沙门氏菌的检测鉴定

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杨淑霞

设备和材料除微生物试验室常规灭菌及培育设备外，其他设备和材料如下：2.1冰箱：2℃~5℃。2.2恒温培育箱：36℃1℃,42℃1℃。2.3均质器。2.4振荡器。2.5电子天平：感量0.1g。2.6无菌锥形瓶:容量500mL,250mL。2.7无菌吸管：1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸头。2.8无菌培育皿：直径90mm。2.9无菌试管：3mm50mm、10mm75mm。2.10无菌毛细管。2.11pH计或pH比色管或精密pH试纸。2.12全自动微生物生化鉴定系统。

3培育基和试剂3.1缓冲蛋白胨水(BPW)。3.2四硫磺酸钠煌绿(TTB)增菌液。3.3亚硒酸盐胱氨酸(SC)增菌液。3.4亚硫酸铋(BS)琼脂。3.5HE琼脂：见附录A中A.5。3.6木糖赖氨酸脱氧胆盐(*LD)琼脂。3.7沙门氏菌属显色培育基。3.8三糖铁(TSI)琼脂。3.9蛋白胨水、靛基质试剂。3.10尿素琼脂(pH7.2)。3.11氰化钾(KCN)培育基。3.12赖氨酸脱羧酶试验培育基。3.13糖发酵管。3.14邻硝基酚β-D半乳糖苷(ONPG)培育基。3.15半固体琼脂。3.16丙二酸钠培育基。3.17沙门氏菌O和H诊断血清。3.18生化鉴定试剂盒。

A.1缓冲蛋白胨水(BPW)A.1.1成分蛋白胨10.0g氯化钠5.0g磷酸氢二钠(含12个结晶水)9.0g磷酸二氢钾1.5g蒸馏水1000mLpH7.20.2A.1.2制法将各成分加入蒸馏水中，搅混匀称，静置约10min,煮沸溶解，调整pH,高压灭菌121℃,15min。

A.2四硫磺酸钠煌绿(TTB)增菌液A.2.1基础液蛋白胨10.0g、牛肉膏5.0g、氯化钠3.0g、碳酸钙45.0g、蒸馏水1000mL、pH7.00.2除碳酸钙外，将各成分加入蒸馏水中，煮沸溶解，再加入碳酸钙，调整pH,高压灭菌121℃,20min。A.2.2硫代硫酸钠溶液硫代硫酸钠(含5个结晶水)50.0g,馏水加至100mL,高压灭菌121℃,20min。A.2.3碘溶液碘片20.0g、碘化钾25.0g、蒸馏水加至100mL,将碘化钾充分溶解于少量的蒸馏水中，再投入碘片，振摇玻瓶至碘片全部溶解为止，然后加蒸馏水至规定的总量，贮存于棕色瓶内，塞紧瓶盖备用。A.2.40.5%煌绿水溶液煌绿0.5g、蒸馏水100mL溶解后，存放暗处，不少于1d,使其自然灭菌。A.2.5牛胆盐溶液牛胆盐10.0g,蒸馏水100mL加热煮沸至完全溶解，高压灭菌121℃,20min。A.2.6制法基础液900mL、硫代硫酸钠溶液100mL、碘溶液20.0mL、煌绿水溶液2.0mL牛胆盐溶液50.0mL临用前，按上列顺次，以无菌操作依次加入基础液中，每加入一种成分，均应摇匀后再加入另一种成分。

A.3亚硒酸盐胱氨酸(SC

)增菌液A.3.1成分蛋白胨5.0g乳糖4.0g磷酸氢二钠10.0g亚硒酸氢钠4.0gL-胱氨酸0.01g蒸馏水1000mLpH7.00.2A.3.2制法除亚硒酸氢钠和L-胱氨酸外，将各成分加入蒸馏水中，煮沸溶解，冷至55℃以下，以无菌操作加入亚硒酸氢钠和1g/LL-胱氨酸溶液10mL(称取0.1gL-胱氨酸，加1mol/L氢氧化钠溶液15mL,使溶解，再加无菌蒸馏水至100mL即成，如为DL胱氨酸，用量应加倍)。摇匀，调整pH。

A.4亚硫酸铋(BS)琼脂A.4.1成分蛋白胨10.0g牛肉膏5.0g葡萄糖5.0g硫酸亚铁0.3g磷酸氢二钠4.0g煌绿0.025g或5.0g/L水溶液5.0mL柠檬酸铋铵2.0g亚硫酸钠6.0g琼脂18.0g~20g蒸馏水1000mLpH7.50.2注：本培育基不需要高压灭菌，在制备过程中不宜过分加热，避开降低其选择性，贮于室温暗处，超过48h会降低其选择性，本培育基宜于当天制备，第二天运用。

