第04章 遗传信息的复制课件

基因组核酸的复制形式：

1、DNA复制（原核、真核、多数DNA病毒基因组）

2、DNA通过RNA中间体进行复制(少数DNA病毒)3、RNA复制（RNA病毒）

4、RNA通过DNA中间体进行复制（逆转录病毒）本章介绍内容：

1、DNA复制

2、DNA损伤与修复

3、逆转录

4、RNA复制第四章遗传信息的复制第04章遗传信息的复制第一节DNA的复制Ithasnotescapedournoticethatthespecificpairingwehavepostulatedimmediatelysuggestsapossblecopyingmechanismforgeneticmaterial.WatsonandCrick1953定义：在细胞分裂过程中，以亲代DNA为模板合成子代DNA的过程称为DNA复制（DNAreplication)。第04章遗传信息的复制

一、DNA复制的基本特点：（一）复制起始点和方向复制子(replicon):

基因组中能单独进行复制的单位。1、复制起始点（originofreplication,ori)

定义：复制子中控制复制起始的位点。原核生物：只有一个起始点真核生物：有多个起始点第04章遗传信息的复制2、复制方向的形式：1）两个起始点，两个相反方向，两个复制叉例：腺病毒DNA复制（图4-2a)2）一个起始点，一个方向，一个复制叉例：质粒ColE13)一个起始点，两个相反方向，两个复制叉例：大肠杆菌DNA复制第04章遗传信息的复制复制中的放射自显影图象复制叉复制叉：指双链DNA从复制起始点打开后局部形成的Y型结构。ori第04章遗传信息的复制

图:原核生物DNA双向复制

A.环状双链DNA及复制起始点

B.复制中的两个复制叉

C.复制接近终止点(termination,ter)oriterABC第04章遗传信息的复制(二）复制方式1、半保留复制

1958年

M.Meselson和F.Stahl以大肠杆菌为实验材料证实半保留复制的模式

第04章遗传信息的复制细菌培养DNASeCl密度梯度离心在含15N标记的培养液培养15代

15N-15N（重DNA）在普通培养液培养第一代

在普通培

养液培养14N-15N（杂合DNA）第二代

14N-14N（轻DNA）第04章遗传信息的复制2、半不连续复制

第04章遗传信息的复制（三）复制的基本过程

1、DNA双链解开

2、RNA引物的合成

3、DNA链的延长

4、切除引物、填补空缺、连接相邻DNA片段

5、切除和修复错配碱基第04章遗传信息的复制二、原核生物染色体DNA的复制（一）参与DNA复制的酶类与蛋白质1、DNA聚合酶（DNApolymerase,DNApol)

指以dNTPs为底物，催化合成DNA的一类酶。酶IIIIII

酶5’3’聚合作用+++

活3’5’外切酶活性+++

性5’3’外切酶活性+--

功修复合成不详复制能切除引物修正错误填补空缺第04章遗传信息的复制

引物链模板链3’引物链模板链3’OOH2CA-----T-H2CA-----T-HHHH

OHH—PPiOH

O-

+PPiP--P—P=O

P=O

OOH2CT-----A-H2CT-----A-HHHH

OHHOHH聚合作用第04章遗传信息的复制

图：DNA聚合酶I的3’5’外切酶功能第04章遗传信息的复制

图：随从链合成中PolI的作用——缺口平移第04章遗传信息的复制polI

N5’3’外切酶

3’5’外切酶

聚合酶C

A~FG~R

枯草杆菌蛋白酶

5’3’外切酶

3’5’外切酶

聚合酶小片段大片段（Klenow)(36KD)(67KD)Klenow大片段是分子生物学研究常用的工具酶.第04章遗传信息的复制2、引物酶（primase，DnaG蛋白)

催化RNA引物合成的一种RNA聚合酶作用：以４种NTP为原料，以解开的DNA链为模板按５’３’方向合成RNA引物

3’3’5’5’第04章遗传信息的复制3、松弛螺旋与解链的酶及蛋白质(1）DNA解链酶（DNAhelicase)

