原核生物的转录

关于原核生物的转录●基本概念；●原核生物转录起始、RNA聚合酶、启动子；转录的基本过程；●真核生物转录起始、RNA聚合酶、启动子；转录的基本过程；●真核生物转录后的加工；●原核生物与真核生物mRNA的特征比较；●RNA合成与DNA合成异同点；第2页,共62页，2024年2月25日，星期天第一节若干基本概念第3页,共62页，2024年2月25日，星期天

●

基因表达的第一步；●

以D.S.DNA中的一条单链作为转录的模板；●

在依赖DNA的RNA聚合酶的作用下进行的；●

模板单链DNA的极性方向为3’→5’,而非模板单链

DNA的极性方向与RNA链相同，均为5’→3’；(书写基因序列时，仅写非模板序列，可不注明极性方向)DNA3’---TACTCAT----5’RNA5’----AUGAGUA----3’5’---ATGAGTA----3’Non-template(sensestrand)template(antisensestrand)

●

按A

U，CG配对的原则，合成RNA分子；第4页,共62页，2024年2月25日，星期天●RNA的转录包括promotion,elongation,termination三过程

●从启动子（promoter）到终止子（terminator）称为

转录单位

（transcriptionalunit）

●转录原点记为+1，其上游记为负值，下游记为正值

●原核生物中的转录单位多为polycistroninoperon

真核生物中的转录单位多为monocistron,Nooperon+1-10+10upstreamstartpointdownstream

位于起始位点之前的序列称为转录单位的上游(Upstream)，起始位点之后(在转录序列之内)的序列被称为下游(Downstream)。第5页,共62页，2024年2月25日，星期天转录的不对称性：

在RNA的合成中，DNA的二条链中仅有一条链可作为转录的模板，称为转录的不对称性。编码链与模板链与mRNA序列相同的那条DNA链称为编码链；将另一条根据碱基互补原则指导mRNA合成的DNA链称为模板链。第6页,共62页，2024年2月25日，星期天模板链并非永远在同一条单链上转录方向5

3

3

5

模板链编码链编码链模板链转录方向第7页,共62页，2024年2月25日，星期天第二节原核生物的转录一、原核生物转录的分子基础；二、转录的起始，延伸；三、转录的终止；四、转录的抗终止。第8页,共62页，2024年2月25日，星期天一、原核生物转录的分子基础：（一）、RNA聚合酶：1、E.coli的聚合酶负责所有mRNA、rRNA和tRNA的合成。一个E.coli细胞中约有7000个RNA聚合酶分子。任意时刻大概有2000~5000RNA聚合酶在合成RNA；2、E.coli的全酶是一个质量约465kD的分子，由两个α、β、β’、ω亚基及一个σ因子所组成。其中，α、β、β’、ω亚基构成了核心酶，加上σ因子之后便构成了全酶。即：全酶=核心酶+σ因子第9页,共62页，2024年2月25日，星期天第10页,共62页，2024年2月25日，星期天（1）α亚基的功能：当噬菌体T4感染E.coli时，宿主α亚基被糖基化修饰。修饰导致了原来被全酶所识别的启动子亲和力下降，这就提示：3、各亚基的功能：α亚基在启动子识别中起作用。第11页,共62页，2024年2月25日，星期天α亚基的作用：

位于前端的α因子使双链解链为单链；

位于尾端的α因子使单链新聚合为双链。

核心酶的组建顺序：因子α+α→2α+β→+β’第12页,共62页，2024年2月25日，星期天（2）δ亚基：★重复使用(Reusable)★使Holo-enzyme识别启动子,并与模板链结合

★修饰RNApol构型，降低全酶与DNA的非特异性结合力增强全酶与启动子位点的特异性结合力RNA链合成达8~9个碱基时，σ因子释放，离开核心酶，由核心酶负责延伸。σ因子能够保证细菌RNA聚合酶稳定地结合到某个特异的、唯一的DNA启动子上。第13页,共62页，2024年2月25日，星期天例如：正常情况下负责大多数基因转录的是σ70