A.4.2制法将前三种成分加入300mL蒸馏水(制作基础液),硫酸亚铁和磷酸氢二钠分别加入20mL和30mL蒸馏水中，柠檬酸铋铵和亚硫酸钠分别加入另一20mL和30mL蒸馏水中，琼脂加入600mL蒸馏水中。然后分别搅拌匀称，煮沸溶解。冷至80℃左右时，先将硫酸亚铁和磷酸氢二钠混匀，倒入基础液中，混匀。将柠檬酸铋铵和亚硫酸钠混匀，倒入基础液中，再混匀。调整pH,随即倾入琼脂液中，混合匀称，冷至50℃~55℃。加入煌绿溶液，充分混匀后马上倾注平皿。

注：本培育基不需要高压灭菌，在制备过程中不宜过分加热，避开降低其选择性，贮于室温暗处，超过48h会降低其选择性，本培育基宜于当天制备，第二天运用。

A.5HE琼脂(HektoenEntericAgar)A.5.1成分蛋白胨12.0g牛肉膏3.0g乳糖12.0g蔗糖12.0g水杨素2.0g胆盐20.0g氯化钠5.0g琼脂18.0g~20.0g蒸馏水1000mL0.4%溴麝香草酚蓝溶液16.0mLAndrade指示剂20.0mL甲液20.0mL乙液20.0mLpH7.50.2

A.5.2制法将前面七种成分溶解于400mL蒸馏水内作为基础液;将琼脂加入于600mL蒸馏水内。然后分别搅拌匀称，煮沸溶解。加入甲液和乙液于基础液内,调整pH。再加入指示剂,并与琼脂液合并,待冷至50℃~55℃倾注平皿。注:①本培育基不需要高压灭菌，在制备过程中不宜过分加热，避开降低其选择性。②甲液的配制硫代硫酸钠34.0g柠檬酸铁铵4.0g蒸馏水100mL③乙液的配制去氧胆酸钠10.0g蒸馏水100mL④Andrade指示剂酸性复红0.5g1mol/L氢氧化钠溶液16.0mL蒸馏水100mL将复红溶解于蒸馏水中,加入氢氧化钠溶液。数小时后如复红褪色不全,再加氢氧化钠溶液1mL~2mL。

6、木糖赖氨酸脱氧胆盐(*LD)琼脂A.6.1成分酵母膏3.0gL-赖氨酸5.0g木糖3.75g乳糖7.5g蔗

糖7.5g去氧胆酸钠2.5g柠檬酸铁铵0.8g硫代硫酸钠6.8g氯化钠5.0g琼脂15.0g酚红0.08g蒸馏水1000mLpH7.40.2A.6.2制法除酚红和琼脂外，将其他成分加入400mL蒸馏水中，煮沸溶解，调整pH。另将琼脂加入600mL蒸馏水中，煮沸溶解。将上述两溶液混合匀称后，再加入指示剂，待冷至50℃~55℃倾注平皿。注:本培育基不需要高压灭菌，在制备过程中不宜过分加热，避开降低其选择性，贮于室温暗处。本培育基宜于当天制备，第二天运用。

A.7三糖铁(TSI)琼脂A.7.1成分蛋白胨20.0g牛肉膏5.0g乳糖10.0g蔗糖10.0g葡萄糖1.0g硫酸亚铁铵(含6个结晶水)0.2g酚红0.025g或5.0g/L溶液5.0mL氯化钠5.0g硫代硫酸钠0.2g琼脂12.0g蒸馏水1000mLpH7.40.2A.7.2制法除酚红和琼脂外，将其他成分加入400mL蒸馏水中，煮沸溶解，调整pH。另将琼脂加入600mL蒸馏水中，煮沸溶解。将上述两溶液混合匀称后，再加入指示剂，混匀，分装试管，每管约2mL~4mL,高压灭菌121℃10min或115℃15min,灭菌后置成高层斜面，呈桔红色。

A.8蛋白胨水、靛基质试剂A.8.1蛋白胨水蛋白胨(或胰蛋白胨)20.0g氯化钠5.0g蒸馏水1000mLpH7.40.2将上述成分加入蒸馏水中，煮沸溶解，调整pH,分装小试管,121℃高压灭菌15min。A.8.2靛基质试剂A.8.2.1柯凡克试剂：将5g对二甲氨基甲醛溶解于75mL戊醇中,然后缓慢加入浓盐酸25mL。A.8.2.2欧-波试剂：将1g对二甲氨基苯甲醛溶解于95mL95%乙醇内。然后缓慢加入浓盐酸20mL。A.8.3试验方法

挑取小量培育物接种,在36℃1℃培育1d~2d,须要时可培育4d~5d。加入柯凡克试剂约0.5mL,轻摇试管,阳性者于试剂层呈深红色；或加入欧波试剂约0.5mL,沿管壁流下，掩盖于培育液表面,阳性者于液面接触处呈玫瑰红色。注：蛋白胨中应含有丰富的色氯酸。每批蛋白胨买来后，应先用已知菌种鉴定后方可运用。