作用：在ATP参与下，解开DNA双链种类：

II、III：延随从链模板以5’3’方向移动延随从链的模板以5’3’方向移动

Rep蛋白：延前导链的模板以3’5’方向移动

3’Rep3’IIIII5’5’第04章遗传信息的复制(2）DNA拓扑异构酶（DNAtopoisomerase，topo)拓扑性质：指物体或图象作弹性位移而又保持不变的性质。拓扑异构体：碱基顺序相同但连环数/拓扑环数不同的两个

DNA分子。拓扑异构酶：催化DNA拓扑异构体互变的一类酶。拓扑异构酶分类：TopoI:

使负超螺旋松弛

1）切断DNA双螺旋中的一股链

2）互补链通过切口

3）断端连接第04章遗传信息的复制TopoII（旋转酶）:1）无ATP时，切断DNA双螺旋中的两股链，使超螺旋松弛。

2）有ATP时，已松弛的DNA分子转变为负超螺旋，增加超螺旋结构的稳定性。

(3）单链DNA结合蛋白（singlestrandDNAbindingprotein,SSB)

作用：1）与解开的DNA单链结合

2）保护DNA单链免受核酸酶的水解第04章遗传信息的复制4、DNA连接酶（DNAligase)

作用：催化相邻两DNA片段的连接。连接酶

OHPO5’POH3’O--P-OOH3’O

连接酶

O5’PO-P-OOH3’O第04章遗传信息的复制

第04章遗传信息的复制（二）DNA复制过程1、复制的起始（1）复制的起始物的生成：大肠杆菌：DnaA识别起始点，促进其解链。原因：oriC中有两个区域在复制起始中起重要作用

①13核苷酸（富含AT）的重复序列

②

9核苷酸的重复序列:与DnaA结合

3个13bp的重复序列4个9bp的重复序列一致性序列一致性序列

GATCTNTTNTTTTTTATCCACA第04章遗传信息的复制(2)引发前体的形成：

DnaB/DnaC复合物进入局部解链区（3）解链酶解链：

DnaB（一种解链酶）使双链DNA进一步解链,

拓扑酶II松弛双螺旋,

SSB结合到打开的双链DNA的单链上.（4）引物的合成：

引物酶加入到模板和蛋白质复合体中组成引发体，以解开的DNA链为模板，合成RNA引物。（５）第一个磷酸二酯键的形成

DNA聚合酶III的β亚基辨认引物，催化第一个磷酸二酯键的形成

第04章遗传信息的复制

DnaA：辨认起始点DNADnaB：解螺旋酶引发体

DnaC：辅助解螺旋酶DnaG(引物酶

)RNA引物

DDDPIIIdNTP新DNA链第04章遗传信息的复制DnaADnaB、DnaCDNA拓扑异构酶引物酶SSB3

5

3

5

引发体第04章遗传信息的复制3

5

3

5

引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。

引物3'HO5'引物酶引物第04章遗传信息的复制

参与复制起始的各种物质*

名称功能

DnaA蛋白辨认起始点解链酶(DnaB,rep蛋白）解开DNA双链

DnaC蛋白协助解螺链酶引物酶（DnaG蛋白）催化RNA引物生成

SSB稳定解开的单链拓扑异构酶理顺DNA链

oriCE.coli的复制起始点第04章遗传信息的复制２、DNA链的延长在DNA聚合酶催化下，自引物３’-OH端开始，沿５’３’方向逐个加入脱氧核苷酸。涉及：切除引物、填补空缺、连接相邻DNA片段、切除和修复错配碱基第04章遗传信息的复制5'3'5'dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH3'3'DNA-pol目录第04章遗传信息的复制

过程：

1、原核生物：DNA-polIII催化下，不断生成磷酸二酯键。

2、按碱基互补原则，以DNA为模板，在RNA

引物3’-OH端加入dNTP。

3、合成链的方向：５’