。但σ32和σE在环境变化（热激）时被表达。σ28用于正常生长时鞭毛基因的表达。

在大肠杆菌中，存在多种σ因子。不同的σ因子可以识别不同的启动子序列，从而可以启动不同基因的表达；第14页,共62页，2024年2月25日，星期天

大肠杆菌的热激应答基因的表达的调控是通过σ32实现的。温度升高时σ32数量增加，而温度恢复,σ32活性降低来完成诱导。

σ32合成的基本信号是温度增加导致未折叠蛋白质(部分变性蛋白质)在细胞内累积。

另一组热调控基因的表达是由σE

因子控制，它负责对比σ32更剧烈的温度变化应答。它是由热变性蛋白质的积聚所诱导的。

大肠杆菌细胞含有少量σ54

，当培养基中缺乏氮时被激活。在这些情况下，基因被开启以便利用可替代氮源。第15页,共62页，2024年2月25日，星期天β因子：★促进RNApol+NTP→RNAelongation；★完成NTP之间的磷酸脂键的连接；★与

Rho(ρ)因子竞争RNA3’-end。第16页,共62页，2024年2月25日，星期天β’

因子；★强碱性亚基★促使RNA聚合酶与

有义链（sensestrand）的结合

第17页,共62页，2024年2月25日，星期天总结：HoloEnzyme含有的功能位点

★sensestrandDNAbindingpoint(β’)★DNA/RNAhybridsite(β)★D.S.DNAunwindingpoint(α)★D.S.DNArewindingpoint(α)第18页,共62页，2024年2月25日，星期天原核生物RNApol(Core)的结构与功能EnzymeMovementDNAcodingstrand(β’)Rewindingpoint(α)Unwindingpoint(α)RNAbindingsiteRNA/DNAhybrid(β)DNAtemplatestrand10-17bp

第19页,共62页，2024年2月25日，星期天总结：大肠杆菌RNA聚合酶的组成分析亚基基因相对分子量亚基数组分功能αrpoA365002核心酶核心酶组装，启动子识别。解螺旋及重新螺旋βrpoB1510001核心酶β和β'共同形成RNA合成的活性中心β'rpoC1550001核心酶ω？110001核心酶？σrpoD700001σ因子存在多种σ因子，用于识别不同的启动子第20页,共62页，2024年2月25日，星期天RNA聚合酶与DNA聚合酶的区别RNA聚合酶DNA聚合酶大小(M)大，4.8×105dol小，1.09×105dol引物无有产物较短，游离较长，与模板以氢键相连作用方式一条链的某一段两条链同时进行外切酶活性无5’3’，3’5’校对合成能力无有修复能力无有第21页,共62页，2024年2月25日，星期天（二）、启动子1、启动子的发现方法：PromoterregionidentifiedbyDNAasemethod

RNApolymerase(noNTP)DNAsequencing

DNase

digestionDNA+dissolve第22页,共62页，2024年2月25日，星期天大肠杆菌RNA聚合酶全酶所识别的启动子区第23页,共62页，2024年2月25日，星期天

通过比较不同基因的启动子序列，发现细菌具有四个保守位点：起始位点、-10区、-35区以及-10和-35区之间间隔距离。2、原核生物启动子的特点：（1）、起始位点通常(>90%)都是嘌呤碱基。该碱基左右两侧的碱基通常是C（左侧），T（右侧），即：组成CAT序列。启动子定义：指能被RNA聚合酶全酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列。第24页,共62页，2024年2月25日，星期天（2）、在起始位点上游，在几乎所有的启动子中都可以发现一个6bp的区域。六聚物的中心通常靠近起始点上游的10bp。该区称为－10区。它的同源序列为TATAAT。

可被总结为如下形式：T(80)A(95)T(45)A(60)A(50)T(96)，其中，数字表示碱基出现最大频率的百分数。该区又称为PribnowBox。

-10序列中开始的高度保守的TA

和最后一个几乎完全保守的T

是最重要的碱基。第25页,共62页，2024年2月25日，星期天（3）、TTGACA区：大肠杆菌启动子中另外一个保守区是以起始位点上游-35bp为中心的，称-35区。其共有序列为TTGACA，各碱基出现的频率为：T(82)T(84)G(78)A(65)C(54)A(45)。其中括号数字表示该碱基出现的频率。该区又称为SextamaBox

。第26页,共62页，2024年2月25日，星期天（4）、在90%启动子中，-35和-10区之间的分隔距离在16到18bp

之间，其中最适距离为17bp，这个距离对于启动子启动基因表达效率是最佳的。个别例外的可以小于15

或者大于20bp。尽管间隔区的真实序列并不重要，但间隔距离大小可以保持两个区恰当的距离，从而使两个区适合于RNA聚合酶的几何结构，所以可以增加启动子的启动效率。第27页,共62页，2024年2月25日，星期天

