色时无色透明，在显

微镜下主要靠细菌的折光率与周围环境的不同来进行观察。有鞭毛的细菌运动活泼，无

鞭毛的细菌则呈不规则布朗运动。梅毒苍白密螺旋体、钩端螺旋体、弯曲杆菌等的活菌

各有特征鲜明的形态和运动方式，具有诊断意义。常用的方法有压滴法、悬滴法和毛细

管法等。

1.悬滴法

在洁净凹玻片的凹孔四周涂上凡士林，用接种环取一环菌悬液放在盖玻片中央，再将凹

玻片的凹孔对准盖玻片中央的液滴并盖上，然后迅速翻转，轻压盖玻片，使其与凹孔边

缘的凡士林粘紧封闭后置高倍镜下（或暗视野）观察。

2.压滴法

用接种环取--环菌悬液置于洁净玻片的中央，在菌悬液上轻轻盖上一盖玻片，注意避免

产生气泡并防止菌悬液外溢，静止数秒钟后置高倍镜下明视野（或暗视野）观察。

3.毛细管法

主要用于厌养菌动力的检查。通常选用60〜70mm长。0.5〜1.0mm孔径的毛细管虹吸厌养

菌悬液后，用火焰将毛细管两端熔封。并用塑胶纸将毛细管固定在载玻片上，置高倍镜

下暗视野观察。

三、染色标本检查

细菌标本经染色后，由于细菌与周围环境间在颜色上形成鲜明对比，故在普通光学显微

镜下可清楚地观察到细菌的形态特征（如细菌的大小、形状、排列等）和某些特殊结构

（如荚膜、鞭毛、芽袍等），并可根据染色反应性对细菌加以分类鉴定。

（一）细菌染色的一般程序

细菌染色的一般程序是：涂片（干燥）一固定一染色（媒染）一（脱色）一（复染）。

1.涂片制备

血液、分泌物、排泄物、穿刺液和液体培养物，直接在载玻片上作薄膜涂片；尸检或感

染动物组织，病变局部涂抹采样的棉拭子直接涂片。固体培养基上的菌落或菌苔的制片,

先用接种环取环生理盐水置载玻片中央，再用无菌接种环取少量的培养物在生理盐水

中磨匀，涂布成lcm2大小的涂面，置室温下自然干燥或远火慢慢烘干。

2.固定

目的是杀死细菌，凝固细菌蛋白及结构，便于染色；促使细菌粘附在载玻片上，避免在

水洗过程中被水冲掉；改变细菌对染料的通透性，有利于菌细胞内结构的染色。通常用

火焰加热固定，将已干燥的涂片在火焰中迅速通过3次，以手背皮肤接触玻片不烫为佳。

3.染色

根据检验目的不同，选择不同的染色方法进行染色。染色时滴加染液，以复盖标本为度。

4.媒染

凡能增强染料和被染物的亲和力，使染料固定于被染物及能引起细胞膜通透性改变的物

质，称媒染剂。常用的有明矶、糅酸、金属盐和碘等，也有用加热法促进着色。媒染剂

可用于初染与复染之间，也可用于固定之后或含于固定液、染色中。

5.脱色

凡能使已着色的被染物脱去颜色的化学试剂称为脱色剂。常用乙醇、丙酮等作为脱色剂。

脱色剂可以查出细菌与染料结合的稳定程度，作为鉴别染色之用。

6.复染

已脱色处理的细菌或其结构常以复染液作复染以便于观察。复染液与初染液的颜色不同

而成一鲜明对比。复染不宜太强，以免掩盖初染的颜色。

（二）常用染色法（染液配方见第8章）

单染色法

只用一种染料染色。由于大多数细菌胞浆内含有酸性物质，可与碱性染料结合，故常用

吕氏美蓝、结晶紫和稀释石碳酸复红等染液。此法可观察细菌的大小、形态与排列，不

能显示细菌的结构与染色特性。

2.复染色法

用两种或两种以上不同染料可将细菌染成不同的颜色，除可观察细菌的大小、形态与排

列外，还反应出细菌染色特性，具有鉴别细菌种类的价值。常用的有革兰染色法和抗酸

染色法。

（1）革兰染色：①细菌涂片经火焰固定，加结晶紫染液染Imin,清水冲去染液。②加

碘液媒染lmin,水洗，甩干。③用95%乙醇脱色，轻轻摇动约30s,至无紫色洗落为止,