→３’第04章遗传信息的复制特点：

1、半不连续复制

DNA合成中：一条链：是顺解链方向连续合成的——领头链（以3’

→5’方向链为模板）一条链：是逆解链方向不连续合成的——随从链（以5’

→3’方向链为模板）2、冈崎片断（Okazakifragment)1968年日本科学家冈崎利用电镜和放射自显影技术发现：在DNA复制过程中，出现一些不连续的DNA片段。

第04章遗传信息的复制领头链的合成目录第04章遗传信息的复制随从链的合成目录第04章遗传信息的复制目录第04章遗传信息的复制复制过程简图目录第04章遗传信息的复制复制过程动画第04章遗传信息的复制３、复制的终止线性DNA：复制叉到达分子末端，复制终止

环状DNA：两个复制叉的汇合点

(TerD、A、C、B)Tus蛋白识别和结合与终止位点第04章遗传信息的复制

图:显示Ter

位点位置的大肠杆菌染色体图谱第04章遗传信息的复制５’３’解链酶拓扑酶引发体

SSB引物酶

DNApolIII

引物

DNApolI,连接酶

前导链随从链3’５’3’5’第04章遗传信息的复制

小结

原核生物DNA复制的基本过程

1、起始阶段：

DNA双链解旋（拓扑酶）解链（解链酶）

RNA引物的合成（引物酶）

2、DNA链的延长：前导链和冈崎片段（DNApolIII)3、终止阶段：切除引物、填补空缺(DNApolI)、连接DNA片段(DNA连接酶）第04章遗传信息的复制三、其它环状DNA分子的复制1、θ复制（replication)——Carins复制环状DNA在复制起始点解开成单链状态，分别以两条链作为模板，各自合成其互补链。由于其形态像希腊字母θ，故名。存在：革兰氏阴性菌的质粒、多瘤病毒如：大肠杆菌DNA复制

第04章遗传信息的复制

图原核生物DNA双向复制

A.环状双链DNA及复制起始点

B.复制中的两个复制叉

C.复制接近终止点(termination,ter)oriterABC第04章遗传信息的复制2、滚环复制（rollingcirclereplication)

简单低等生物或染色体外的DNA进行复制的方式。如

X174和M13噬菌体等。第04章遗传信息的复制3

-OH5

-P5

5

5

3

3

3

3

5'滚环复制5'

5

3

3

5

目录第04章遗传信息的复制dNTPDNA-polγ

3、D环复制(D-loopreplication)

是线粒体DNA(mitochondrialDNA，mtDNA)的复制形式。

第04章遗传信息的复制四、真核生物染色体DNA复制的特点（一）复制有时序性：

即复制子以分组方式激活而不是同步起动。（二）复制起始点及方向

1、多个复制起始点：

复制起始点较原核的oriC短

2、双向复制第04章遗传信息的复制（三）DNA聚合酶有四种类型：都具有5’→3’方向的聚合作用。

α:参与核DNA的复制、参与链合成的引发

β:具有外切核酸酶活性、具有修复和校正功能

δ:参与核DNA的复制、参与链合成的延长切除引物和填补空缺的作用

γ:参与线粒体DNA的复制第04章遗传信息的复制（四）增殖细胞核抗原(proliferationcellnuclearantigen,PCNA)