原核生物启动子的结构：第28页,共62页，2024年2月25日，星期天典型启动子的结构-35-10转录起点TTGACA16-19bpTATAAT5-9bp第29页,共62页，2024年2月25日，星期天3、SextamaBox与PribnowBox的功能：（2）、-10区序列的突变不影响转录闭合复合体的形成，但是其向转录开放复合体的转变变慢。（1）、两个区功能的研究方法：利用碱基突变来验证序列功能。该结果表明，-10区序列组成了启动子的“解旋域”(Unwindingdomain)。第30页,共62页，2024年2月25日，星期天（3）、-35区序列的突变使转录闭合复合体的形成速度减慢，但并不抑制其转变为转录开放复合体。因此-35区序列的功能是为RNA聚合酶的识别提供信号，因此，可以将-35区序列看作是“识别域”(Recognitiondomain)。第31页,共62页，2024年2月25日，星期天（4）、

SextamaBox与PribnowBox间距17bp,

有利于RNApol启动17bp的间距较17bp的序列特异性对转录更为重要（5）、SextamaBoxorPribnowBoxmut.→

转录率下降100XSextamaBoxandPribnowBoxmut.→

转录率下降1000X第32页,共62页，2024年2月25日，星期天4、Promoter与δfactor间的作用●二者结合的专效性决定了某个启动子是strongpromoter还是weakpromoter第33页,共62页，2024年2月25日，星期天★与标准启动子序列同源性愈高

→启动强度愈大

与标准启动子序列同源性愈低→启动强度愈小

若与标准启动子序列差异很大→则由另一种δ因子启动E.coli;4δfactor→recognition4promotersBacillus;10δfactor→recognition10promoters第34页,共62页，2024年2月25日，星期天二、原核生物基因转录的起始过程：1、全酶结合到启动子序列上，形成一个闭合(Closed)的二元复合物而开始反应；2、与酶结合的一小段DNA序列的“溶解”导致了闭合复合体转变为开放(Open)复合体。对于强启动子来说，闭合复合体向开放二元复合物的转变是不可逆转的。（一）、转录的起始：第35页,共62页，2024年2月25日，星期天3、第三步是最开始的两个核苷酸之间的连接。在它们之间会形成一个磷酸二酯键，这样，所产生的三元复合物(Ternarycomplex)就包括RNA、DNA、聚合酶。4、当起始过程完成后，聚合酶释放出σ因子而转变为核心酶，后者和DNA、新生RNA组成延伸三元复合物。

接下来加入的前九个核苷酸，聚合酶是一直不移动的，产生一条短RNA链，直到九个碱基为止。九个碱基中的任何一个加入后，聚合酶都有释放RNA的可能性，导致流产起始(Abortiveinitiation)。但流产起始之后聚合酶又开始合成第一个碱基。流产起始常常产生一系列短的寡聚核苷酸(2~9个碱基)。第36页,共62页，2024年2月25日，星期天总结：转录的起始转录延伸之前，RNA聚合酶要经过数个步骤。闭合二元复合物转化为开放二元复合物，开放二元复合物再转化为三元复合物。第37页,共62页，2024年2月25日，星期天（二）、起始过程中的RNA聚合酶的形态变化：1、当RNA聚合酶全酶最初结合到DNA上时，它覆盖了从-55到+20大约75～80bp的长度。第38页,共62页，2024年2月25日，星期天2、伴随σ因子的失去，聚合酶与-55到-35

的结合也失去，仅剩下约60bp的DNA被聚合酶所覆盖。

这说明：启动子的上游部分仅参与RNA聚合酶的起始识别，起始以后便不再起作用。第39页,共62页，2024年2月25日，星期天3、当RNA链延伸到15～20

个碱基时，酶会发生进一步的形态变化，转变成负责转录延伸的复合体，仅覆盖30～40bp长度。第40页,共62页，2024年2月25日，星期天RNA聚合酶首先与-55到+20之间的区域接触，当σ因子解离下来后，核心酶与-30左右的序列结合。接着核心酶向前移动，结构逐渐致密并最终形成延伸复合物。总结：转录起始过程中复合物的变化象蠕虫一样移动第41页,共62页，2024年2月25日，星期天三、转录的延伸：σ因子释放后，进入链的延长阶段1、RNA合成在一个“转录泡(Bubble)”中进行，在转录泡中，DNA被瞬间分离成单链，其中一条被作为RNA合成的模板。当RNA聚合酶沿DNA移动时，空泡也随之移动。第42页,共62页，2024年2月25日，星期天RNA链的延伸3´5´RNA-DNA杂交螺旋聚合酶的移动方向新生RNA复链解链有义链模板链（反义链）延长部位DNA第43页,共62页，2024年2月25日，星期天RNA链的合成方向5′→3′