水洗，甩干。④加稀释石碳酸复红或沙黄染液数滴进行复染，约30s,水洗。⑤干后显微

镜下镜检观察结果，革兰阳性菌染成紫色，革兰阴性菌为红色。

（2）抗酸染色：萋-尼亿iehl-Neelse）抗酸染色法：①细菌涂片经火焰固定，加石炭酸复

红溶液，徐徐加热至有蒸气出现，切不可沸腾。染液因蒸发减少时，应随时补充，防止

染液蒸干。持续染5min（奴卡菌需要加长时间），水洗，甩干。②滴加3%盐酸乙醇脱

色，不时摇动玻片至无红色脱落为止，水洗，甩干。③加吕氏美蓝复染液数滴复染Imin,

水洗。④干后显微镜下镜检观察结果，抗酸杆菌染成红色，非抗酸杆菌为蓝色。

金胺O-罗丹明B染色法：①细菌涂片固定后加第1液30〜90s。②弃去第1液后加第2

液染15min。③用第3液脱色1〜2min,水洗。④滴加第4液染30s,水洗，⑤干后置荧

光显微镜下镜检观察结果在淡蓝色背景下，抗酸杆菌呈红色，其它细菌和细胞呈蓝色。

3.特殊染色法

（1）鞭毛染色（改良Ryu法）：①玻片的处理将新载玻片浸泡在95%乙醇中。临用时

取出，以干净纱布擦干。②在玻片上滴蒸饵水1滴。③挑取培养物少许，轻触蒸储水滴

顶部，仅允许极少量细菌进入水滴，不可搅动，以免鞭毛脱落。④置35℃孵箱自然干燥,

不能用火焰固定，滴加鞭毛染液染1〜2min轻轻水洗。⑤干后显微镜镜检观察结果鞭毛

和菌体呈紫色。

（2）异染颗粒染色（阿尔培托法）：①细菌涂片经火焰固定，加甲液染色3〜5min。水洗。

②滴加乙液，染Imin。水洗。③干后显微镜镜检观察结果菌体呈绿色，异染颗粒呈蓝

黑色，用于白喉棒状杆菌染色。

（3）荚膜染色：①奥尔特荚膜染色法：将已固定的细菌涂片滴加3%沙黄染液，用火焰

加温染色，持续3min,冷却后水洗，待干镜检。结果：菌体呈褐色，荚膜呈黄色，此法

主要用于碳疽芽胞杆菌。②Hiss氏硫酸铜法：染液：第一液为结晶紫乙醇饱和液5ml加

蒸你水95ml的混合液；第二液为20%硫酸铜水溶液。方法：细菌涂片自然干燥，乙醇固

定。滴加第一液，微加热染Imin。再用第二液将涂片上的染液洗去，勿再水洗，倾去硫

酸铜液，以吸水纸吸干镜检。结果：菌体及背景呈紫色，荚膜呈鲜蓝色或不着色。

（4）芽胞染色：染液：第一液为萋一纳氏石炭酸复红液，第二液为95%乙醇，第三液为

碱性美蓝液。方法：将已固定的细菌涂片滴加第一液，微加热染5min,冷却后水洗。用

第二液脱色2min,水洗。加第三液复染Imin,水洗，待干镜检。结果：菌体呈蓝色，芽

胞呈红色。

4.负染色法

背景蓊色而菌体本身不着色的染色为负染色法。最常见的是墨汁负染色法，用来观察真

菌及细菌荚膜等。在标本涂片处滴加染液，混合后加上盖玻片（勿产生气泡），轻压。在低

倍镜下寻找有荚膜的菌细胞，转高倍镜或油镜确认，如新型隐球菌可见宽厚透亮的荚膜,

背景为黑色。

5.荧光染色法

经荧光素染色的细菌，或荧光素标记的荧光抗体与相应抗原的细菌、病毒结合形成的复

合物，在荧光显微镜下发出荧光。

微生物培养与分离方法

大多数细菌均可以通过人工方法培养，而衣原体和病毒的分离培养往往需要活组织、鸡

胚、特殊细胞株及动物接种。只有将微生物培养出来才能对它进行研究、鉴定和应用。

一、接种与分离方法

根据待检标本的性质、培养目的和所用培养基的种类，采用不同的接种方法。

1.平板划线分离培养法

对混有多种细菌的临床标本，采用划线分离和培养，使原来混杂在一起的细菌沿划线在

琼脂平板表面分离，得到分散的单个菌落，以获得纯种。临床送检的标本如痰、咽试子、

泌尿生殖道的分泌物和粪便等细菌检验均需要借助琼脂平板划线分离目的菌。平板划线