在复制起始和延长中起关键作用。（五)细胞能否分裂，决定于进入S期及M期这两个关键点。

G1→S及G2→M的调节，与蛋白激酶活性有关。

(六）蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而实施调控作用。第04章遗传信息的复制3

5

5

3

领头链3

5

3

5

亲代DNA随从链引物核小体复制的延长DNAPol-δDNApol-αPCNA第04章遗传信息的复制

真核生物与原核生物DNA复制的异同

真核生物原核生物底物dNTPdNTPDNApolα领头链的延长I修复、填补空缺

δ

随从链的延长III复制合成

ε

校读、修复、填补空缺冈崎片段100~200个1000~2000个引物10个数十个起始点多个一个复制速度50个核苷酸/秒500个核苷酸/秒复制方式半不连续复制θ

复制末端空缺有无第04章遗传信息的复制（三）末端复制与端粒酶端粒——真核生物线性染色体末端的一种特殊结构。结构特点:由末端单链DNA序列和蛋白质构成。末端DNA序列是多次重复的富含T、C碱基的短序列。TTTTGGGGTTTTGGGG…第04章遗传信息的复制端粒酶——一种由RNA和蛋白质组成的酶。在端粒合成中以其自身携带的RNA为模板合成互补链。可看作是一种特殊的逆转录酶。端粒酶RNA(humantelomeraseRNA,hTR)端粒酶协同蛋白(humantelomeraseassociatedprotein1,hTP1)端粒酶逆转录酶(humantelomerasereversetranscriptase,hTRT)

组成:第04章遗传信息的复制端粒DNA合成过程——“爬行模型”1、结合：端粒酶结合在端粒TG引物（3’-OH）上。2、聚合、杂交：端粒酶以自身RNA为模板，以dGTP

和dTTP为原料在染色体末端进行聚合作用（逆转录）。3、移位：继续加入T、G进行聚合。4、终止：合成达到一定长度，伸长的DNA末端与

RNA模板解开。5、端粒合成。第04章遗传信息的复制

端粒酶催化端区TG链的合成

5’—TTTTGGGGTTTTG-OH3’

CAAAACCCCAAAA端粒酶

GCGA3’AA5’

结合、聚合、杂交

5’—TTTTGGGGTTTTGgggttttg3’

CAAAACCCCAAAACGAGA3’5’

第04章遗传信息的复制

TTTT

移位

GGGgGgGg5’—TTTTttttg3’

CAAAACCCCAAAACGAGA3’5’

终止

5’—TTTTGGGGTTTTGgggttttg

gggttttg-OH3’第04章遗传信息的复制5’—TTTTGGGGTTTTGgggttttg

gggttttg-OH3’3‘—

5’—TTTTGGGGTTTTGgggttttg

gggtt

3’—HO-ggggttDNApol5’—TTTTGGGGTTTTGgggttttg

gggtt

3’—AAAACCCCAAAACCCCAAAAggggtt第04章遗传信息的复制第二节DNA的损伤与修复

(DNADamageandRepair)

一、DNA的损伤（DNAdamage)定义：复制过程中发生的DNA突变称为DNA损伤。引起损伤的因素：

1、自发性突变——内因

DNA复制中发生错配碱基,发生频率10-9左右

DNA聚合酶可修正错误.2、诱发性突变——外因外界因素所导致的突变物理因素：紫外线(ultraviolet,UV)、各种辐射化学因素:烷化剂第04章遗传信息的复制常见损伤的方式：1、点突变：

1）转换：由一种嘧啶（嘌呤）转换为另一种嘧啶（嘌呤）

2）颠换：原为嘧啶（嘌呤）突变后换成嘌呤（嘧啶）2、移码突变：丢失或插入一个或一段核苷酸，使下游DNA的编码发生改变。3、链内或链间发生共价连结第04章遗传信息的复制镰形红细胞贫血病人Hb(HbS)β亚基N-val

·

his

·

leu

·

thr

·

pro·

val

·

glu

·

·

·

·

·

·

C肽链CACGTG基因正常成人Hb(HbA)β亚基N-val

·

his

·

leu

·

thr

·

pro·

glu

·

glu

·

·

·

·

·

·

C肽链CTCGAG基因点突变例子:第04章遗传信息的复制谷酪蛋丝5’……GCA

GUA

CAU

GUC……丙缬组缬正常5’……GAG

UAC

AUG

UC……缺失C缺失引起框移突变第04章遗传信息的复制二、DNA损伤的修复1、光修复(lightrepairing)2、切除修复(excisionrepairing)3、重组修复(recombinationrepairing)4、SOS修复第04章遗传信息的复制（一）光修复

光修复酶催化的反应

UV

（300~600nm)

光修复酶第04章遗传信息的复制（二）切除修复(excisionrepair)

