【生物】重组DNA技术的基本工具课件-2023-2024学年高二下人教版选择性必修三

1980年世界上第一个转基因动物问世超级小鼠：转入大鼠的生长激素基因，使小鼠体重为正常个体的二倍。中国抗虫棉之父郭三堆普通棉花转基因抗虫棉棉铃虫抗虫棉花核心技术于1995年申请国家发明专利，1998年正式授权，2001年该专利被国际知识产权组织及国家知识产权局授予发明专利金奖。它标志着我国成为继美国之后，世界上独立自主研制成功抗虫棉的第二个国家。

按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程操作水平：DNA分子水平转基因技术、DNA重组技术、基因拼接技术

原理：基因重组克服远缘杂交不亲和障碍、定向改造生物性状普通棉花苏云金芽孢杆菌Bt抗虫蛋白基因普通棉花细胞DNA含Bt抗虫蛋白基因棉花抗虫棉基因工程的可行性所有细胞生物遗传物质都是DNA，且DNA分子在结构上具有统一性，保证了目的基因可插入受体细胞的DNA中所有的生物共用同一套密码子，保证目的基因能在受体细胞中表达出相同蛋白

优点：基因工程转基因技术、DNA重组技术、基因拼接技术“分子手术刀”“分子缝合针”“分子运输车”切割DNA分子连接DNA片段将重组DNA导入受体细胞选择性必修三第3章第1节

重组DNA技术的基本工具CT制作自学时间P71Thequestion：Q3：“分子手术刀”的作用位点？Q2：“分子手术刀”的来源？Q1：“分子手术刀”是什么？Q4：“分子手术刀”的类型有哪些？一“分子手术刀”限制性内切核酸酶限制酶2.作用位点：切断特定部位的磷酸二酯键1.主要来源：原核生物目前分离出数千种磷酸二酯键2.作用位点：切断特定部位的磷酸二酯键识别序列

长度一般为4-8个或其他数量的脱氧核苷酸，最常见的为6个核苷酸。3.种类EcoRⅠ限制酶G

AA

TT

CC

TT

AA

GSmaⅠ限制酶E口Rone斯马oneC

CC

GG

GGGG

CC

C回文序列：正反读一样限制酶的命名

EcoRⅠ属名Escherichia首字母种名coli前两个字母R型菌株从中分离的第一个限制酶流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)d株中先后分离到3种限制酶，则分别命名为:HindIHindIIHindIII

粘质沙雷氏杆菌(Serratiamarcesens)中分离的第一种限制酶为Sma

ⅠEcoRⅠ限制酶G

AA

TT

CC

TT

AA

GGC

TT

AA

AA

TT

C

G识别GAATTC序列，并在G和A之间磷酸二酯键切开粘性末端：-G-CTTAAAATTGCCTTAAG磷酸二酯键磷酸二酯键切断几个磷酸二酯键?SmaⅠ限制酶识别CCCGGG序列，并在C和G之间磷酸二酯键切开平末端：-CCC-GGG磷酸二酯键磷酸二酯键C

CC

GG

GGGG

CC

CGGGC

CCCC

C

GGG

要想获得某个目的基因需要几个识别位点，要用限制酶必须切断几个磷酸二酯键？产生几个粘性末端？GAATTCGAATTCCTTAAGCTTAAGAATTCGGCTTAA目的基因目的基因目的基因两侧各具备一个或多个限制酶的切割位点GAATTCGAATTCCTTAAGCTTAAGAATTCGGCTTAA目的基因目的基因CCCGGGGAATTCGGGCCCCTTAAGGGGGCCCCTTAA目的基因目的基因目的基因两侧各具备一个或多个限制酶的切割位点，但每种酶的切点最好只有一个，否则获得的目的基因会出现自我环化。提示：如图写出下列限制酶切割形成的黏性末端BamHⅠ________EcoRⅠ________HindⅢ________BglⅡ________不同的限制酶切割可能形成相同的黏性末端。下图甲是一个DNA片段，箭头处代表不同限制酶的切点，据图回答：（1）用EcoRⅠ酶切，能得到

种DNA片段；（2）用PstⅠ完全酶切，能得到

种DNA片段；（3）同时用SmaⅠ和PstⅠ完全酶切，能得到

种DNA片段；（4）只用PstⅠ酶切，最多能得到

种DNA片段。2355

要想获得某个目的基因选择怎样的限制酶？最终会形成多少个DNA片段？

现有一长度为1000碱基对(bp）的DNA分子，用限制性核酸内切酶EcoR1酶切后得到的DNA分子仍是1000bp，用Kpn1单独酶切得到400bp和600bp两种长度的DNA分子，用EcoRI、Kpnl同时酶切后得到200bp和600bp两种长度的DNA分子。该DNA分子的酶切图谱正确的是