分离法通常有两种方法：

（1）分区划线分离法：此法常用于含菌量较多的标本如痰、泌尿生殖道的分泌物和粪便

或混合细菌的分离。先用接种环挑取标本涂布于琼脂平板1区（占培养基总面积的％）并

作数条划线，再于2、3、4区依次划线。每划完一个区域，均将接种环烧灼灭菌1次，

冷后再划下一区域，每一区域的划线均与上一区域的划线交接1~3次。一个成功分区划

线的平板，培养后分别观察1区形成菌苔，2区菌落连成线，3区和4区可分离到单个菌

落。

（2）连续划线分离法：此法常用于含菌量不多的标本或培养物中的细菌分离培养。方法

是先将接种物在琼脂平板上1/5处轻轻涂抹，然后再用接种环或拭子在平板表面曲线连

续划线接种，直至划满琼脂平板表面。

琼脂斜面接种法

主要用于菌落的移种，以获得纯种进行鉴定和保存菌种等。用接种环（针）挑取单个菌

落或培养物，从培养基斜面底部向上划一条直线，然后再从底部沿直线向上曲折连续划

线，直至斜面近顶端处止。生化鉴定培养基斜面接种，用接种针挑取待鉴定细菌的菌落,

从斜面中央垂直刺入底部，抽出后在斜面上由下至上曲折划线接种。

3.穿刺接种法

此法多用于半固体培养基或双糖铁、明胶等具有高层的培养基接种，半固体培养基的穿

刺接种可用于观察细菌的动力。接种时用接种针挑取菌落，由培养基中央垂直刺入至距

管底0.4cm处，再沿穿刺线退出接种针。双糖铁等有高层及斜面之分的培养基，穿刺高

层部分，退出接种针后直接划线接种斜面部分。

4.液体培养基接种法

用于各种液体培养基如肉汤、蛋白陈水、糖发酵管等的接种。用接种环挑取单个菌落，

倾斜液体培养管，在液面与管壁交界处研磨接种物（以试管直立后液体淹没接种物为准）。

此接种法应避免接种环与液体过多接触，更不应在液体中混匀、搅拌，以免形成气溶胶,

造成实验室污染。

5.倾注平板法

本法主要用于饮水、饮料、牛乳和尿液等标本中的细菌计数。取纯培养物的稀释或原标

本1ml至无菌培养皿内，再将已融化并冷却至45〜50℃左右的琼脂培养基15〜20ml倾注

入该无菌培养皿内，混匀，待凝固后置37c培养，长出菌落后进行菌落计数，以求出每

毫升标本中所含菌数。先数6个方格（每格为lcm2）中菌落数，求出每格的平均菌落数,

并算出平皿直径，然后按下列公式计数，求出每毫升标本中的细菌数。

全平板菌落数=每方格的平均菌落数x“r2

每ml标本中的细菌数=全平板菌落数x稀释倍数

6.涂布接种法

本法多用于纸片扩散法药敏试验的细菌接种。将一定量或适量的菌液加到琼脂培养基表

面，然后用灭菌的L型玻璃棒或棉拭子于不同的角度反复涂布，使被接种液均匀分布于

琼脂表面，然后贴上药敏纸片，或直接培养，本法经培养后细菌形成菌苔。

二、细菌的培养方法

根据不同的标本及不同的培养目的，可选用不同的培养方法。通常把细菌的培养方

法分为需氧培养、二氧化碳培养、微需氧培养和厌氧培养四种。

j需氧培养

是指需氧3或兼性厌氧菌在有氧条件下的培养，将已接种好的平板、斜面、液体培养基

等在空气中置35c孵育箱内孵育18〜24h,无特殊要求的细菌均可生长。少数生长缓慢的

细菌需要培养3-7d甚至1个月才能生长。为使孵育箱内保持一定的湿度，可在其内放置

一杯水。对培养时间较长的培养基，接种后应将试管口塞好棉塞或硅胶塞后用石蜡-凡士

林封固，以防培养基干裂。

2.二氧化碳培养

某些细菌，如肺炎链球菌、淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌、布鲁氏菌和流感嗜血杆菌等的