定义：指对DNA损伤的部位先进行切除，随后再进行正确的合成，补充被切除的片段。此种方式可修复DNA双螺旋中发生的几乎所有类型的损伤。是细胞内最重要和有效的修复机制，主要由DNA-polⅠ和连接酶完成。第04章遗传信息的复制UvrAUvrBUvrCOHPDNA聚合酶ⅠOHP

DNA连接酶ATPE.coli的切除修复机制目录损伤DNAUvrA、UvrB辨认结合在损伤部位切除损伤填补空缺、连接缺口

第04章遗传信息的复制真核细胞也存在切除修复系统。发现基因：XPA、XPB、XPC、XPF、XPG表达蛋白活性：1、结合损伤DNA2、解旋酶切除损伤DNA3、核酸酶空缺由DNA-polδ及ε加以修复。着色性干皮病（xerodermapigmentosis,XP）

——遗传性疾病病因：患者修复系统缺陷。故紫外线照射后易发生皮肤癌。第04章遗传信息的复制切除修复动画第04章遗传信息的复制（三）重组修复（recombinationalrepair）

DNA复制过程中子代DNA发生损伤时，可以从亲代DNA分子中得到所需的正确片段。片段交换复原参与重组修复的酶有多种，RecA、RecB、RecC。此种修复不能完全去除损伤，只是使损伤链“稀释”。第04章遗传信息的复制

图：重组修复第04章遗传信息的复制（四）SOS修复

指DNA损伤时，应急而诱导产生的修复作用。DNA损伤

+RecALexA(调控蛋白）水解（重组酶）诱导

SOS修复基因活化修复酶表达参与DNA修复第04章遗传信息的复制三、DNA损伤的主要检测技术（一）碱基损伤的检测方法

损伤检测方法

酶敏感位点核酸内切酶V探针法无嘌呤/无嘧啶位点碱基不稳定位点核酸内切酶和DNA-糖基化酶探针法

5-羟甲基脱氧尿嘧啶核苷免疫化学法

5,6-二羟基二氢胸腺嘧啶离子交换法多种碱基损伤高效液相色谱法分析第04章遗传信息的复制（二）DNA单链断链和双链断链的主要检测1、单链断裂的检测方法1）碱性蔗糖梯度离心：

DNA在碱性介质中解螺旋，不同长度的DNA片段在蔗糖梯度离心时沉降速度不同。2）碱性洗脱：在一定孔径的微孔滤膜上用去垢剂使细胞溶破，DNA裸露，然后用碱性、中性缓冲液洗脱，断裂越多，洗脱越快。3）羟基磷石灰吸附

DNA吸附在羟基磷石灰柱上，用不同离子强度的PBS使单链DNA和双链DNA依次分开。第04章遗传信息的复制4）DNA解螺旋荧光测定溴乙啶嵌入DNA螺旋，产生一定程度的荧光，链断裂时解链程度不同，溴乙啶嵌入速度不同，荧光有差异。2、双链断裂1）中性蔗糖梯度密度离心在中性介质中操作，DNA不解螺旋，DNA片段以不同速度沉降。2）中性洗脱第04章遗传信息的复制（三）DNA交联的主要测定方法1、DNA蛋白质交联(DPC)的测定方法1）SDS-KCl沉淀利用DPC在SDS溶液和SDS-KCl溶液中的沉降行为不同。2）膜结合利用膜对DNA的特殊亲和性，将DPC分离。3）羟基磷灰石吸附双链DNA吸附在羟基磷灰石柱上，由于DPC形成，蛋白质也被挂在柱上，可进一步分离。第04章遗传信息的复制4）凝胶电泳利用高盐和尿素除去杂蛋白，然后进行凝胶电泳，结合蛋白酶处理。5）碱性洗脱

DPC形成时，微孔滤膜上DNA存留率下降。2、DNA-DNA链间交联（ISC）的检测第04章遗传信息的复制（四）嘧啶二聚体的检测方法1、纸层析法放射性同位素标记细胞DNA