请判断：以下黏性末端是由

种限制酶作用产生的。3①②③结论：不同的限制酶可能切割形成相同的黏性末端细菌等原核生物容易受到自然界外源DNA（如噬菌体）的入侵。所以它在长期的进化过程中形成了套完善的防御机制。这类原核生物之所以长期进化而不灭绝，限制酶就是它的一种防御性工具。当外源DNA入侵时，它会利用限制酶来切割外源DNA，使之失效，以保证自身的安全。思考：根据所掌握的知识，推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么？思考：为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？细菌自身的DNA没有限制酶识别的特定序列或者识别序列被修饰（甲基化），所以不会限制酶切割自身的DNA。自学时间P72Thequestion：Q1：“分子缝合针”是什么？Q2：“分子缝合针”的类型有哪些，它们发挥作用有何区别？Theanswer：GC

TT

AA

AA

TT

C

G目的基因G

C

TT

AA

AA

TT

C

G目的基因二“分子缝合针”DNA连接酶DNA连接酶磷酸二酯键GC

TT

AA

AA

TT

C

GG

C

TT

AA

AA

TT

C

G目的基因1、功能：通过形成磷酸二酯键将不同DNA分子的相同末端进行连接氢键自动恢复Theanswer：二“分子缝合针”DNA连接酶2、种类Theanswer：二“分子缝合针”DNA连接酶E·coliDNA连接酶

T4DNA连接酶E考里（来源大肠杆菌，连接粘性末端）

（来源T4噬菌体，连接粘性末端和平末端效率低）GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGGCTTAAAATTCGEcoRⅠ限制酶E·coliDNA连接酶或

T4DNA连接酶DNA连接酶不识别碱基序列，只与末端类型有关CCCGGGGGGCCCCCCGGGGGGCCCCCCGGGGGGCCCCCCGGGGGGCCCCCCGGGGGGCCCSmaⅠ限制酶

T4DNA连接酶有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶SpeⅠ进行切割，B片段分别用限制酶HindⅢ、XbaⅠ、EcoRⅤ和XhoⅠ进行切割，各限制酶的识别序列和切割位点如下：哪种限制酶切割B片段产生的DNA片段能与限制酶SpeⅠ切割的A片段产生的DNA片段相连接，为什么？XbaⅠ因为XbaⅠ与SpeⅠ切割产生了相同的黏性末端（可互补）结论：不同的限制酶可能切割形成相同的黏性末端名称作用部位作用底物作用结果限制酶DNA连接酶DNA聚合酶DNA(水解)酶解旋酶归纳总结——与DNA相关的五种酶的比较DNA磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键碱基对之间的氢键将双链DNA切成两个或多个片段将两个DNA片段连接为一个DNA分子将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸将双链DNA分子局部解旋为单链DNADNA片段脱氧核苷酸磷酸二酯键DNA自学时间P72Thequestion：Q1：“分子运输车”是什么？Q2：作为“分子运输车”具有哪些条件？Theanswer：三“分子运输车”载体种类受体细胞不同点质粒、噬菌体植物病毒动物病毒细菌细胞植物细胞动物细胞来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小也有很大差别大肠杆菌拟核质粒质粒环状DNATheanswer：三“分子运输车”载体目的基因插入位点一个和多个限制酶切割位点复制原点在受体细胞中自我复制或整合到染色体DNA中随受体DNA同步复制标记基因便于重组DNA分子的筛选抗性基因：四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因目的基因重组DNA分子载体“拼接”受体细胞导入EcoRⅠ限制酶CCCGGGGAATTCGGGCCCCTTAAGGGGGCCCCTTAA目的基因SmaⅠ限制酶CTTAAGAAGTTC质粒GGGccccccGGGCCCGGAAGTTCGEcoRⅠ限制酶SmaⅠ限制酶GGGGCCCCTTAA目的基因CCCGGAAGTTCGCCCGGGAAGTTCGCGAACCTT重组质粒GGC①正向连接②正向连接③反向连接多个限制酶切位点：防止目的基因、质粒的自身环化或目的基因与质粒反向连接GGGGCCCCTTAA目的基因CCCGGAAGTTCG质粒CCCGGGAAGTTCGCGAACCTT重组质粒GGC

质粒的自身环化

由于用同种限制酶切割，会产生相同黏性末端，则可能导致目的基因、质粒的自身环化以及目的基因与质粒反向连接。图甲是含有目的基因的外源DNA片段，图乙是用于将目的基因导入受体细胞的质粒（阴影部分表示抗生素抗性基因），相关限制酶的作用部位如图所示，现欲培养转基因抗病植株，回答下列问题。1.上述操作中不宜选用SmaI，原因是SmaI会破坏

和

。2.在基因工程的操作中，不宜只选用EcoRI，原因是用EcoRI切割外源DNA片段后，

。目的基因抗性基因目的基因只有一侧含有黏性末端，不能插入到质粒中标记基因便于重组DNA分子的筛选CT制作1、结构单位：脱氧核糖核甘酸OPOH磷酸H3PO3OHO碱基CH2CCCCOHHHHOHH脱氧核糖G鸟嘌呤含氮T胸腺嘧啶A腺嘌呤C胞嘧啶Review：DNA脱氧核糖核酸1’2’3’4’5’腺嘌呤脱氧核苷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸胞嘧啶脱氧核苷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸2、脱氧核苷酸的种类AGCTRe