各种结果表明，RNA-DNA杂交区的长度在3~9

个碱基对之间。第44页,共62页，2024年2月25日，星期天所有核苷酸的合成都是从游离核苷酸的5¢-三磷酸基团与RNA链末端的3¢-OH之间的缩合反应。新加入核苷酸失去末端的两个磷酸基(γ和β)；其α磷酸基与RNA链形成磷酸二酯键。这个反应发生在催化位点。2、磷酸二酯键的形成：第45页,共62页，2024年2月25日，星期天37℃时反应速度约为每秒40个核苷酸(细菌RNA聚合酶)；这与翻译的速度(每秒15个氨基酸)大致相同，RNA聚合酶控制着下一个核苷酸的加入。该酶可能仅当一个核苷酸与模板形成氢键互补配对时才允许磷酸二酯键的形成。如果该核苷酸与模板不匹配，则将其去除，接着另一个核苷酸加入。3、延伸的速度：4、核苷酸加入的控制：第46页,共62页，2024年2月25日，星期天四、细菌RNA转录的终止：1、一旦RNA聚合酶开始转录，酶就沿模板向前移动合成RNA，直到遇到一个终止子(Terminator)，聚合酶停止向正在生长的RNA链添加核苷酸，释放合成的RNA产物，从DNA模板上解离。

终止子：是RNA聚合酶停止RNA转录的一段DNA序列。终止过程需要所有维持RNA-DNA杂交的氢键断裂，然后DNA重新形成双螺旋。第47页,共62页，2024年2月25日，星期天2、根据体外实验中RNA聚合酶是否需要辅助蛋白质参与终止，可将E.coli中的终止子分为两种类型：

在体外，没有任何其它因子参与，核心酶也能在某些位点终止转录，这些位点被称为“内源性终止子(Intrinsicterminator)”。“ρ因子依赖型终止子”：体外需要ρ因子的辅助；突变实验显示体内该因子参与了终止过程。第48页,共62页，2024年2月25日，星期天（1）、内源性终止子：A、终止子的结构特点：

内源性终止子有两个明显的结构特点：一个二级结构中的发夹结构和转录单位最末端的连续约6个U残基的区段。这两个特点都是终止所必需的。

发夹的基底部通常包含一个富含G:C区。发夹和U区段的典型距离为7~9个碱基。有时U区段可以插有其它碱基。第49页,共62页，2024年2月25日，星期天终止子内部包含能够形成7-20bp长度发夹结构区。茎环结构有富含尿嘧啶核苷酸的G-C区。内源性终止子的结构第50页,共62页，2024年2月25日，星期天B、内源性终止子终止的机理：

RNA聚合酶遇到发夹结构时，RNA转录产物合成速度会减慢(或者是暂停)；

正确位置的一段U残基是RNA聚合酶遇到发夹而暂停时从模板解离下来所必需的。

rU:dA(RNA-DNA杂交)是一个不常见的弱碱基配对结构，对它的破坏所需能量最少。当聚合酶暂停时，RNA-DNA杂交链从终止区的弱键rU:dA处解开。第51页,共62页，2024年2月25日，星期天

ρ-依赖型终止作用所需的序列长50~90个碱基，该区域的共同特征是RNA富含C残基而G残基很少。可以在新合成的RNA中形成松散的发卡结构。一个ρ-依赖型终止子的终止效率随“富C/少G”区域的长度而增加。A、终止子序列特征：（2）、ρ-依赖型终止子：第52页,共62页，2024年2月25日，星期天ρ因子是ρ基因编码的蛋白质，是一种酶，它具有ATPase的活性和解链酶的活性。6聚化的ρ因子在水解ATP的情况下，它沿着5′→3′方向转录物的3′端前进，直到遇到暂停在终止点位置的RNA聚合酶（因为该区有发卡结构，导致聚合酶的暂停）。随后ρ因子通过解链酶的活性解开转录泡（transcriptionbubble）上的RNA/DNA形成的杂交双螺旋，使RNA转录物得到释放，从而终止转录。

B、ρ因子终止机理：第53页,共62页，2024年2月25日，星期天B、依赖

因子的终止模型：

因子：六聚体蛋白、水解各种核甘三磷酸促使新生RNA链从三元转录复合物中解离出来，从而终止转录。第54页,共62页，2024年2月25日，星期天ρ因子沿着RNA追赶聚合酶，当聚