培养，特别是在初次分离时，须在5%〜10%二氧化碳环境中培养才能生长。常用的培养

法如下。

（1）二氧化碳培养箱法：二氧化碳孵箱能自动调节二氧化碳的含量、温度和湿度，培养

物置于孵育箱内阁，孵育一定时间后可直接观察生长结果。

（2）烛缸培养法：取有盖磨口标本缸或玻璃干燥器，将接种好的培养基放入缸内，点燃

蜡烛后放在缸内稍高于培养物的位置上，缸盖或缸口均涂以凡士林，加盖密闭。因缸内

蜡烛燃烧氧逐渐减少，数分钟后蜡烛自行熄灭，此时容器内二氧化碳含量约占5%〜10%。

将缸置于35℃普通孵育箱内孵育。

（3）气袋法：选用无毒透明的塑料袋，将已接种标本的培养皿放入袋内，尽量祛除袋内

空气后将开口处折叠并用弹簧夹夹紧袋口。使袋呈密闭状态，执断袋内已置的二氧化碳

产气管（安甑）产生二氧化碳，数分钟内就可达到需要的二氧化碳培养环境，置于35c

孵育箱内孵育。

（4）化学法：常用碳酸氢钠-盐酸法。按每升容积称取碳酸氢钠0.4g与浓盐酸0.35ml比

例，分别置容器内，连同容器置于玻璃缸内，盖紧密封，倾斜缸位使盐酸与碳酸氢钠接

触而生成二氧化碳。于35c孵育箱内孵育。

3.微需氧培养

微需氧菌培养在大气中及绝对无氧环境中均不能生长，在含有5%-6%氧气，5%-10%-

氧化碳和85%氮气的气体环境中才可生长，将标本接种到培养基上，置于上述气体环境

中，35c进行培养即微需氧培养法。

厌氧菌对氧敏感，培养过程中需造成低氧化还原电势的厌氧环境。厌氧培养常用的方法

有：物理法、化学法、生物法。如厌氧罐培养法、气袋法、厌氧手套箱法、需氧菌共生

厌氧法等。

三、细菌在培养基上生长特性

1.固体培养基

标本或液体培养物划线接种到固体培养基表面后，单个细菌经分裂繁殖可形成一个肉眼

可见的细菌集团，称为菌落（colony）。

（1）菌落的形态特征：大小、形状（露滴状、圆形、菜花样、不规则等）、突起或扁

平、凹陷、边缘（光滑、波形、锯齿状、卷发状等）、颜色（红色、灰白色、黑色、绿

色、无色、黄色等）、表面（光滑、粗糙等）、透明度（不透明、半透明、透明等）和

粘度等。据细菌菌落表面特征不同，可将菌落分为3型：①光滑型菌落（S型菌落）：

菌落表面光滑、湿润、边缘整齐，新分离的细菌大多呈光滑型菌落。②粗糙型菌落（R

型菌落）：菌落表面粗糙、干燥、呈皱纹或颗粒状，边缘大多不整齐。R型菌落多为S

型细菌变异失去菌体表面多糖或蛋白质形成。R型细菌抗原不完整，毒力和抗吞噬能力

都比S型细菌弱。但也有少数细菌新分离的毒力株就是R型，如炭疽抱杆菌;结核分枝

菌等。③粘液型菌落（M型菌落）：菌落粘稠、有光泽、似水珠样。多见于厚荚膜或丰

富粘液层的细菌、结核杆菌等。

（2）菌落溶血特征：菌落溶血有下列3种情况。①a溶血：又称草绿色溶血，菌落周

围培养基出现1〜2mm的草绿色环，为高铁血红蛋白所致；②。溶血：又称完全溶血，菌

落周围形成一个完全清晰透明的溶血环，是细菌产生的溶血素使红细胞完全溶解所致；

