NSE单抗的制备及双抗夹心ELISA检测方法的建立的开题报告

NSE单抗的制备及双抗夹心ELISA检测方法的建立的开题报告一、选题背景及意义NSE（neuron-specificenolase，神经元特异抗原酶）是一种神经元特异性糖酵解酶，其主要存在于神经系统的神经元、神经胶质细胞和神经内分泌系统的细胞以及部分末梢组织中。近年来的研究表明，血清中NSE的变化与许多神经系统疾病、肿瘤和脑损伤有关。因此，NSE的检测已成为诊断和预后评估这些疾病的重要指标。目前对于NSE的检测方法主要分为免疫学方法和生物化学方法。其中，免疫学方法具有高度的特异性和灵敏性，已成为NSE检测的主要方法之一。而ELISA作为一种灵敏度和特异性都较高的免疫学检测方法，已被广泛应用于NSE的检测。双抗夹心ELISA作为一种常见的ELISA方法，其具有灵敏度高、操作简便、重复性好等特点，因此也被广泛应用于NSE的检测。二、研究目的和内容本研究旨在建立NSE单抗的制备方法和双抗夹心ELISA检测方法，以提高NSE检测的灵敏度和特异性，并为临床NSE检测提供一定的帮助。本研究的具体内容包括：1.NSE单抗的制备：通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将NSE纯化，然后制备出与其特异结合的单克隆抗体；2.NSE与单抗的偶联反应和双抗夹心ELISA的建立：通过对不同浓度的NSE和单抗进行配对偶联反应，建立出双抗夹心ELISA检测方法；3.比较分析：比较本研究所建立的双抗夹心ELISA检测方法和传统ELISA检测方法在NSE检测方面的差异。三、研究意义1.建立NSE单抗的制备方法和双抗夹心ELISA检测方法，可以提高NSE检测的灵敏度和特异性，提高临床NSE检测的准确性和可靠性；2.本研究所建立的双抗夹心ELISA检测方法具有操作简便、重复性好等特点，不仅可以应用于临床NSE的检测，还可为其他蛋白质的检测提供一定的参考。四、研究方法1.制备NSE单抗：（1）用75%乙醇消毒小鼠尾静脉，麻醉后采集血液。（2）离心采集的血液，贯通卡内可以对血液作防蓝实验的对照孔，移植瘤细胞和CD4+细胞。（3）制备包被抗原（NSE）：用纯化的NSE制备出包被抗原。（4）腹腔注射BALB/c小鼠。（5）脾脏分离及维持。（6）纯化和固定小鼠B细胞。（7）小鼠B细胞与包被抗原的混合，产生杂交瘤，选出与NSE特异性结合的单克隆抗体。2.双抗夹心ELISA检测方法建立：（1）将罐盖上写有A、B等字母的孔板卡放在移液器上。（2）先用三个开口在中间缝纫机穿孔工具制成的三个不同直径圆片的滤纸吸光度计95μl的酶标试剂（Tween-20,Na2HPO4,H3PO4,NaCl,BSA和酶标抗体）加入相应孔中进行孵育1小时。（3）在洗涤盘上加入洗涤液，将孔板中酶标试剂溶液排出，利用洗涤液进行洗涤操作。（4）将样品（50μl）和89%Tween-20的洗涤液（50μl）混合，加入到孔中，孵育1小时后排出，利用洗涤液进行洗涤操作。（5）加入与酶标抗体结合的与酶标试剂相同的多价抗体（100μl），孵育1小时后排出，利用洗涤液进行洗涤操作。（6）向每孔加入底物B（50μl），孵育（20-30分钟）放置5-10分钟后，加入中止液（50μl）。（7）使用光谱计读取酶标板中的吸光度数据，计算出每个样品中NSE的浓度。五、研究时间安排