9尿素琼脂(pH7.2)A.9.1成分蛋白胨1.0g氯化钠5.0g葡萄糖1.0g磷酸二氢钾2.0g0.4%酚红3.0mL琼脂20.0g蒸馏水1000mL20%尿素溶液100mLpH7.20.2A.9.2制法除尿素、琼脂和酚红外，将其他成分加入400mL蒸馏水中，煮沸溶解，调整pH。另将琼脂加入600mL蒸馏水中，煮沸溶解。将上述两溶液混合匀称后，再加入指示剂后分装，121℃高压灭菌15min。冷至50℃~55℃,加入经除菌过滤的尿素溶液。尿素的最终浓度为2%。分装于无菌试管内，放成斜面备用。A.9.3试验方法挑取琼脂培育物接种,在36℃1℃培育24h,观测结果。尿素酶阳性者由于产碱而使培育基变为红色。

.10氰化钾(KCN)培育基A.10.1成分蛋白胨10.0g氯化钠5.0g磷酸二

氢钾0.225g磷酸氢二钠5.64g蒸馏水1000mL0.5%氰化钾20.0mLA.10.2制法将除氰化钾以外的成分加入蒸馏水中，煮沸溶解，分装后121℃高压灭菌15min。放在冰箱内使其充分冷却。每100mL培育基加入0.5%氰化钾溶液2.0mL(最末浓度为1:10000),分装于无菌试管内,每管约4mL,立即用无菌橡皮塞塞紧,放在4℃冰箱内,至少可保存两个月。同时，将不加氰化钾的培育基作为对比培育基,分装试管备用。A.10.3试验方法将琼脂培育物接种于蛋白胨水内成为稀释菌液，挑取1环接种于氰化钾(KCN)培育基。并另挑取1环接种于对比培育基。在36℃1℃培育1d~2d,观测结果。如有细菌生长即为阳性(不抑制),经2d细菌不生长为阴性(抑制)。注:氰化钾是剧毒药,运用时应当心，切勿沾染，以免中毒。夏天分装培育基应在冰箱内进行。试验失败的主要缘由是封口不严,氰化钾渐渐分解，产生氢氰酸气体逸出，以致药物浓度降低，细菌生长，因而造成假阳性反应。试验时对每一环节都要特别留意。

A.11赖氨酸脱羧酶试验培育基A.11.1成分蛋白胨5.0g酵母浸膏3.0g葡萄糖1.0g蒸馏水1000mL1.6%溴甲酚紫-乙醇溶液1.0mLL-赖氨酸或DL-赖氨酸0.5g/100mL或1.0g/100mLpH6.80.2A.11.2制法除赖氨酸以外的成分加热溶解后,分装每瓶100mL,分别加入赖氨酸。L-赖氨酸按0.5%加入，DL-赖氨酸按1%加入。调整pH。对比培育基不加赖氨酸。分装于无菌的小试管内，每管0.5mL,上面滴加一层液体石蜡，115℃高压灭菌10min。

A.11.3试验方法从琼脂斜面上挑取培育物接种，于36℃1℃培育18h~24h,观测结果。氨基酸脱羧酶阳性者由于产碱，培育基应呈紫色。阴性者无碱性产物，但因葡萄糖产酸而使培养基变为黄色。对比管应为黄色。

A.12糖发酵管A.12.1成分牛肉膏5.0g蛋白胨10.0g氯化钠3.0g磷酸氢二钠(含12个结晶水)2.0g0.2%溴麝香草酚蓝溶液12.0mL蒸馏水1000mLpH7.40.2A.12.2制法A.12.2.1葡萄糖发酵管按上述成安排好后，调整pH。按0.5%加入葡萄糖，分装于有一个倒置小管的小试管内，121℃高压灭菌15min。A.12.2.2其他各种糖发酵管可按上述成安排好后,分装每瓶100mL,121℃高压灭菌15min。另将各种糖类分别配好10%溶液，同时高压灭菌。将5mL糖溶液加入于100mL培育基内，以无菌操作分装小试管。注：蔗糖不纯,加热后会自行水解者，应采纳过滤法除菌。A.12.3试验方法:从琼脂斜面上挑取小量培育物接种，于36℃1℃培育,一般2d~3d。迟缓反应需观测14d~30d。

A.13ONPG培育基A.13.1成分

邻硝基酚β-D半乳糖苷(ONPG)(O-Nitrophenyl-β-D-galactopyranoside)60.0mg0.01mol/L磷酸钠缓

冲液(pH7.5)10.0mL1%蛋白胨水(pH7.5)30.0mLA.13.2制法将ONPG溶于缓冲液内，加入蛋白胨水，以过滤法除菌，分装于无菌的小试管内，每管0.5mL,用橡皮塞塞紧。A.13.3试验方法自琼脂斜面上挑取培育物1满环接种于36℃1℃培育1h~3h和24h观测结果。假如β半乳糖苷酶产生，那么于1h~3h变黄色，如无此酶那么24h不变色。

A.14半固体琼脂A.14.1成分牛肉膏0.3g蛋白胨1.0g氯化钠0.5g琼脂0.35g~0.4g蒸馏水100mLpH7.40.2A.14.2制法按以上成安排好,煮沸溶解,调整pH。分装小试管。121℃高压灭菌15min。直立凝固备用。注:供动力观测、菌种保存、H抗原位相变异试验等用。

A.15丙二酸钠培育基