③y溶血：即不溶血，菌落周围的培养基没有变化，红细胞没有溶解或缺损。（3）色素：

有些细菌产生水溶性色素，使菌落和周围的培养基出现绿色、金黄色、白色、橙色、柠

檬色等颜色，产生的色素有水溶性或脂溶性。

（4）气味：某些细菌在培养基中生长繁殖后可产生特殊气味，如铜绿假单胞菌（生姜气味）、

变形杆菌（巧克力烧焦的臭味）、厌氧梭菌（腐败的恶臭味）、白色假丝酵母菌（酵母

味）和放线菌（泥土味）等。

2.液体培养基

细菌在液体培养基中有3种生长现象：大多数细菌在液体培养基生长繁殖后呈均匀混浊;

少数链状排列的细菌如链球菌、炭疽芽胞杆菌等则呈沉淀生长；枯草芽胞杆菌、结核分

枝杆菌和铜绿假单胞菌等专性需氧菌一般呈表面生长，常形成菌膜。

3.半固体培养基

半固体培养基主要用于细菌动力试验，有鞭毛的细菌除了沿穿刺线生长外，在穿刺线两

侧也可见羽毛状或云雾状混浊生长。无鞭毛的细菌只能沿穿刺线呈明显的线状生长，穿

刺线两边的培养基仍然澄清透明，为动力试验阴性。

细菌的生物化学试验

各种细菌具有各自独特的酶系统，因而对底物的分解能力不同，其代谢产物也不同。

用生物化学方法测定这些代谢产物，可用来区别和鉴定细菌的种类。利用生物化学方法

来鉴别不同细菌，称为细菌的生物化学试验或称生化反应。生物化学试验的方法很多，

主要有以下儿类。

一、碳水化合物的代谢试验

1.糖（醇、甘）类发酵试验

（1）原理：不同种类细菌含有发酵不同糖（醇、甘）类的酶，因而对各种糖（醇、

甘）类的代谢能力也有所不同，即使能分解某种糖（醇、甘）类，其代谢产物可因菌种

而异。检查细菌对培养基中所含糖（醇、甘）降解后产酸或产酸产气的能力，可用以鉴

定细菌种类。

（2）方法：在基础培养基中（如酚红肉汤基础培养基pH7.4）加入0.5〜1.0%（w/v）的

特定糖（醇、甘）类。所使用的糖（醇、甘）类有很多种，根据不同需要可选择单糖、

多糖或低聚糖、多元醇和环醇等，见表6-4-1。将待鉴定的纯培养细菌接种入试验培养基

中，置35c孵育箱内孵育数小时到两周（视方法及菌种而定）后，观察结果。若用微量

发酵管，或要求培养时间较长时，应注意保持其周围的湿度，以免培养基干燥。

（3）结果：能分解糖（醇、甘）产酸的细菌，培养基中的指示剂呈酸性反应（如酚红

变为黄色），产气的细菌可在小倒管（Durham小管）中产生气泡，固体培养基则产生裂

隙。不分解糖则无变化。

试验，

主要的

验中最

反应试

生化

细菌的

是鉴定

验，

酵试

）类发

醇、昔

糖（

用：

（4）应

，大

乳糖

发酵

不能

，但

萄糖

酵葡

菌可发

如沙门

）类，

醇、甘

的糖（

酵不同

菌可发

不同细

结果也

其发酵

类，

一种糖

发酵同

菌均可

两种细

即便是

乳糖。

萄糖和

发酵葡

则可

希菌

肠埃

产

酸、

则产

后者

，而

产酸

者仅

但